Andrea Balan Fernandes.

Antimicrobial resistance (AMR) is a growing problem threatening public health worldwide. Failure to control microbial infections is already resulting increased deaths and last-resort antibiotics for the treatment of resistant microorganisms are gradually losing efficacy as well, as demonstrated by increase in multi-drug resistant (MDR) species. Among bacterial pathogens, the ESKAPE group bacteria (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, and Enterobacter species) are classified as the top priority organisms in terms of tackling AMR. Our aim in this project is to study the molecular mechanisms by which these bacteria generate resistance for antimicrobial agents. The mechanisms for bacteria to acquire AMR are many-fold, including active secretion of antibiotics from the cells. We propose to study key drug efflux transporters from ESKAPE pathogens, the MsbA-like proteins, which belong to the ATP-Binding Cassette class of membrane transporters (ABC transporters). These membrane proteins utilize energy from ATP hydrolysis to pump a wide range of substrates across cellular membranes. MsbA-like proteins are normally involved in lipid translocation, membrane recycling and biofilm formation, but have also a moonlighting function as exporters of foreign chemicals from cells. For this reason, they are important players in drug efflux and transport of antimicrobial outside the cell in many pathogenic bacteria. Stopping these transporters would impair the bacterial growth and make bacteria vulnerable to drugs again, re-enabling the use of existing, tried-and-tested antibiotics. We will use structural and biophysical methods to evaluate the function of MsbA proteins and explore possibilities for their inhibition by small molecules.To do this, we will take a three-pronged approach to studying ESKAPE MsbA proteins: (i) to characterize their structure and function; (ii) to develop methods and assays to evaluate the transport activities front to different substrates; and (iii) to establish a platform for structure-guided drug discovery on MsbAs and apply fragment-based methods to reveal potential sites for inhibition of these enzymes. With these approaches we will initiate a new, broader programme that will bring information and expertise to an important, but under-explored class of therapeutic targets. We will build new tools for heterologous protein expression, X-ray crystallography and cryo-electron microscopy for structural analyses. Biochemical and biophysical methods will be used to evaluate the transport activity and to screen small molecule libraries against the targets. The structures in complex with small molecules will be the trigger for optimisation of these molecules for subsequent structure-guided drug discovery campaign to turn the hits into specific, high-affinity inhibitors.

A resistência antimicrobiana (AMR, Antimicrobial Resistance) é um problema crescente que ameaça a saúde pública em todo o mundo. O fracasso no controle das infecções microbianas resulta em aumento de mortes e perda da eficácia de antibióticos de última geração, com crescente aumento de espécies multirresistentes (MDR, Multidrug Resistance). Entre os patógenos bacterianos, as bactérias do grupo ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp.) são classificadas como os organismos de maior prioridade em termos de combate à AMR. Nosso objetivo é estudar os mecanismos moleculares pelos quais essas bactérias geram resistência a agentes antimicrobianos e desenvolver inibidores. Propomos estudar os principais transportadores de efluxo de drogas de patógenos ESKAPE, proteínas MsbA-like, que pertencem a uma das maiores famílias de transportadores de membrana, os transportadores ABC (ATP-Binding Cassette transporters). A interrupção destes transportadores levaria a efeitos deletérios ao crescimento bacteriano e tornaria as bactérias novamente vulneráveis aos medicamentos. Utilizaremos métodos estruturais e biofísicos para avaliar a função das proteínas MsbA e explorar possibilidades de sua inibição por pequenas moléculas. Três objetivos serão almejados em paralelo: (i) caracterização da estrutura e função das MsbAs; (ii) desenvolvimento de métodos e ensaios para avaliar as atividades de transporte frente a diferentes substratos e identificação de substratos; e (iii) estabelecer uma plataforma para descoberta de medicamentos guiada pelas estruturas de MsbAs e aplicar métodos baseados em fragmentos para revelar potenciais locais para inibição dessas enzimas. Construiremos novas ferramentas para expressão heteróloga de proteínas, cristalografia de raios X e microscopia crio-eletrônica para análises estruturais. As estruturas serão utilizadas para o desenvolvimento de inibidores.

This is an initiative from the Department of Microbiology at ICB-USP to create a collection of reagents, protocols, methods and expertise to produce tools for modern molecular biology, in its broadest sense, to facilitate research, teaching and public engagement.We have already a reasonable collection of tools of our own and we are working towards making as much of these available to community.This is an Open initiative as the tools and reagents described here are openly available to anyone who wants to use them, along to with details on how to use them. We plan also to create courses at different levels to help to disseminate the expertise and the reagents as broadly as possible and to ensure scientists can make the best use of these resources, to increase productivity and capacity.This initiative is part of the FAPESP-funded SPEC project, lead by Profs Marko Hyvönen and Andrea Balan.

