Marcelo Santos da Silva.

Curso online gratuito de Bioquímica destinado a até 200 alunos provenientes de qualquer instituição de ensino do país. O curso, que tem a finalidade de estimular o ingresso de estudantes na pesquisa científica, consiste de vídeos, discussões e atividades online empregando técnicas atuais de Bioquímica e Biologia Molecular.

Curso pré-vestibular (comunitário e gratuito) visando sintetizar e transmitir de forma clara e objetiva o conteúdo do ensino médio exigido nos principais vestibulares do país. Público alvo são alunos de baixa-renda interessados em prestar exame vestibular visando aprovação em universidades públicas.

Pirofosfatos de inositol (e.g., IP7 e IP8) são metabólitos envolvidos em uma ampla gama de processos celulares, como recombinação homóloga, patogenicidade microbiana, entre outros. Contudo, o mecanismo de ação e o envolvimento destes metabólitos em possíveis vias espécie-específicas ainda são questões abertas. IP7 e IP8 são sintetizados por meio de vias complementares que envolvem as quinases IP6K e PP-IP5K, respectivamente. Parasitos tripanossomatídeos (ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae), como por exemplo Trypanosoma cruzi e Leishmania spp., possuem genes ortólogos para IP6K, mas os genes que codificam para PP-IP5K ainda não foram identificados no genoma destes organismos. Ou seja, aparentemente estes parasitos não sintetizam IP8 via PP-IP5K, o que os torna excelentes modelos para o estudo dos pirofosfatos de inositol. Curiosamente, resultados preliminares de nosso grupo evidencia que Bodo saltans (um organismo cinetoplastídeo de vida livre) possui um gene ortólogo a PP-IP5K com 42 de identidade em relação a PP-IP5K humana. Deste modo, o principal objetivo deste estudo é investigar se a ausência hipotética de PP-IP5K é mutuamente exclusiva em relação ao parasitismo desenvolvido por alguns organismos dentro da ordem Kinetoplastida. Para isso, realizamos análises in silico usando as quinases IP6K e PP-IP5K para confirmar a suposta ausência de PP-IP5K. Utilizando os softwares MUSCLE, TRIMAL, PHYML, MEGA X e HMMER, reconstruímos árvores filogenéticas e obtivemos evidências preliminares que apontam para a ausência de ortólogos de PP-IP5K em todos os tripanossomatídeos, exceto Paratrypanosoma confusum. Predições das estruturas terciárias sugerem que o domínio catalítico da PP-IP5K de P. confusum, embora tenha 44 de identidade com a PP-IP5K humana, possui uma estrutura incomum, o que coloca sua anotação em xeque. Estes achados preliminares sugerem que a transição de um estilo de vida livre para um estilo de vida parasitário resultou na perda de PP-IP5K. Os próximos passos para atingir o objetivo deste projeto envolvem a inclusão do gene da PP-IP5K de Bodo saltans (BsPP-IP5K) em T. cruzi e Leishmania spp. utilizando plasmídeos específicos (knock-in episomal). Alternativamente, poderemos utilizar o sistema CRISPR/Cas9 para introduzir o gene BsPP-IP5K em um locus gênico constitutivo (por exemplo #946;-tubulina). Após confirmação por PCR, qPCR e western blot, realizaremos diluições clonais para seleção de populações homogêneas. Em seguida, pretendemos realizar uma caracterização fenotípica das linhagens geradas, e.g., avaliar a presença de IP8, proliferação e ciclo celular, além de avaliar a capacidade infectiva e reparo de DNA utilizando células hospedeiras selvagens (WT) e knockout (KO) para PP-IP5K. Os ensaios de infecção utilizando células hospedeiras KO para PP-IP5K permitirão avaliar se T. cruzi ou Leishmania utilizam IP8 do hospedeiro durante a infecção. Assim, este projeto irá esclarecer de maneira inédita se os PP-IPs têm alguma relação com o parasitismo desenvolvido por alguns cinetoplastídeos, contribuindo significativamente para a compreensão da função destes metabólitos que parecem ser importantes em diversas vias.

