Edecio Cunha Neto.

A Imunologia perpassa todas as especialidades médicas. O Instituto de Investigação em Imunologia (INCT_iii), criado em 2001 como um dos 15 Institutos do Milênio e vigente desde então, tem como missão avançar a pesquisa de excelência em Imunologia e sua tradução para a clínica, objetivando posicionar a Imunologia Clínica brasileira em um nível internacional. O INCT_iii desenvolve estudos na fronteira do conhecimento das diversas áreas temáticas, como vacinas inovadoras e anticorpos monoclonais humanos, doenças infecciosas e negligenciadas, alergias, transplantes, câncer e erros inatos da imunidade, que afetam milhões de pessoas no Brasil e no mundo. A colaboração multidisciplinar e a complementariedade entre os pesquisadores do iii nas plataformas tecnológicas e eixos conceituais é fundamental para a inovação. As colaborações internacionais e a inclusão de jovens pesquisadores ex-alunos do iii proporcionam visões renovadas da ciência e novas abordagens tecnológicas. A gestão do iii catalisa o ciclo de descoberta, desenvolvimento de imunobiológicos e ensaios clínicos, e a transferência de tecnologia para empresas privadas. Entre as iniciativas de destaque, o iii desenvolveu vacinas patenteadas contra o HIV e o Streptococcus pyogenes, anticorpos monoclonais anti-toxina tetânica e soro anti-veneno de abelha. Na proposta atual, estudos em fisiopatologia têm identificado novos alvos terapêuticos, levando à proposição de vacinas inovadoras e terapias avançadas para doenças infecciosas, alergia, câncer, e erros inatos da imunidade. Esse modelo de pesquisa contribui para a medicina de precisão e a inovação no atendimento à saúde, reforçando a posição do iii como líder em pesquisa imunológica de impacto nacional e global. Além disso, instituições como o iii têm um papel crucial no letramento em Ciência e no combate a fake News na área de Saúde e vacinas para a população geral. Para tal, o iii já possui e pretende ampliar canais de comunicação com a sociedade em geral.

As vacinas disponíveis para o SARS-CoV-2, todas injetáveis, protegem contra formas graves daCOVID-19, sem afetar a carga viral na mucosa nasal e a transmissão. O diferencial da presenteproposta da vacina nasal baseada em nanopartículas Multicovax é a indução em modelos préclínicosde uma resposta imune sistêmica e local na mucosa nasal e orofaringe contra o vírus.Além de proteger 100 contra mortalidade e pneumonia, ela reduziu drasticamente a carga viralna orofaringe em animais desafiados com SARS-CoV-2, o que reduz a transmissão comunitária,contribuindo para o controle da pandemia de COVID-19. A Multicovax também funciona comoreforço para vacinas injetáveis prévias contra o SARS-CoV-2. O protótipo vacinal incluinanopartícula de sílica, proteína RBD recombinante e peptídeos sintéticos do SARS-CoV-2,adjuvante, e agente mucopenetrante. Propomos aqui a formulação da vacina Multicovax,finalização do estudo pré-clínico de toxicidade em roedores e primatas, e o ensaio clínico de faseI/II em humanos.

Na última década, avanços na área da microscopia automatizada revelaram novas possibilidades de ensaios funcionais, permitindo a análise de um amplo espectro de alterações fenotípicas a nível celular. A triagem de alto conteúdo (High Content Screening - HCS) é uma abordagem à biologia celular que combina imagens de fluorescência multicoloridas de forma automatizadas e análise de dados de forma quantitativa em um formato de alto rendimento adequado para aplicações em larga escala. O HCS permite a avaliação de diversos parâmetros relacionados ao fenótipo celular, tais como aspectos morfológicos e referentes a presença/localização de proteínas de interesse, a partir da aquisição de imagens em células marcadas com reagentes fluorescentes específicos (anticorpos ou corantes) a compartimentos celulares, proteínas de interesse e ácidos nucleicos. Existe uma complexidade tecnológica, técnica e científica para a utilização do HCS de forma adequada a se obterem resultados robustos e reprodutivos, que exigem um ambiente multidisciplinar e altamente capacitado. Através desta proposta, buscamos viabilizar uma plataforma de HCS de última geração, dentro de uma instituição com grupos científicos renomados internacionalmente. Este projeto visa detalhar os aspectos teóricos e práticos que justifiquem a obtenção do EMU proposto e seu impacto na ciência do Estado de São Paulo e no Brasil. (AU)