This is an initiative from the Department of Microbiology at ICB-USP to create a collection of reagents, protocols, methods and expertise to produce tools for modern molecular biology, in its broadest sense, to facilitate research, teaching and public engagement.We have already a reasonable collection of tools of our own and we are working towards making as much of these available to community.This is an Open initiative as the tools and reagents described here are openly available to anyone who wants to use them, along to with details on how to use them. We plan also to create courses at different levels to help to disseminate the expertise and the reagents as broadly as possible and to ensure scientists can make the best use of these resources, to increase productivity and capacity.This initiative is part of the FAPESP-funded SPEC project, lead by Profs Marko Hyvönen and Andrea Balan.

O projeto busca promover a compreensão e a aplicação dos princípios básicos da microbiologia na agricultura de forma acessível e relevante para toda a comunidade rural. Desta maneira, o conceito de One Health, Saúde única, fundamentado na saúde humana, animal e meio ambiente será o foco central do projeto. Por meio de abordagens práticas e interativas, o objetivo central é capacitar os participantes sobre a importância do conhecimento microbiológico para melhorar a produtividade agrícola, promover a sustentabilidade ambiental e garantir a segurança alimentar. Para isso, docentes e especialistas da área de microbiologia trabalharão na formação dos alunos extensionistas, que por sua vez deverão atuar no projeto com: (1) Desenvolvimento de material didático: elaboração de materiais educativos, como cartilhas, vídeos, ebooks e guias práticos, adaptados às necessidades e realidades das comunidades rurais, para facilitar a compreensão dos conceitos microbiológicos e sua aplicação no contexto rural e empreendedorismo; (2) Oficinas teórico-práticas: desenvolver sessões educativas ministradas pelos extensionistas em microbiologia, agricultura e empreendedorismo, abordando tópicos como o papel dos microrganismos no solo, na água e nas plantas, métodos de controle biológico de pragas e doenças, parasitas, vetores, e técnicas de compostagem e biofertilização; (3) Atividade mão na massa: realizar visitas guiadas a propriedades rurais e experimentos práticos em campo para demonstrar os conceitos discutidos nas oficinas teóricas, permitindo aos participantes visualizarem a aplicação prática da microbiologia; (4) Capacitação de Multiplicadores: oferecer formação para professores de comunidades rurais e líderes comunitários que atuarão como multiplicadores do conhecimento em empreendedorismo e em agro microbiologia, capacitando-os a disseminar os conceitos aprendidos durante o programa para um público mais amplo; (5) Desenvolvimento de um espaço virtual: elaborar um canal virtual de comunicação para fóruns de discussão e troca de experiências para o público alvo, e (6) Pesquisa: conduzir avaliações periódicas por meio de entrevistas e observação direta sobre o impacto do projeto e adaptabilidade às necessidades em evolução das comunidades rurais.

Coordenadora do primeiro programa de residência em empreendedorismo e inovação da Universidade de São Paulo

O Instituto de Ciências Biomédicas (ICB) e a Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF) são duas Unidades da Universidade de São Paulo com enorme potencial para desenvolvimento de Pesquisa Translacional. As duas Unidades têm forte tradição na pesquisa básica e aplicada, com Programas de Pós-graduação na Modalidade Acadêmica de excelência internacional. É essencial que as descobertas geradas na pesquisa básica consolidada sejam rapidamente transferidas para outras esferas com foco no desenvolvimento de ensaios clínicos e aplicação direta no diagnóstico de doenças. Essa modalidade é um importante instrumento para acelerar a inovação tecnológica junto aos setores produtivos visando às demandas da sociedade. Os Programas de Pós-graduação na Modalidade Profissional têm ênfase na necessidade de identificar e solucionar problemas, agregar maior nível de competividade e produtividade a empresas e organizações, públicas ou privadas, e visam à transferência efetiva do conhecimento básico em aplicado. A relação de cooperação entre o ICB e FCF é bastante sólida e em 2021 as duas unidades receberam apoio financeiro da Empresa Brasileira de Pesquisa e Inovação Industrial (Embrapii) para o desenvolvimento de projetos inovadores na área de fármacos ou biofármacos em conjunto com a iniciativa privada. A nova unidade, o Centro de Inovação em Fármacos (Ceinfar), é formada por pesquisadores do Instituto de Ciências Biomédicas (ICB) e da Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF), sob a coordenação dos Profs. Humberto Ferraz, diretor da FCF, e Luis Carlos Ferreira, ex-diretor do ICB. Focando justamente na incorporação de etapas pré- e pós-desenvolvimento tecnológico, o Instituto de Ciências Biomédicas e a Faculdade de Ciências Farmacêuticas desta Universidade buscaram parcerias no setor produtivo nacional, interessados na resolução de problemas e na qualificação de profissionais para atuarem nessa esfera. Assim, dois parceiros de grande porte, e com convênios específicos já formalizados, irão contribuir com a presente proposta e integrar as duas linhas de pesquisa do Programa.

