Patricia Pereira Coltri.

O processamento de RNA é uma etapa fundamental para o controle da expressão gênica em células eucarióticas. Dados recentes da literatura associaram problemas no splicing de pré-mRNAs com o desenvolvimento de diferentes doenças, como o câncer e doenças neurodegenerativas. Além de mutações em sequências que codificam genes importantes para estas doenças, alterações em proteínas que se ligam aos mRNAs podem causar grandes mudanças fenotípicas. Mais de 95 dos genes humanos são formados por exons, sequências codificadoras que permanecem no mRNA maduro, e introns, que são removidos ao longo do processamento pelo splicing. Em muitos casos, o mesmo gene pode gerar diferentes mRNAs, por meio do splicing alternativo. O splicing é executado pelo spliceossomo, uma grande maquinaria ribonucleoproteica formada por 5 snRNAs e mais de 100 proteínas. A regulação do splicing depende da atividade de proteínas de ligação a RNAs, responsáveis por mediar a interação entre RNAs e destes com proteínas. Neste sentido, o splicing e a atividade das proteínas regulatórias, como as hnRNPs, são importantes alvos terapêuticos. O controle exercido por estas proteínas pode alterar o fenótipo das células, e promover características que desenvolvam ou não determinadas doenças. Desta forma, a hipótese deste projeto é que a geração de transcritos que podem levar ao desenvolvimento de doenças possa ser controlada com a modulação da associação de proteínas ligadoras de RNA às sequências-alvo nos pré-mRNAs. Para investigar esta hipótese, pretende-se desenhar oligos de RNA para as proteínas hnRNP A1, hnRNP K, hnRNP M e TDP43, e verificar o splicing alternativo de genes importantes para o desenvolvimento de tumores, incluindo genes que abrigam miRNAs oncogênicos. Além disso, pretende-se investigar se o uso destes oligos modula a localização subcelular das proteínas e a cinética celular. Por meio de análises de sequenciamento de RNA e espectrometria de massas, pretende-se investigar se o tratamento com estes oligos pode alterar a função das proteínas. O desenvolvimento deste projeto permitirá continuar a linha de pesquisa sobre a regulação do splicing, incluindo novas ferramentas como abordagens terapêuticas importantes para controle de doenças associadas ao RNA. Espera-se que os resultados também contribuam para aumentar o conhecimento sobre mecanismos básicos de atividade destas proteínas.

O splicing é um processo essencial durante a expressão gênica em eucariotos. Os pré-RNAs tem seus introns removidos e exons ligados graças à atividade do spliceossomo. Este é um grande complexo ribonucleoprotéico de ~2 MDa, composto por 5 pequenos RNAs nucleares (snRNAs) e mais de 100 proteínas. Mutações ou alterações no reconhecimento dos sítios de splicing ou em componentes do spliceossomo podem causar diferentes doenças, entre as quais o câncer. Neste sentido, o spliceossomo emerge como um importante alvo terapêutico. No genoma humano, mais de 70 dos miRNAs estão em introns e destes, muitos estão envolvidos com o câncer. Resultados obtidos por nosso grupo de pesquisa revelaram que proteínas do grupo das hnRNP estão especificamente associadas aos spliceossomos formados em introns contendo os miRNAs intrônicos 18a e 19a. A hipótese deste projeto é que as hnRNPs, especialmente hnRNP C, K, M e U, participem ativamente da regulação do splicing em introns que contém miRNAs. De fato, muitos miRNAs intrônicos envolvidos no câncer possuem sítios para ligação destas proteínas. Para testar esta hipótese, investigaremos se o aumento e/ou redução destas proteínas modulam o splicing de miRNAs intrônicos associados com o câncer. Além disso, pretende-se investigar os efeitos de compostos inibidores do splicing no processamento destes miRNAs. Estes experimentos serão combinados com ensaios de cinética celular, avaliando a tolerância e sensibilidade das células à estes compostos. Espera-se que caso as proteínas interfiram no splicing, o processamento dos miRNAs oncogênicos, e consequentemente, as suas atividade, sejam alteradas. Além disso, se nossa hipótese estiver correta, a presença do inibidor poderá impedir ou retardar a produção destes miRNAs. Em um contexto geral, os resultados deste trabalho contribuirão para compreender os mecanismos de regulação do splicing, especialmente no caso de doenças como o câncer, bem como o papel de inibidores deste processo no tratamento, dando continuidade à linha de pesquisa do laboratório.