Na última década, avanços na área da microscopia automatizada revelaram novas possibilidades de ensaios funcionais, permitindo a análise de um amplo espectro de alterações fenotípicas a nível celular. A triagem de alto conteúdo (High Content Screening - HCS) é uma abordagem à biologia celular que combina imagens de fluorescência multicoloridas de forma automatizadas e análise de dados de forma quantitativa em um formato de alto rendimento adequado para aplicações em larga escala. O HCS permite a avaliação de diversos parâmetros relacionados ao fenótipo celular, tais como aspectos morfológicos e referentes a presença/localização de proteínas de interesse, a partir da aquisição de imagens em células marcadas com reagentes fluorescentes específicos (anticorpos ou corantes) a compartimentos celulares, proteínas de interesse e ácidos nucleicos. Existe uma complexidade tecnológica, técnica e científica para a utilização do HCS de forma adequada a se obterem resultados robustos e reprodutivos, que exigem um ambiente multidisciplinar e altamente capacitado. Através desta proposta, buscamos viabilizar uma plataforma de HCS de última geração, dentro de uma instituição com grupos científicos renomados internacionalmente. Este projeto visa detalhar os aspectos teóricos e práticos que justifiquem a obtenção do EMU proposto e seu impacto na ciência do Estado de São Paulo e no Brasil. (AU)

Our goal is to combat cardiomyopathies by establishing defective autophagy as a patho-mechanism for targeting it to develop therapy. Autophagy ensures cell survival by removing undesirable cellular materials whereas its malfunction causes cell death and tissue degeneration, contributing to the pathogenesis of cardiac diseases. We will utilize human pluripotent stem cells to generate cardiomyocytes (cardiac muscle cells) for disease modelling and drug testing to elucidate the biomedical implications of autophagy in cardiomyopathies like Chagas disease that affects 7 million globallyand is prevalent in South America. Future directions involve clinical translation and generalisability to other cardiomyopathies associated with autophagy dysfunction.

Apesar do sucesso dos programas de combate à transmissão vetorial domiciliar e do controle da transmissão transfusional, a doença de Chagas persiste como importante agravo acometendo cerca de 1,2 milhões de brasileiros. Ainda que a maioria das pessoas portadoras crônicos da doença de Chagas apresentem-se na forma indeterminada assintomática, cerca de 30 a 40 apresentam a forma cardíaca ou irão evoluir da forma indeterminada para a forma cardíaca. A forma cardíaca possui alta morbimortalidade, seja por insuficiência cardíaca, morte súbita ou eventos embólicos. Porém, ainda hoje não se sabe qual o mecanismo exato que governa a progressão da forma indeterminada para a forma cardíaca ou a ocorrência dos eventos cardiovasculares da forma cardíaca. Atualmente, considera-se que exista um balanço entre agressão do parasita e resposta do hospedeiro com estímulos inflamatórios e anti-inflamatórios e que o desbalanço entre estes estímulos favoreça a progressão da forma indeterminada para a cardíaca. Nesta linha, nosso grupo já teve quatro projetos aprovados no CEP do Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas (INI) sob números: 02826212.6.0000.5262, 23959613.7.0000.5262, 46620715.0.0000.5262 e 65360017.4.0000.5262 que abordam a correlação do polimorfismo do gene do fator de transformação do crescimento #946;1 (TGF#946;-1), além de outros polimorfismos genéticos, com as formas da doença de Chagas e o valor prognóstico de novas variáveis ecocardiográficas, biomarcadores do hospedeiro e carga parasitária e tipo molecular do Trypanosoma cruzi. O presente projeto é uma continuação destes projetos. Recentes estudos têm reportado SNPs em genes ligados ao complexo principal de histocompatibiliadde (HLA), relacionados a doenças cardíacas, inflamação, genes e reguladores de miRNA, eQTLs, além daqueles relacionados ao sistema imune. Para aprofundarmos o estudo genético, além dos 850.000 genes analisados, iremos através da análise de dois métodos de abordagem genética molecular sequenciar o genoma completo e determinar a frequência e localização de metilações no DNA (epigenoma) para associar os achados à forma e estágio da doença de Chagas crônica de tal forma a associar biomarcadores genéticos com fatores não genéticos para predição de quais pacientes têm maior risco de desenvolver os estágios mais avançados da forma cardíaca da doença de Chagas (CCC). Assim, a associação destes novos alvos a manifestações clínicas da cardiopatia chagásica crônica será testada. Acreditamos que este conhecimento será útil para conhecermos melhor a fisiopatogenia da progressão da doença de Chagas e assim avaliarmos quais destes fatores podem ser candidatos a índices prognósticos na doença de Chagas.

A doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é uma doença negligenciada que afeta 6 milhões de pessoas. Cerca de 30 dos pacientes com DC desenvolvem a cardiopatia chagásica crônica (CCC), uma miocardiopatia inflamatória, enquanto a maioria dos infectados - cerca de 60 -permanecem assintomáticos na forma indeterminada (FI) da doença. A morte é resultado de insuficiência cardíaca ou arritmia. Fibrose miocárdica, inflamação e disfunção mitocondrial estão envolvidas no substrato e desencadeamento da arritmia. A sobrevida na CCC é pior que em outras cardiomiopatias. Não há marcadores prognósticos precoces para a morte súbita cardíaca (MSC), que pode ocorrer em pacientes sem a forma avançada da CCC. Assim, a identificação de um biomarcador precoce poderia otimizar a alocação de desfibriladores cardíacos implantáveis (CDI), a profilaxia/tratamento adequado para pacientes com MSC. Diferente de outras miocardiopatias, na CCC existe uma miocardite rica em células do tipo Th1 com abundante produção de IFN-gama e TNF-alfa, e niveis seletivamente reduzidos de enzimas mitocondriais do metabolismo energético. A sinalização por IFN-gama e TNF-alfa, constitutivamente aumentada em pacientes com DC, afeta negativamente a função mitocondrial. Um componente genético na suscetibilidade à CCC foi sugerido por estudos caso-controle de polimorfismos genéticos. Em um estudo piloto de mapeamento genômico (GWA, de Genome-wide association), nosso grupo identificou polimorfismos genéticos comuns associados a bloqueio atrioventricular e uso de marcapasso (MP) cardíaco em pacientes CCC. O sequenciamento global do exoma (WES, de whole exome study) em famílias nucleares com múltiplos casos de CCC/FI identificou variantes gênicas raras e patogênicas em genes mitocondriais e inflamatórios segregando com os casos de CCC. Visamos estudar a fisiopatologia e genética da CCC, de forma a identificar novos tratamentos e biomarcadores para melhorar a sobrevida de pacientes CCC. No nosso subprojeto 1, exploraremos a fisiopatologia das mitocôndrias e o IFN-gama na CCC, realizando estudos funcionais com linhagens de cardiomiócitos com edição gênica por CRISPR-Cas9 e cardiomiócitos diferenciados de células tronco pluripotentes induzidas (CM-iPSC) obtidas de pacientes carregando ou não as mutações de interesse. O subprojeto 2 envolve a busca de agentes terapêuticos visando mitigar a disfunção mitocondrial induzida por citocinas. Realizaremos a varredura de bibliotecas de fármacos aprovados pela FDA (Food and Drug Administration dos EUA), para identificar compostos atenuando a disfunção mitocondrial induzida por citocinas, validando os melhores "hits" em CM-iPSC e em camundongos transgênicos para o IFN-gama, que desenvolvem cardiopatia inflamatória; tais drogas podem ter papel terapêutico na CCC. Nos subprojetos 3 a 5, estudaremos o panorama genético da DC, analisando variantes genéticas associadas com cada forma clínica da doença e avaliando seu papel prognóstico para formas arrítmicas da CCC. No subprojeto 3, realizaremos um estudo GWA transversal, com um alto número de amostras nas formas arrítmica e não-arrítmica da CCC identificando marcadores associados ao uso de dispositivos -marcapasso (bloqueios atrioventriculares) e CDI (arritmias ventriculares). No subprojeto 4, avaliaremos o valor prognóstico de marcadores genéticos comuns no seguimento de formas arrítmicas da CCC, com desfechos como taquicardia ventricular, morte súbita cardíaca e mortalidade de todas as causas. No subprojeto 5, utilizaremos o sequenciamento global de exoma para comparar o panorama genético de pacientes não relacionados no espectro da Doença de Chagas e de portadores de miocardiopatias não inflamatórias. No subprojeto 6, utilizaremos o sequenciamento de RNAm de "single cell" em células mononucleares do sangue periférico para identificar perfis fenotípicos e trajetórias cel