Pirofosfatos de inositol (PP-IPs) são um grupo especializado de moléculas envolvidas em diversos processos celulares, como por exemplo metabolismo de DNA. Contudo, o mecanismo de ação dessas moléculas ainda não está totalmente elucidado, mesmo em eucariotos modelos. As principais PP-IPs envolvidas nestes processos são as chamadas PP-IP4, IP7 e IP8, que são sintetizadas por vias que envolvem a participação das quinases IP6K e PP-IP5K. Parasitos tripanossomatídeos não possuem genes ortólogos para PP-IP5K, o que os impede de sintetizarem IP8, tornando-os excelentes modelos para o estudo de PP-IP4 e IP7. Assim, este projeto tem por objetivo investigar o mecanismo de ação destes PP-IPs nas principais vias de metabolismo de DNA, e.g., vias de reparo de DNA e manutenção telomérica, utilizando tripanossomatídeos como modelo. Para isso, linhagens de L. braziliensis e T. cruzi knockout (KO) para IP6K (IP6K-/-), telomerase (TERT-/-) e duplo-KO (IP6K-/- + TERT-/-) serão geradas utilizando o sistema CRISPR-Cas9. Após confirmada a ausência de IP7 e da atividade de telomerase nas linhagens correspondentes, estas serão desafiadas com diferentes agentes genotóxicos e a capacidade de reparo de DNA e dinâmica telomérica serão analisadas. Além disso, utilizando uma abordagem audaciosa, moléculas de IP7 e PP-IP4 serão sintetizadas in vitro com a porção β-fosfato marcada. Estas moléculas serão utilizadas em reações de pirofosforilação, com o objetivo de rastrear os principais alvos do pirofosfato relacionados ao metabolismo de DNA utilizando pull-down e espectrometria de massas. Após a identificação desses alvos, será realizado um estudo aprofundado visando compreender melhor a função desempenhada pela pirofosforilação nesses componentes. Assim, este projeto permitirá, de maneira inédita, elucidar o mecanismo de ação dos PP-IPs nas principais vias de metabolismo de DNA, contribuindo significativamente para a compreensão desta ainda pouco conhecida e importante forma não-enzimática de modificação pós-traducional.

DNA replication is a biological process of paramount importance, mainly because it drives the propagation of all living organisms, being the basis of genetic inheritance. The earliest step of DNA replication is the establishment of origins, which are defined as genomic loci where DNA synthesis initiates, being preceded by the binding of a replication initiation factor. The binding of the initiator establishes replication initiation by the recruitment and activation of the replisome. In prokaryotes, a single initiator binds each origin, whereas in eukaryotes a six-protein origin recognition complex, termed Origin Recognition Complex (ORC), play this function in conjunction with a related factor called Cdc6. The evolutionary pathways that led eukaryotes to evolve a multisubunit initiator are unknown, as well as the roles played by each ORC subunit. One way to address this is to functionally characterize ORC from a diverged eukaryote since most studies to date have been limited in phylogenetic breadth. Trypanosoma brucei, a unicellular eukaryote parasite with peculiar genetic tools, provides a means to tackle this question. Sequence?based searches failed to identify ORC components in T. brucei, but biochemical approaches have now described four putative ORC subunits (ORC1/CDC6, ORC4, Tb3120, and Tb7980). At least two are present in a high molecular complex and all act in nuclear DNA replication, but each one displays considerable sequence divergence from ?model? ORC subunits. Moreover, another ORC-like replication factor (ORC1B) has been identified as a non-static constituent of ORC, displaying highly unusual S-phase restricted nuclear localization or expression, suggesting a possible new model to regulate the replication. These findings raise questions about the constitution and mode of action of ORC in T. brucei that may shed light on ORC evolution, which may provide a route for future drug development. Thus, this project aims to determine the complete architecture of ORC in T. brucei, comparing it to previously published structures from humans and Drosophila. To achieve this aim, we will perform immunoprecipitation (IP) of native ORC from T. brucei followed by cryo-electron microscopy (cryo-EM) and single-particle analysis (SPEM). Additionally, we will co-express and purify the known T. brucei ORC components, and use cryo-EM to ask how these interact, comparing them with known ORCs. Of note, cryo-EM and SPEM applied to determine structures with high resolution (< 4Å) from IP is a labor-intensive technique still not very widespread in Brazil, which makes this project an excellent opportunity to bring this approach to my host country and apply it to other trypanosomatids that cause endemic diseases, such as Chagas disease.

Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado, pertencente à família Trypanosomatidae, e agente etiológico da doença de Chagas, uma doença neglicenciada que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. Para sobreviver, este parasito necessita replicar adequadamente seu DNA e isso envolve a ação coordenada de um complexo de variadas proteínas. A replicação do DNA inicia-se com o licenciamento de uma maquinaria de pré-replicação (pré-RC) em regiões específicas do DNA denominadas origens de replicação. A dinâmica e as proteínas envolvidas na maquinaria pré-RC ainda não estão bem definidas nos tripanosomatídeos. Deste modo, pretendemos identificar e caracterizar possíveis interatores da proteína TcOrc1/Cdc6, a qual é responsável pelo reconhecimento e ativação de origens de replicação em T. cruzi. Para tal, pretendemos realizar ensaios de captura (imunoprecipitação e co-imunoprecipitação), identificar os possíveis interatores em SDS-PAGE e espectrômetro de massas, e confirmar suas funções na replicação através de knockout em T. cruzi. Em paralelo, pretendemos realizar ensaios de pull down utilizando TcOrc1/Cdc6 recombinante marcada com diferentes tags (6xHis e Maltose Binding Protein - MBP) para verificar se esta proteína oligomeriza. Em caso positivo, esta oligomerização será confirmada in vitro por ultracentrifugação analítica e in vivo utilizando parasitas transfectados com Orc1/Cdc6 contendo diferentes caudas. Além disso, pretendemos também avaliar o quanto os processos de metabolismo de DNA (transcrição e reparo) influenciam a taxa de replicação em T. cruzi. Para isto iremos inibir a transcrição (utilizando &#945;-manitina) e causar danos no DNA (utilizando radiação U.V. e tratamento com H2O2) e verificar, através da técnica denominada SMARD (Single Molecule Analisys of Replicated DNA), se a taxa de replicação das forquilhas é alterada. Vale ressaltar que este conhecimento poderá auxiliar futuras estratégias antiparasitárias, já que a replicação do DNA está diretamente relacionada à manutenção cromossômica e viabilidade celular.

A leishmaniose é um espectro de doenças causado por parasitas do gênero&#10;Leishmania, afligindo mais de 15 milhões de pessoas e apresentando outras 350&#10;milhões em regiões de risco. No Brasil, a doença afeta seres humanos e ocorre em&#10;todas as regiões do país com predominância de casos nas regiões Norte e&#10;Nordeste. A infecção ocorre durante a picada de mosquitos flebotomíneos&#10;infectados, no momento da hematofagia. Para sobreviver, os parasitas precisam&#10;superar inúmeras barreiras, dentre as quais estão a exposição à ROS e RNS. Para&#10;superar estas barreiras os parasitas dispõem de diversos mecanismos, como as&#10;maquinarias de reparo a danos ao DNA e manutenção dos telômeros, sendo que&#10;ambas estão interconectados devido à utilização em comum de diversas proteínas.&#10;As proteínas teloméricas podem regular a atividade da telomerase e manter a&#10;estabilidade dos telômeros. Dentre estas proteínas encontra-se LaRPA-1, a proteína&#10;alvo deste estudo, que cumpre importante papel em ambas as maquinarias citadas.&#10;Nosso objetivo é estudar a dinâmica de interações desta proteína frente a diferentes&#10;concentrações subletais de H2O2, responsáveis diretos por danos ao DNA&#10;telomérico. Verificaremos possíveis alterações nas interações entre LaRPA-1 e suas&#10;parceiras (por ex: LaRbp38 e telomerase) usando ensaios de imunoprecipitação e&#10;pull down, suas co-localizações subcelulares por imunofluorescência indireta (IF),&#10;alterações na expressão do gene e da proteína utilizando PCR em Tempo Real e&#10;Western blot, respectivamente. As misturas de proteínas capturadas por pull down&#10;também serão analisadas por espectrometria de massa para identificação de novos&#10;fatores de interação. Possíveis alterações no tamanho do DNA telomérico (3?G&#10;overhang) serão verificadas através de técnicas modernas, que serão desenvolvidas&#10;em organismos modelo (S. cerevisiae, C. glabrata) para posterior aplicação em L.&#10;amazonensis em diferentes condições de estresse. Esta atividade será realizada em&#10;colaboração com a Dra. Maria Teresa Teixeira do Institut de Biologie PhysicoChimique no Centre National de Recherche Scientifique (CNRS), Paris, França. O&#10;conhecimento contido nesse projeto poderá facilitar a descoberta de novos alvos&#10;antiparasitários e auxiliar a busca de futuras estratégias no tratamento da&#10;leishmaniose.