Não há dúvidas que o controle definitivo da pandemia da Covid-19 só será atingido por meio de uma vacina que seja segura e confira proteção imunológica duradoura em seres humanos. Atualmente diversos países dedicam esforço humano e recursos financeiros em uma corrida contra o tempo para que uma vacina efetiva e segura esteja disponível o mais rapidamente possível. No Brasil esse esforço ainda é insipiente. Instituições públicas com condições de produzir vacinas em larga escala estão dedicadas à realização de testes de diagnóstico molecular a partir de infraestrutura e insumos totalmente importados (Instituto de Butantan) ou a testes de fármacos com potencial efeito sobre a replicação do vírus (Fundação Oswaldo Cruz). Nas últimas décadas a estratégia nacional de produção de vacinas tem se baseado no licenciamento de tecnologias desenvolvidas fora do país.Parcerias envolvendo a academia, como demonstrada competência na área, e empresas de bases tecnológicas e perfil inovador, é uma estratégia empregada nos países que buscam soluções e autonomia para enfrentar desafios na área médica. A união de grupos de pesquisa da USP, comexperiência no desenvolvimento de estratégias vacinas e empresas de base tecnológica voltadas para o desenvolvimento de vacinas e produção de proteínas recombinantes, representa um modelo de desenvolvimento científico/tecnológico ainda pouco frequente em nosso meio. O projeto traz ainda, de modo inovador, uma importante parceria com um instituto privado que tem por finalidade despertar na sociedade a importância da ciência para o desenvolvimento de uma nação autônoma e ética. Espera-se que a união dessas expertises traga de forma objetiva avanços importantes que levem a descobertas de vacinas insumos contra a Covid-19 para o SUS e empresas privadas voltadas para a saúde.

O SARS-CoV-2 é um vírus de RNA de cadeia positiva, cujo genoma tem aproximadamente 29.7 kb e compartilha 79,5 de identidade de sequência com SARS-CoV.2 Além de 16 proteínas não estruturais codificadas pela poliproteína ORF1ab, o vírus possui 4 proteínas estruturais principais, incluindo a proteína spike (S), proteína nucleocapsídeo (N), proteína membrana (M) e proteína envelope (E).3 Estas proteínas tem sido os maiores alvos para o desenvolvimento de vacinas para o SARS-CoV-2. Por outro lado, a produção das proteínas completas (full length) ou em domínios, pode apresentar muitas dificuldades em relação à expressão, enovelamento e estabilidade nos sistemas heterólogos, principalmente os mais comumente usados como bacterianos e de leveduras. De fato, a produção das proteínas de SARS-CoV-2 e SARS-CoV obtidas até o momento tem se mostrado mais eficiente em células de insetos e células de mamíferos em culturas celulares, o que nem sempre é acessível e oferece uma forma rápida de produção em larga escala. Para contornar o problema da expressão de proteínas heterólogas em sistemas eucarióticos - o que além de ser mais custoso, demanda tempo e infraestrutura apropriada - e os problemas de produção de epítopos sintéticos que nem sempre adquirem a conformação nativa, escolhemos a técnica RAD Display4 para a produção de peptídeos de proteínas virais. Nesse sistema, as sequências de interesse são clonadas no interior do gene radA de Pyrococcus furiosus5 utilizando-se o protocolo independente de ligase (Ligase Independent Cloning, LIC)6 e expressas como proteínas de fusão em células de Escherichia coli. A estabilidade e características bioquímicas da proteína RadA-fusionada facilita sua purificação por protocolo bem estabelecido4, o que gera resultados mais rápidos e menos onerosos. Destacam-se a facilidade de clonagem das sequências de interesse em larga-escala e a produção das proteínas em curto período de tempo (máximo de 40 dias). O projeto visa a produção de vários epítopos em larga escala e testes para desenvolvimento de estratégias vacinais e de diagnóstico.

Desenvolvimento de plataforma inédita de descoberta de fármacos para covid-19 baseada em células
humanas primárias, reposicionamento de fármacos e descoberta de novos antivirais. A atividade será
avaliada em monoterapia e combinação in vitro, com determinação do mecanismo de ação e
resistência.