O splicing é um processo fundamental para o controle da expressão gênica. Os pre-RNAs tem seus introns removidos e exons ligados devido à atividade do spliceossomo. O spliceossomo é um grande complexo ribonucleoprotéico de cerca de 2 MDa, composto por 5 snRNAs (small nuclear RNAs) e mais de 100 proteínas. A atividade catalítica do spliceossomo depende do rearranjo estrutural entre os RNAs e entre RNAs e proteínas. Mutações nos sítios de splicing ou em componentes do spliceossomo podem levar ao desenvolvimento de diferentes doenças, entre as quais estão atrofia muscular, autismo e diferentes tipos de câncer. Neste sentido, o spliceossomo pode ter um importante papel terapêutico. No genoma humano, cerca de 70 dos microRNAs (miRNAs) estão em introns. Análises recentes de espectrometria de massas de nosso grupo de pesquisa revelaram que algumas proteínas são especificamente recrutadas para spliceossomos formados em introns contendo os miRNAs 18a e 19a. Estes miRNAs fazem parte do cluster miR17-92, cuja transcrição está aumentada em diversos tipos de câncer. A nossa hipótese de trabalho é que algumas proteínas especificamente detectadas na presença dos miRNAs, regulem a atividade do spliceossomo e a maturação dos miRNAs 18a e 19a. Para testar a previsão de nossa hipótese, uma série de experimentos serão combinados, nos quais estas proteínas serão super-expressas e silenciadas nas células. Espera-se que caso as proteínas interfiram no splicing, a transcrição e atividade dos miRNAs responda às alterações no nível de proteínas. Pretende-se investigar, ainda, se a presença de um fármaco inibidor do splicing altera a maturação destes miRNAs. Espera-se que, se nossa hipótese estiver correta, a presença do inibidor impeça a produção destes miRNAs. Em um contexto geral, os resultados deste trabalho contribuirão para compreender os mecanismos de regulação do splicing e ativação do spliceossomo em diferentes transcritos.

Em eucariotos, o splicing é um processo essencial para o controle da expressão gênica. O processo de splicing consiste na remoção de introns e ligação de exons em sequências maduras. O splicing ocorre no spliceossomo, um grande complexo ribonucleoprotéico de cerca de 4 MDa, composto por 5 snRNAs (small nuclear RNAs) e mais de 100 proteínas. A atividade catalítica do complexo depende de uma série de rearranjos estruturais que envolvem interações entre RNAs e destes com proteínas. Até recentemente a composição de proteínas do spliceossomo era considerada idêntica em todos os transcritos precursores. No entanto, a variação observada no splicing de diferentes transcritos pode indicar que o spliceossomo apresente composições protéicas diferentes. É possível supor, desta maneira, que diferentes transcritos recrutem proteínas específicas, que poderiam regular a atividade desta maquinaria e o processo de splicing. Muitos transcritos precursores em eucariotos abrigam em seus introns seqüências não codificadoras importantes para o controle e regulação da expressão gênica e manutenção celulares. Alterações na transcrição ou processamento destas seqüências podem levar ao desenvolvimento de diversas doenças, incluindo alguns tipos de tumores. Neste projeto, pretende-se investigar como ocorre o splicing em introns que contém pequenos RNAs nucleolares e RNAs não codificadores. Para isso, proteínas especificamente recrutadas para estes transcritos durante o splicing serão identificadas e caracterizadas. Pretende-se investigar de que maneira estas proteínas atuam no complexo e na ativação do splicing. Em um contexto geral, os resultados deste trabalho contribuirão para compreender os mecanismos de regulação do splicing e ativação do spliceossomo em diferentes transcritos, estabelecendo uma nova linha de pesquisa.