Projeto de mobilidade internacional Brasil-França,

Projeto de mobilidade internacional Brasil-França,

Chagas disease (CD) remains one of the most neglected illnesses in the world, with estimates indicating 5.7 million infected people in Latin and Central America. Currently, there are many barriers that patients with CD have to overcome to obtain a diagnosis, adequate treatment, and appropriate follow-up. One of the main ones is the high rate of underdiagnosis and consequently of patients treated. It is estimated that less than 10 of patients are diagnosed and that less than 1 are treated. Furthermore, to date, there is no "reliable" method that allows measuring therapeutic efficacy. During the last 15 years, researchers from the São Paulo-Minas Gerais Tropical Medicine Research Center (SaMi-Trop) have developed numerous projects that have evidenced the high number of patients in an endemic area in the north of the State of Minas Gerais, in addition to providing valuable information on the natural history of CD, the rate of progression to cardiomyopathy and its relationship with antibody levels. A great key to the success of such initiatives has been their strategic articulation with primary health care, which has made it possible to have large cohorts of patients accompanied for more than 10 years. Therefore, it is intended in this project to apply all this knowledge and articulation to identify methodologies and tools that allow overcoming existing barriers. The results obtained will make it possible to increase the number of diagnosed patients to whom treatment will be offered and identify strategies and biomarkers that make it possible to improve patient follow-up and help evaluate new treatment candidates.

Projeto para o desenvolvimento pré-clinico tardio e clinico de vacina nasal contra o SARS-CoV-2

O cálculo acurado do número de infectados/imunes a COVID-19 na população é essencial para a quantificação do contágio, da imunidade de rebanho e políticas públicas de troca de fases de flexibilização da quarentena. O comportamento da transmissão da COVID-19 apresentou discrepâncias com as previsões de modelos matemáticos do contágio da doença, que foram utilizados para determinar políticas públicas de isolamento social. Sabendo-se que a maioria dos indivíduos infectados por vírus desenvolvem uma resposta imune celular, que pode ser mais duradoura que a imunidade humoral, é possível hipotetizar que estudos epidemiológicos baseados apenas na detecção de indivíduos com sorologia positiva subestimem a real prevalência de infectados/imunes para COVID-19. Nossa hipótese é que a adição da avaliação da resposta imune celular aos testes sorológicos em pacientes e contactantes de pacientes convalescentes de COVID-19 identificará um número maior de infectados/imunes do que o indicado pelo teste sorológico isoladamente. Esses estudos podem fornecer subsídios ao relaxamento ou não da quarentena e consequente reabertura da economia. Pretendemos avaliar a resposta imune celular específica contra o SARS-CoV-2, em adição a dosagem de IgG, IgM e IgA específicos para o vírus, em uma coorte com 1500 indivíduos com PCR positivo para SARS-CoV-2 sintomáticos e assintomáticos. Além disso, testaremos casais clinicamente discordantes onde apenas 1 cônjuge apresentou diagnóstico e sintomas de COVID-19. Nosso principal objetivo é identificar a proporção de soronegativos com resposta imune celular específica a COVID-19 em relação aos soropositivos. Essa proporção poderia ser usada como um corretor para os resultados de inquéritos soroepidemiológicos baseados apenas na dosagem de anticorpos, melhorando a acurácia da estimativa dos infectados/imunes e, portanto, melhorando a qualidade dos dados utilizados para decisão de políticas públicas quanto à COVID-19.