Transportadores ABC apresentam grande relevância médica e farmacêutica uma vez que são relacionados ao desenvolvimento do fenômeno de múltipla resistência a drogas (MDR) no tratamento do câncer, resistência bacteriana, infectividade e patogênese. Apesar de extensivamente estudados em muitos organismos, existem poucos estudos funcionais ou estruturais sobre estes transportadores em Mycobacterium tuberculosis e Xanthomonas citri pv. citri, duas bactérias patogênicas estudadas pelo nosso grupo. Neste projeto, serão desenvolvidas diferentes abordagens para a determinação de função dessas proteínas nos mecanismos de patogênese e resistência bacteriana, estudos estruturais para compreensão de mecanismos de interação e, formas de inibição dos transportadores. Em trabalhos do grupo, mostramos que proteínas pertencentes ao regulon Pho, de controle dos níveis de fosfato em bactérias, são conservadas em X. citri e induzidas em carência de fosfato. Dentre as mais de 31 proteínas, estão inclusos componentes do transportador de fosfato do tipo ABC, sistema PstSCAB, do regulador negativo PhoU, e do sistema de dois-componentes PhoR/PhoB. Especificamente, ortólogos dessas proteínas tem sido diretamente associados aos processos de infecção e patogênese em diferentes microrganismos. Neste trabalho pretendemos dar continuidade à caracterização funcional/estrutural das proteínas mencionadas, principalmente com ênfase nos estudos dos complexos, interações entre os componentes e mecanismos de ativação de resposta. As proteínas foram avaliadas por métodos de bioinformática e modelagem molecular, e, isoladamente ou em complexos, serão submetidas a ensaios biofísicos e estruturais de espalhamento de raios X de baixo ângulo (SAXS) e cristalização, e adicionalmente, ensaios funcionais a partir da obtenção de linhagens de X. citri portadoras de mutações nos genes de interesse e estudos de infecção em plantas de Citrus sinensis. Em paralelo, temos estudado formas de inibição de transportadores ABC utilizando duas abordagens diferentes: (i) sistema RAD-display para expressão de hélices pertencentes às permeases dos transportadores e bloqueio da interação com as ATPases e proteínas ligadoras, e (ii) inibição de proteínas essenciais utilizando a metodologia de desenvolvimento de fragmentos (Fragment Based Drug Discovery). A caracterização estrutural destes transportadores, bem como a determinação do papel funcional nas referidas bactérias de interesse, será de grande relevância científica e aplicada. #8195;

Xanthomonas citri é a bactéria responsável pelo cancro cítrico, doença de disseminação mundial que afeta um grande número de variedades de plantas levando a problemas ecônomicos e sociais de grande impacto. O único método de controle é a remoção de árvores ao redor de um foco de infecção, o que contribui para seus efeitos econômicos devastadores, e acentua a necessidade de novas estratégias de controle da infecção. Comparado com outros patógenos que infectam citros, X. citri apresenta mecanismos de infecção e virulência diferenciados como a formação de biofilme,
interação com o hospedeiro e sistemas secretórios específicos, os quais incluem além de outros, os Transportadores do tipo ABC (do inglês ATP-Binding Cassete). Transportadores ABC são uma das mais importantes famílias de proteínas que associa a hidrólise do ATP ao transporte de diferentes moléculas através da membrana. Apesar da sua importância em fenômenos como patogênese e
virulência bacterianas, pouco se conhece sobre esta família em fitopatógenos e X. citri. Neste trabalho, propomos a caracterização de proteínas do sistema de transporte ABC de fosfato PstBCAS PhoU e sua interação com proteínas do sistema sensor dois-componentes PhoR-PhoB e caracterizar as diferenças estruturais, funcionais e de interação das proteínas periplasmáticas de transportadores ABC relacionados com a assimilação de sulfonatos. Resultados prévios obtidos pelo nosso grupo mostraram que o sistema de captação de fosfato em X. citri, apesar de conservado, apresenta
diferenças significativas em termos de regulação e interação das proteínas envolvidas. Por outro lado, em relação à captação de compostos sulfonados, X. citri apresenta três diferentes sistemas em contrapartida com E. coli e outrosmicrorganismos que apresentam apenas um. A deleção de genes destes transportadores envolvidos com o transporte de fosfato, sulfato e sulfonatos afetam significativamente a virulência da bactéria em plantas de Citrus sinensis evidenciando a importância dos mesmos. As proteínas de interesse já são expressas em E. coli a partir de vetores de expressão
específicos e uma série de dados preliminares foram produzidos para fundamentar esta proposta. Neste sentido, duas abordagens serão utilizadas para os sistemas de fosfato e sulfonatos, respectivamente: (i) expressão e purificação das proteínas e ensaios espectroscópicos e biofísicos para a avaliação da interação e afinidade por diferentes subtratos/proteínas e, (ii) estrutural, baseada em estudos de modelagem molecular, SAXS e cristalografia. É importante ressaltar que para obtenção dos resultados contamos com a colaboração do Dr. Marko Hyvonen (Depto. de Bioquímica
da Universidade de Cambridge), especialista em estudos de interação proteína/proteína e do Dr. Dirk Slotboom (Depto. de Bioquímica da Universidade de Groningen, Holanda), um dos maiores especialistas no estudo de transportadores ABC. Os resultados obtidos serão compilados a outros obtidos previamente para a preparação de manuscritos que serão publicados em revistas de impacto e disseminação científica.