A leishmaniose é uma doença causada por parasitas do gênero Leishmania, afligindo mais de 15 milhões de pessoas e apresentando outras 350 milhões em regiões de risco. No Brasil, a doença afeta seres humanos e ocorre em todas as regiões do país com predominância de casos nas regiões Norte e Nordeste. A infecção ocorre durante a picada de mosquitos flebotomíneos infectados, no momento da hematofagia. Para sobreviver, os parasitas precisam superar inúmeras barreiras, dentre as quais estão a exposição à ROS e RNS. Para superar estas barreiras os parasitas dispõem de diversos mecanismos, como as maquinarias de reparo a danos ao DNA e manutenção dos telômeros, sendo que ambas estão interconectados devido à utilização em comum de diversas proteínas. As proteínas teloméricas podem regular a atividade da telomerase e manter a estabilidade dos telômeros. Dentre estas proteínas encontra-se LaRPA-1, a proteína alvo deste estudo, que cumpre importante papel em ambas as maquinarias citadas. Nosso objetivo é estudar a dinâmica de interações desta proteína frente a diferentes concentrações subletais de H2O2, responsáveis diretos por danos ao DNA telomérico. Verificaremos possíveis alterações nas interações entre LaRPA-1 e suas parceiras (por ex: LaRbp38 e telomerase) usando ensaios de imunoprecipitação e pull down, suas co-localizações subcelulares por imunofluorescência indireta (IF), alterações na expressão do gene e da proteína utilizando PCR em Tempo Real e Western blot, respectivamente. Possíveis alterações no tamanho do DNA telomérico serão verificadas por Southern blot não desnaturante. As misturas de proteínas capturadas por pull down também serão analisadas por espectrometria de massa para identificação de novos fatores de interação. Esse conhecimento poderá facilitar a descoberta de novos alvos antiparasitários e auxiliar na busca de futuras estratégias no tratamento da leishmaniose.

Telomeres are specialized structures at the end of chromosomes essential for maintaining genome&#10;stability and cell viability. The importance of telomeric proteins for telomere maintenance has increased our interest in the identification of homologues within the genus Leishmania. The mammalian TRF1 and TRF2 proteins, for example, bind double-stranded telomeres via a Myb-like DNA-binding domain and are involved with telomere length regulation and chromosome end protection. In addition, TRF2 can modulate the activity of several enzymes and influence the conformation of telomeric DNA. In this work, we identified and characterized a Leishmania protein (LaTRF) homologous to both mammalian TRF1 and TRF2. LaTRF was cloned using a PCR-based strategy. ClustalW and bl2seq sequence analysis showed that LaTRF shared sequence identity with the Trypanosoma brucei TRF (TbTRF) protein and had the same degree of sequence similarities with the dimerization (TRFH) and the canonical DNA-binding Myb-like domains of both mammalian TRFs. LaTRF was predicted to be an 82.5 kDa protein, indicating that it is double the size of the trypanosome TRF homologues. Western blot and indirect immunofluorescence combined with fluorescence in situ hybridization showed that LaTRF, similarly to hTRF2, is a nuclear protein that also associates with parasite telomeres. Native and full length LaTRF and a mutant bearing the putative Myb-like domain expressed in bacteria bound double-stranded telomeric DNA in vitro. Chromatin immunoprecipitation showed that LaTRF interacted specifically with telomeres in vivo. The nuclear localization of LaTRF, its association and co-localization with parasite telomeres and its high&#10;identity with TbTRF protein, support the hypothesis that LaTRF is a Leishmania telomeric protein.