Projeto para o desenvolvimento de vacinas contra a COVID-19

A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi e afeta 5-8 milhões de pessoas em todo o mundo. Os fatores que levam à evolução diferencial de uma fração de pacientes para as formas cardíaca e digestiva da doença ainda não foram totalmente elucidados. Durante a fase crônica da infecção, 30 dos pacientes chagásicos desenvolvem a cardiopatia chagásica crônica (CCC) que é frequentemente fatal. 10 desenvolvem distúrbios debilitantes da motilidade gastrointestinal, como dilatação do esôfago e/ou colon (megaesôfago e megacólon, respectivamente) em consequência de degeneração dos neurônios do plexo mioentérico, exigindo cirurgia. Um grupo de pacientes apresenta ambas as formas. Os 60 restantes permanecem assintomáticos, na forma indeterminada da doença. Um infiltrado inflamatório significativo é encontrado tanto no plexo mioentérico de pacientes chagásicos quanto no miocárdio de pacientes com CCC; produção de Interferon-gama (IFN-gama) e TNF-alfa e disfunção mitocondrial significativa foram observados no miocárdio de pacientes CCC. Um componente genético foi identificado na suscetibilidade diferencial à evolução para a CCC. Embora vários estudos tenham identificado polimorfismos genéticos comuns do hospedeiro associados à CCC, muito pouco é conhecido sobre o papel da genética no desenvolvimento do megaesôfago. O estudo de variantes genéticas raras do hospedeiro pode fornecer pistas para a patogênese, e tem sido cada vez mais estudado em doenças poligênicas. Nosso grupo estudou de forma pioneira as variantes genéticas raras associadas na doença de Chagas, analisando famílias nucleares com múltiplos casos de CCC usando o sequenciamento completo de exomas. Todas as famílias estudadas apresentavam variantes patogênicas raras heterozigotas de genes mitocondriais ou envolvidos na inflamação compartilhadas pelos pacientes CCC e ausentes nos familiares na forma indeterminada - 5 das 6 famílias apresentaram variantes heterozigotas raras patogênicas em genes mitocondriais. Quando em homozigose, tais variantes podem provocar mitocondriopatias genéticas, que causam disfunção mitocondrial drástica e redução da produção de ATP em tecidos de alta demanda energética, como neurônios e músculo cardíaco e estriado. Cerca de 40 desses pacientes desenvolvem problemas cardíacos (cardiomiopatias, defeitos de condução e arritmias cardíacas) e disturbios do sistema nervoso autônomo, enquanto 15 desenvolvem distúrbios da motilidade gastrointestinal, incluindo megaesôfago e megacólon devido à destruição de neurônios dos plexos mioentéricos. A surpreendente semelhança na natureza e frequência do acometimento cardíaco e digestivo nas mitocondriopatias e na doença de Chagas sugere a possibilidade que mutações heterozigotas afetando a função mitocondrial tenham um papel na suscetibilidade ao desenvolvimento da CCC, megaesôfago e megacólon chagásicos. O IFN-gama e o TNF-alfa, produzidos sistêmica e localmente pelas células inflamatórias mononucleares de chagásicos, são conhecidos indutores de disfunção mitocondrial. Neste projeto, nossa hipótese de trabalho é que variantes genéticas mitocondriais heterozigotas patogênicas são mais frequentes entre pacientes portadores de megaesôfago chagásico do que pacientes da forma indeterminada. Células portando tais variantes seriam mais suscetíveis a dano mitocondrial e morte celular induzida por IFN-gama/TNF-alfa, processos que poderiam levar à denervação dos plexos mioentéricos e megaesôfago. Pretendemos testar nossa hipótese avaliando a frequência de variantes genéticas patogênicas em pacientes com megaesôfago chagásico e a forma indeterminada, bem como estudar mecanisticamente se células de portadores de tais variantes são mais suscetíveis à disfunção mitocondrial ou morte celular induzida por IFN-gama/TNF-alfa do que células de não portadores.