Proteínas de membrana são consideradas os novos desafios da Biologia Estrutural dada a sua relevância médica. Mais de 50% dos alvos da indústria farmacêutica envolvem estas proteínas as quais representam cerca de 30% dos genomas de organismos. Com o objetivo de montarmos uma plataforma para a expressão e produção de proteínas de membrana em nosso laboratório, para uso em ensaios funcionais in vitro e estudos estruturais, escolhemos como alvos transportadores do tipo ABC (do inglês, ATP_Binding Cassete), uma das maiores famílias de proteínas integrais de membrana. Transportadores ABC apresentam grande relevância médica e farmacêutica uma vez que são relacionados ao desenvolvimento do fenômeno de múltipla resistência à drogas (MDR) no tratamento do câncer, resistência bacteriana, infectividade e patogênese. Apesar de extensivamente estudados em muitos organismos, existem poucos estudos funcionais ou estruturais sobre estes transportadores em Mycobcaterium tuberculosis e Xanthomonas citri, duas bactérias patogênicas estudadas pelo nosso grupo. Em trabalhos recentes, temos evidenciado a importância de componentes da família ABC na infecção e patogenicidade de X. citri, incluindo a presença de ao menos quatro transportadores relacionados à captação de sulfato (SbpCysUWA) e compostos sulfonados (SsuABCDE). A resolução da estrutura da proteína ligadora de sulfato Sbp na presença de sulfato e ensaios biofísicos confirmaram a sua função e expressão em ensaios in vivo. Em paralelo, em trabalho realizado em colaboração com a Dra Isabel de Moraes do Laboratório de Proteínas de Membrana do Diamond Light Source e OPPF em Oxfordshire, clonamos e realizamos análises de expressão de 17 transportadores do tipo ABC de M. tuberculosis, a maioria envolvida no efluxo de drogas como também na assimilação de moléculas fundamentais para o metabolismo celular. Dada a importância destes transportadores, a ausência de dados funcionais e a experiência do nosso grupo com esta família de proteínas, este projeto visa a caracterização funcional e estrutural dos transportadores de M. tuberculosis envolvidos com o transporte de glutamina (Rv2563/Rv2564), de drogas (Rv1747), e o transportador de sulfato de X. citri (SbpCysUWA). Neste sentido, pretende-se expressar, purificar e produzir os transportadores em complexo ou os componentes isolados para resolução de suas estruturas cristalográficas e realização de estudos funcionais. Ainda, o desenvolvimento deste projeto será de grande importância para a formação de um grupo com experiência na manipulação de proteínas de membrana para estudos funcionais e estruturais, uma das grandes áreas expoentes no estudo de proteínas e carentes no Brasil.

Disciplina oferecida para alunos de pós-graduação e graduação na Universidade de São Paulo, que tem como tema o desenvolvimento de projetos imediatamente aplicáveis para solução de problemas na área da saúde.

The main focus of our research is in the development of chemical lead molecules for the inhibition of protein-protein interactions. In close collaboration with chemists, we use fragment-based drug discovery methods to identify starting points for chemical elaboration to small molecules that bind and inhibit biologically important interactions with high affinity and specificity. We are in charge of the biochemistry, biophysics and structural biology in these multidiscplinary projects. One of the main technical foci in our work has been protein engineering to develop suitable experimental systems to support the inhibitor development. Particular emphasis has been in establising robust X-ray crystallographic platforms for our targets, to enable continuous structural analysis of new inhibitors to support further development. One of our main targets has been human recombinase RAD51 and during the course of 6-7 years, we have developed nanomolar inhibtors against a binding site that is predicted to be very poorly druggable. We have also been involved in the development of new types of stapled peptides in collaboration with Prof Spring in the Dept of Chemistry. Another major area of research in my group is structure-function analysis of TGF- beta family growth factors. We are interested in understanding how these molecules interact with their receptors and inhibitors, with particular interest in understanding the role of the pro-domains of the growth factors in their regulation.

A utilização de micro-organismos para o processamento de materiais naturais é realizada há décadas e vem crescendo com as novas descobertas em termos de métodos de isolamento, caracterização e cultivo destes. Estudos de populações microbianas de diferentes habitats, utilizando sequências conservadas dos genes 16S rRNA e 18S rRNA mostra que a maior parte dos micro-organismos que compõem a biosfera ainda não foi estudada. Esta diversidade populacional e genética vem sendo objeto de estudo em diferentes aspectos, mas principalmente com o objetivo de identificar microrganismos com potencial de biorremediação, farmacêutico e biotecnológico. Uma das estratégias mais empregadas que oferece uma combinação quase ilimitada para encontrar novos genes codificadores de produtos relevantes é a abordagem metagenômica, a partir da qual o DNA genômico de microrganismos presentes em amostras do ambiente é isolado e clonado em vetores específicos para a construção de bibliotecas.

Sistemas de transporte ABC são proteínas extremamente importantes em todos os organismos uma vez que desempenham diferentes funções relacionadas ao transporte de moléculas incluindo o fenômeno de resistência à drogas em células cancerígenas. Em bactérias gram negativas tais sistemas são constituídos por três proteínas: uma periplasmática ligadora que é responsável pela afinidade e especificidade do sistema, duas proteínas de membrana que formam o poro de passagem e duas proteínas associadas à membrana responsáveis hidrólise de ATP e liberação de energia para que o transporte ocorra. Os genomas de Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) e Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), bactérias patogênicas de grande interesse econômico, apresentam 4% dos genes dedicados à codificação de proteínas desta família, o que ressalta a importância da mesma. Apesar desta importância, muito pouco se conhece sobre tais transportadores e seu papel na fisiologia das bactérias, bem como se existe relação dos mesmos com os mecanismos de infecção e patogênese. Nosso grupo tem se dedicado ao estudo funcional e estrutural de 6 proteínas ligadoras de X. axonopodis, e os resultados tem demonstrado que estas proteínas apresentam características distintas de outros ortólogos. Neste sentido, este projeto pretende dar continuidade aos estudos já iniciados aumentando o número de alvos e incluindo ortólogos de X. campestris para que possam ser realizadas comparações entre os sistemas. Também é objetivo deste trabalho, usar a formação e conhecimento na área de Biologia Estrutural de Proteínas do grupo para o desenvolvimento de um Laboratório de Pesquisas em Biologia Estrutural e Funcional no Instituto de Ciências Biomédicas da USP, ainda carente deste perfil.

Transportadores ABC representam uma das maiores famílias protéicas estruturalmente formadas por uma proteína ligadora resposeavel pela afinidade e especificidade (em procariotos), dois componentes de membrana que formam o poro de passagem e dois componentes citoplasmáticos que fornecem energia ao transporte. Como tal estão envolvidos em diferentes funções nas células de todos os tipos de organismos. Em bactérias são responsáveis por mecanismos de resistência, patogênese, formação de biofilmes, transporte e nutrição e reparo de DNA. Em eucariotos são os principais alvos da indústria farmacêutica uma vez que são responsáveis pelo fenômeno de múltipla resistência à drogas (MDR) no tratamento de tumores. Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. axonopodis) é uma bactéria fitopatogênica de grande interesse porque é responsável pelo cancro cítrico, doença que afeta plantas no Brasil e no mundo levando à perdas econômicas significativas. O estudo do genoma desta bactéria revelou que 4% deste codifica proteínas desta família. Neste sentido, nosso grupo tem trabalhado com estas proteínas funcional e estruturalmente, visando identificar transportadores que sejam importantes para o crescimento, infectividade e patogênese, de forma a identificarmos alvos para o desenvolvimento de drogas e inibidores de crescimento. Estudos de proteoma da X. axonopodis revelaram que cerca de 28 transportadores do tipo importador e 14 exportadores de drogas são ativados durante a infecção em plantas de citros. Neste projeto visamos a caracterização funcional e estrutural de proteínas envolvidas com os transportes de molibdato, maltose, fosfato, putrescina, ferro, sulfato e alcanosulfonatos. As proteínas dos transportadores e associadas aos transportes são expressas e produzidas em larga escala para ensaios espectroscópicos e calorimétricos, caracterização de ligantes, cristalização e difração de cristais, resolução das estruturas por cristalografia e ensaios in vivo utilizando mutantes de X. axonopo

O projeto se baseia na caracterização bioquímica e estrutural das proteínas ligadoras de Maltose (Male) e alcanosulfonatos (SsuA2) do sistema de transporte ABC de X. citri. As proteínas são caracterizadas por ensaios espectroscópicos de CD e fluorimetria, modelagem molecular, interação com ligantes específicos por experimentos de ITC e thermal shift. Também é objetivo do trabalho resolver as estruturas tri-dimensionais destas proteínas por cristalografia.