Pesquisador principal, Projeto CNPq/FAPESP, INCT de Investigação em Imunologia-iii, Coordenador Jorge Kalil (Responsável pela Área HIV/AIDS e participante-Área Doenças Infecciosas), 2017-21.

Vice-Coordenador. O projeto versa sobre a avaliação da resposta imune celular e humoral, estabelecimento de virus inativado e desenvolvimento de testes imunológicos específicos

A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, é uma doença tropical negligenciada, de elevada prevalência (6 milhões na América Latina) e expressiva morbimortalidade, especialmente por danos cardíacos na fase crônica da doença. A cardiopatia chagásica tem pior prognóstico que cardiomiopatias e outras etiologias. No Brasil, a doença de Chagas causa perdas econômicas de mais de 1.3 bilhões de dólares/ano, e seu tratamento representa um ônus importante para o SUS. A eficácia das drogas disponíveis para o tratamento etiológico, Benzonidazol e Nifurtimox, é baixa na fase crônica da doença de Chagas, justamente quando a maioria dos diagnósticos é feito; as drogas causam frequentes efeitos adversos e existem cepas resistentes do parasita. É premente a identificação rápida de novas drogas mais eficazes menos tóxicas e de baixo custo, ativas também na fase crônica da doença de Chagas. O reposicionamento de drogas já usadas em pacientes para outras indicações é a estratégia mais rápida e de menor custo para levar um tratamento à utilização clínica. Colchicina e cloroquina são drogas muito baratas, usadas há décadas para o tratamento de gota, malária e doenças reumáticas. A colchicina, um inibidor de formação de microtúbulos, interfere nas etapas precoces de invasão de células de mamíferos por tripomastigotas de T. cruzi in vitro. A cloroquina, que inibe a a acidificação do endossoma, reduz o escape dos tripomastigotas do vacúolo parasitóforo para o citoplasma das células infectadas. Além disso, pode inibir a autofagia, processo importante para a infecção celular pelo T. cruzi. Nossa hipótese é que o tratamento combinado usando a cloroquina e colchicina, drogas que agem em etapas distintas da infecção intracelular, em adição ao benzonidazol, droga tripanocida, será mais eficaz do que o benzonidazol isoladamente. Isso traz a expectativa de reduzir drasticamente, e talvez erradicar o T. cruzi da celula hospedeira e modelos animais de infecção pelo T. cruzi. O corolário de nossa hipótese é que o tratamento combinado será mais eficaz em cepas resistentes ao benzonidazol e no tratamento na fase crônica da infecção. No projeto, tencionamos testar o efeito isolado ou combinado de cloroquina, colchicina e benzonidazol em infecção de células humanas in vitro, visando obter um efeito sinérgico com diminuição de dose e aumento de eficácia em relação ao uso do benzonidazol isoladamente. Isso será testado em outras cepas geneticamente distintas do T. cruzi (diferentes DTUs). Testaremos também esses regimes de tratamento in vivo, em modelo de fase aguda com cepa resistente ao benzonidazol, e fase crônica da doença de Chagas em modelo hamster sírio. Investigaremos também o mecanismo de ação das drogas/combinações mais eficazes. Resultados preliminares mostram efeitos sinérgicos da combinação de drogas em infecção in vitro e in vivo, com redução da dose de Benzonidazol. Esperamos ao final do trabalho propor um novo protocolo de tratamento da doença de Chagas, pronto para ensaio clínico em pacientes.

Pesquisador associado

Organização de Reunião Científica

A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, afeta 15 milhões de pessoas, e 30% desenvolvem a Cardiopatia Chagásica Crônica, (CCC), enquanto a maioria dos pacientes permanece na forma indeterminada (FI). A agregação familiar de casos e a associação de polimorfismos genéticos (SNP) com a CCC sugerem um componente genético na suscetibilidade à CCC. O desfecho final da doença de Chagas é determinado pela miocardite e a resposta miocárdica. Nossa hipótese que a expressão miocárdica de muitos genes e proteínas relevantes para a patogênese seja controlada por polimorfismos genéticos, e que uma assinatura genética neles baseada pode ter valor prognóstico. No objetivo 1, usaremos uma abordagem de biologia de sistemas para identificar genes/proteínas diferencialmente expressos no miocárdio CCC, usando análises proteômica e transcriptômica. No objetivo 2, identificaremos variantes genéticos associados à doença. Num estudo caso-controle utilizaremos grandes coortes principais e de replicação (casos CCC, controles FI). Tag SNP comuns dos genes identificados no Obj.1 serão genotipados e analisados. O sequenciamento do exoma será feito em famílias nucleares com múltiplos casos, para identificar variantes raros compartilhados apenas por pacientes CCC. Realizaremos análises funcionais dos SNP. Combinações de múltiplos SNP podem ter valor prognóstico para o paciente individual, indicando aqueles de maior risco. Além disso, este estudo trará importantes informações sobre a patogenia e progressão da doença.

A doença de Chagas, endêmica na America Latina, é causada pela infecção com o parasita Trypanosoma cruzi. A principal consequência clínica da infecção pelo parasita é a cardiomiopatia chagásica crônica (CCC). Cerca de 30% dos pacientes infectados desenvolvem a CCC, 5 a 30 anos após a infecção inicial; a CCC possui prognóstico pior do que outras etiologias de cardiomiopatia. Até hoje, não existem marcadores que identifiquem a população de maior risco para o desenvolvimento da CCC. Esta é uma cardiopatia dilatada inflamatória caracterizada por uma miocardite rica em células T e macrófagos, hipertrofia e fibrose. Estudos de análise da expressão gênica em animais e pacientes identificaram modulação de diversas vias de inflamação, sinalização e de metabolismo energético. Entretanto, ainda não se conhecem os mecanismos moleculares que causam essa modulação. Recentemente foi demonstrado que microRNAs (miRNAs), pequenas moléculas de RNA de 22 nucleotídeos, estão envolvidas na regulação da expressão gênica de virtualmente todos os processos celulares. Os miRNAs ligam-se a sequencias parcialmente complementares presentes nas regiões 3' não traduzidas dos RNAs mensageiros (RNAm) específicos, chamados de alvos. Esse pareamento entre o miRNA e seu RNAm alvo leva à clivagem deste último ou inibição da tradução, resultando no silenciamento da expressão gênica. A modulação da expressão de determinados miRNAs está relacionada com a fisiologia e fisiopatologia do sistema cardiovascular. Os miRNAs também têm sido identificados como importantes biomarcadores plasmáticos, pois são secretados pelas células ou liberados durante dano tecidual. Sabe-se que patógenos intracelulares como Cryptosporidium e Toxoplasma alteram rapidamente a expressão de miRNAs em células do hospedeiro. Nossa hipótese é que alterações na expressão de diferentes miRNAs, induzidas pelo T. cruzi na fase aguda da infecção, podem estar associadas ao desenvolvimento da CCC. Com isso, hipotetizamos que o padrão de expressão de microRNAs na fase crônica da doença poderá refletir o perfil de expressão de miRNAs no tecido cardíaco induzido pelo presença do parasita na fase aguda. O corolário da nossa hipótese é que este perfil de miRNAs é importante no estabelecimento de um quadro de miocardite e/ou hipertrofia na infecção aguda pelo T. cruzi e na CCC. Além disso, para avaliarmos se os miRNAs podem ser biomarcadores de severidade e progressão para a CCC e na infecção aguda pelo T. cruzi, iremos traçar o perfil de miRNAs presentes no plasma de pacientes chagásicos de diferentes formas clínicas e também de camundongos agudamente infectados pelo T. cruzi.