ATP-binding cassette (ABC) transporters couple ATP hydrolysis to the uptake and efflux of solutes across the cell membrane in bacteria and eukaryotic cells. In eukaryotic cells this system is associated to the phenomena of multiple drug resistance and in bacteria these transporters are important virulence factors because they play roles in nutrient uptake and in secretion of toxins and antimicrobial agents. The specific transport of a essential nutrient such as molybdate in gram-negative bacteria occurs via a specific ABC transport system and involves a periplasmic molybdate-binding protein (ModA), that is responsible for the specificity and affinity of the transport; a permease protein that constitutes the translocation pathway across the membrane (ModB) and an ATPase protein (ModC) that interacts with the permease at its the cytoplasmic surface to supply the energy for the active transport. In order to characterize the interactions between the periplasmic and cytoplasmic components with the membrane protein, the complete system of molybdate transport from the phytopatogenic bacteria Xanthomonas citri, is being characterized. The crystal structure of the X. citri ModA was solved by X-ray crystallography at 1.7 Å and site-directed mutagenesis is being carried out to assess the importance of some key residues involved in the structure maintenance, ion binding and interaction. Additionally, the recombinant Xac ModC protein is been expressed in E. coli cells in order to solve its 3D structure. 
In this project we expect to perform the molecular dynamics (MD) simulations of (i) the ModA protein in the presence and absence of molybdate and (ii) the periplasmic interface between ModA and ModB proteins. The final characterization of the transport process involving these proteins will help a better understanding of the molybdate transport mechanism in Xanthomonas and can be useful for the future development of strategies of bacterial control using transport inhibitors.

A análise estrutural de proteínas é fundamental para estudo funcional de genes envolvidos em diferentes etapas do metabolismo microbiano, podendo contribuir para o desenvolvimento de estratégias de controle de espécies bacterianas de interesse médico ou agrícola. Os sistemas de transporte ativo de nutrientes são essenciais para a sobrevivência de qualquer célula, e dependem de proteínas associadas à membrana citoplasmática. Em bactérias, o sistema de transporte ABC (ATP-Binding Cassete) precisa de um componente solúvel responsável pelo reconhecimento e ligação do substrato a ser translocado para o interior da célula. O presente projeto tem como ponto de partida, a caracterização estrutural da proteína ModA de Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), componente solúvel do sistema de transporte de molibdato (MoO4). O elemento molibdênio é fundamental para a maioria das bactérias porque é incorporado aos cofatores molibdopterinas, presentes em enzimas envolvidas nas reações de óxido-redução de importantes ciclos metabólicos. O sistema de transporte ABC de molibdato em Xac também conta com a presença de mais duas proteínas: ModB (a proteína que forma o canal de passagem através da membrana) e ModC (uma ATPase que interage com ModB no lado citoplasmático da membrana e libera energia para o transporte). Em Xac, muito pouco se conhece sobre o funcionamento dos sistemas de transporte de oxiânions, e é especificamente desconhecido, o mecanismo de interação entre a proteína periplasmática, a proteína ATPase e o componente de membrana. Este trabalho busca propor/identificar as estruturas do sistema de transporte ABC de molibdato em Xac e as possíveis regiões de interação entre os mesmos, através da resolução das estruturas cristalográficas das proteínas ModA e ModC e da modelagem molecular do complexo ModA-ModB-ModC. O projeto também prevê, a obtenção de proteínas ModA mutadas em aminoácidos específicos e a posterior análise da importância dos mesmos na ligação com o substrato

BIOSSEGURANÇA EM RELAÇÃO AOS MICRORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS

Andrea Balan
Ana Clara Guerrini Schenberg


1. Resumo
	
Em trabalhos anteriores do nosso laboratório, foi criado um sistema suicida para microrganismos do tipo OGM (Organismos Geneticamente Modificados), que garante a biossegurança, uma vez que evita a disseminação do OGM na natureza por meio da destruição do material genético do próprio OGM. Nestes trabalhos, a ação de uma nuclease, cuja produção pela célula é controlada pela concentração de glicose presente no meio de cultura, é responsável pela destruição do DNA e RNA celulares. Este sistema, também desenvolvido para bactérias, se mostrou efetivo na contenção do OGM após o exercício de sua função. 
Neste trabalho, serão desenvolvidos sistemas suicidas para todas as linhagens recombinantes produzidas ao longo do presente projeto, que se destinarem aos processos de biorremediação de ambientes contaminados com diferentes metais.