Our long term goal is to establish SaMi-Trop as a Center of Excellence for Neglected Infectious Disease Research in Brazil. The Specific Aims of the current application are to begin that process by focusing on T. cruzi infection with the goal of finding an array of biomarkers that correlate with parasite persistence and Chagas cardiac disease that can be used to infer risk of disease progression and death as well used as surrogate markers of cure or efficacy of novel drugs. We will develop two interrelated studies: Project 1 (Principal Investigator Edecio Cunha-Neto) will focus on applying gene expression tools to existing whole blood RNA samples from the NHLBI REDS-II cohort to discover and validate new biomarkers of active infection and disease progression, these will be combined with parasite specific (PCR load and antibody profiling and titers) and plasma proteomic biomarkers (chemokines, cytokines, and inflamatory, coagulation and cardiac parameters) that are being generated through already funded collaborations, to generate composite biomarker profiles and scores that coorelate with pre-defined disease stages.. In Project 2 (Principal Investigator Antonio Ribeiro) we plan to take advantage of the Public Health System in the State of Minas by enrolling and collecting blood samples from 2000 Chagas disease patients. These patients will be followed for two years for the endpoints of death or admission to a hospital for cardiac disease. The main goal is to obtain a simple risk score based on biomarker levels and ECG fndings that could identify high risk patients in order to guide therapeutic approaches and serve as a foundation for future clinical trials.We will also use these samples to validate the utility of biomarkers and composite biomarker profiles found in project 1 for assessment of therapeutic responses including clearance or suppression of parasitemia or normalization of immune perturbations and markers of cardiac damage. Two cores will be established: the Administrative Core and Database and Epidemiology Core that will support activities of the 2 projects, as well as create and sustain research training capacity for young Brazilian scientists.

Aproximadamente 20-30% dos indivíduos infectados pelo Trypanossoma cruzi evoluem com uma forma cardíaca grave da doença de Chagas. Casos de agregação familiar já foram descritos, sugerindo a participação de um componente genético na suscetibilidade ao comprometimento do coração. Entretanto, até o momento, as pesquisas genéticas envolvendo pacientes com doença de Chagas se basearam em tecnologias que permitiam a pesquisa de apenas um marcador genético de cada vez. Utilizando a técnica de microarray, o presente estudo visa analisar mais de 1000 SNPs (single nucleotide polymorphism) em genes relacionados à resposta imunológica ou à função miocárdica em pacientes com doença de Chagas, com o objetivo de identificar um possível grupo de SNPs relacionados com a evolução da doença. Para tanto, o estudo fará uso de uma grande casuística de portadores de doença de Chagas (500 deforma indeterminada, 500 cardiopatas chagásicos) composta por amostras de pacientes em seguimento em três grandes centros de cardiologia: o Instituto do Coração (InCor) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, o Instituto de Pesquisa Dante Pazzannese (IDPC) e o Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP. Após a identificação dos SNPs associados à CCC, avaliaremos se os polimorfismos acarretam em diferenças de expressão dos genes envolvidos. Identificar fatores genéticos preditores precoces ou causais para a progressão clínica da doença é essencial para o esclarecimento da patogênese e a definição de modalidades apropriadas de tratamento.