MELHORAMENTO GENÉTICO DE MICRORGANISMOS VISANDO A BIORREMEDIAÇÃO DE EFLUENTES DE METAIS PESADOS
Coordenação:
Ana Clara Guerrini Schenberg

NAP-Biotecnologia
Universidade de São Paulo

Companhia Vale do Rio Doce

BIOSSEGURANÇA EM RELAÇÃO AOS MICRORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS

Andrea Balan
Ana Clara Guerrini Schenberg


1. Resumo
	
Em trabalhos anteriores do nosso laboratório, foi criado um sistema suicida para microrganismos do tipo OGM (Organismos Geneticamente Modificados), que garante a biossegurança, uma vez que evita a disseminação do OGM na natureza por meio da destruição do material genético do próprio OGM. Nestes trabalhos, a ação de uma nuclease, cuja produção pela célula é controlada pela concentração de glicose presente no meio de cultura, é responsável pela destruição do DNA e RNA celulares. Este sistema, também desenvolvido para bactérias, se mostrou efetivo na contenção do OGM após o exercício de sua função. 
Neste trabalho, serão desenvolvidos sistemas suicidas para todas as linhagens recombinantes produzidas ao longo do presente projeto, que se destinarem aos processos de biorremediação de ambientes contaminados com diferentes metais.

Análise Funcional e Estrutural de Proteínas Ligadoras do Sistema de Transporte ABC de Xanthomonas citri
A Citricultura é de fundamentental importância para a economia brasileira e é a segunda atividade economicamente importante no Estado de São Paulo. Esta economia representa 400.000 empregos diretos e envolve 4 bilhões de dólares por ano em transações financeiras, dos quais 1.5 bilhões, em exportações. Exitem duas principais doenças que afetam os citrus: a clorose variegada dos citrus (CVC), causada pela bactéria Xylella fastidiosa, e o cancro cítrico, causada pela bactéria Xanthomonas citri. Esta última é um gênero bacteriano que ataca não apenas citros, mas arroz, feijão, uvas e algodão (Chen et al., 1994). 
Há cerca de dois anos, quando os genomas das Xanthomonas citri e Xanthomonas campestris foram inteiramente sequenciados pelo consórcio ONSA, foi possível identificar que 4% destes é representado por genes da família de proteínas denominada "ABC de transporte" (de ATP Binding Cassete). Transportadores do tipo "ABC" são sistemas de transporte celular extremamente importantes nos processos de importação e exportação de substâncias através da membrana, mas também são associados à outras funções como regulação da transcrição e tradução, reparo de DNA, resistência à drogas, patogenicidade e resposta imunológica (Dassa, 2000). Esses sistemas apresentam uma organização estrutural e funcional comum formada por três tipos de componentes protéicos. Duas proteínas integradas à membrana (permeases), duas proteínas de membrana periféricas que ligam e hidrolizam ATP, e uma proteína periplasmática (ou lipoproteína) ligadora de substrato. Esta proteína ligadora é responsável pela especificidade e afinidade do sistema, uma vez que promove a captação e a entrada na célula de uma série de compostos, como peptídeos, açúcares, íons, metais, etc (Higgins, 2001). Curiosamente, apesar de ambas as bactérias apresentarem cerca de 90% de homologia de sequências, os mecanismos de inf

O projeto caracteriza-se pelo desenvolvimento de novas estratégias vacinais baseadas nas proteínas oncogênicas do vírus do papiloma Humano HPV-16, E6 e E7. Após a clonagem e expressão destas proteínas, análises estruturais são realizadas no intuito de melhorar as respostas antigênicas.

O projeto consiste na identificação de genes que compõem o sistema de transporte ABC de Xanthomonas axonopodis pv. Citri e obtenção de mutantes por deleção com a finalidade de se estudar a função dos mesmos na bactéria

A Rede Molecular de Biologia Estrutural é um projeto que envolve 15 grupos de pesquisa no Estado de São Paulo, financiado pela FAPESP , e que tem como objetivo, capacitar pesquisadores na área de Biologia Estrutural e Química de Proteínas. Este projeto têm colaboração do Laboratório Nacional de Luz Síncroton, em Campinas
 O trabalho consiste na clonagem, expressão e purificação de proteínas de natureza microbiana para, em seguida, usando técnicas como Cristalografia, Ressonância Nuclear Magnética e Dicroísmo Circular, resolver as estruturas tri-dimensionais destas. Quatro proteínas foram escolhidas: proteína Ligadora de Oligopeptídeos de (OppA) Xanthomonas axonopodis pv Citri, as proteínas do Vírus do Papiloma Humano E6 e E7 e a região globular da fibra curta do Adenovírus. Todas estas proteínas apresentam-se como temas de estudo de outros projetos em andamento no nosso laboratório ou em laboratórios do ICB-2 (USP) portanto, a resolução da estrutura destas proteínas trará, sem dúvida, uma série de informações relevantes para a função e mecanismos de atuação de cada uma.

O projeto baseou-se no estudo de mutantes que produziam um fator capaz de alterar a expressão gênicae a recombinação em Aspergillus nidulans.