Em eucariotos, o splicing é um processo essencial para o controle da expressão gênica. O processo de splicing consiste na remoção de introns e ligação de exons em sequências maduras. O splicing ocorre no spliceossomo, um grande complexo ribonucleoprotéico de cerca de 4 MDa, composto por 5 snRNAs (small nuclear RNAs) e mais de 100 proteínas. A atividade catalítica do complexo depende de uma série de rearranjos estruturais que envolvem interações entre RNAs e destes com proteínas. Até recentemente a composição do spliceossomo era considerada idêntica em todos os transcritos precursores. No entanto, a variação no splicing de diferentes transcritos pode indicar que o spliceossomo apresente composições protéicas diferentes. É possível supor, desta maneira, que diferentes transcritos recrutem proteínas específicas, que poderiam regular a atividade desta maquinaria e o processo de splicing. Muitos transcritos precursores em eucariotos abrigam em seus introns inúmeras seqüências não codificadoras importantes para o controle e regulação da expressão gênica e manutenção celulares. Alterações na transcrição ou processamento destas seqüências podem levar ao desenvolvimento de diversas doenças, incluindo alguns tipos de tumores. Neste projeto, pretende-se investigar como ocorre o splicing em introns que contém snoRNAs (pequenos RNAs nucleolares). Para isso, proteínas especificamente recrutadas para estes transcritos serão identificadas e caracterizadas. Pretende-se investigar de que maneira estas proteínas atuam no complexo e na ativação do splicing. Além disso, serão investigadas a localização destas proteínas e sua interação com o RNA precursor. Em um contexto geral, os resultados deste trabalho contribuirão para compreender os mecanismos de regulação do splicing e ativação do spliceossomo em diferentes transcritos.

A maquinaria de síntese ribossomal e de processamento dos RNAs mensageiros é conservada em eucariotos. Os RNAs ribossomais são transcritos no nucléolo e passam por modificações covalentes além de extenso processamento endo- e exonucleolítico, que envolve a associação de mais de 150 proteínas aos precursores e são essenciais para o sucesso da atividade ribossomal. Os precursores de RNAs mensageiros também passam por várias etapas de processamento, incluindo splicing. O splicing ocorre no spliceossomo, um grande complexo ribonucleoprotéico de 4,9 MDa, e depende de sinais específicos localizados nos introns. Cerca de 120 proteínas fazem parte deste complexo e têm papel fundamental na dinâmica e na sua atividade. O processamento destes RNAs é dependente de uma série de proteínas e pode interferir diretamente na expressão gênica. Cwc24p é uma proteína nuclear de 30 kDa isolada em um complexo associado ao spliceossomo. Na ausência de Cwc24p o splicing de genes relacionados a snoRNAs de C/D box fica comprometido, especialmente o dos genes snR17A e snR17B, que codificam as duas formas do snoRNA U3. O complexo snoRNP U3 é responsável pelas clivagens iniciais do precursor de pré-rRNA 35S nos sítios A0, A1 e A2. Cepas deficientes para Cwc24p também apresentam acúmulo do pré-rRNA 35S. Estes resultados indicaram que Cwc24p atua em ambos os processos, entretanto o mecanismo de associação com o pré-snoRNA U3 ainda é desconhecido. Desta maneira, neste projeto pretende-se investigar a associação de Cwc24p com o complexo de splicing do pré-snoRNA U3. Além da interação com proteínas envolvidas no splicing, pretende-se verificar a participação desta proteína na formação do spliceossomo em S. cerevisiae. Serão também desenvolvidos experimentos para caracterizar o papel da ortóloga humana, ZNF183, no processamento do rRNA e no splicing em células de mamíferos.

Em eucariotos a regulação da expressão gênica envolve o processamento pós-transcricional de precursores de mRNA. O processo de splicing ocorre no spliceossomo, uma grande molécula ribonucleoprotéica de 4,9 MDa, e gera um mRNA maduro. A maturação do mRNA ocorre em duas reações coordenadas de trans-esterificação. O processo depende do reconhecimento de sítios específicos nos introns pelo spliceossomo. A montagem do spliceossomo funcional ocorre a partir de uma série de interações dinâmicas entre os U snRNAs e proteínas específicas. A caracterização bioquímica e funcional deste grande complexo e do processo de splicing requer dados estruturais detalhados. Entretanto, o estudo estrutural do spliceossomo é dificultado principalmente devido à quantidade limitada de material que pode ser isolada a partir de células eucarióticas. O modelo do complexo C a 30Å obtido por eletromicroscopia permite visualizar uma molécula com três subunidades e uma grande cavidade central, que pode estar relacionada ao centro catalítico do spliceossomo. Para relacionar este modelo estrutural à função do spliceossomo são necessários estudos detalhados sobre sua composição. Neste projeto, pretende-se contribuir para uma melhor compreensão desse importante componente celular, através da identificação das proteínas expostas, visualizadas no modelo, e da determinação de sua localização na estrutura do complexo. Por meio de análises de espectrometria de massas, pretende-se determinar a estequiometria das proteínas identificadas e sua acessibilidade na superfície do complexo. Com os resultados obtidos será possível compreender melhor a arquitetura do spliceossomo, bem como as interações entre seus componentes estruturais.

A síntese de ribossomos é um processo conservado em eucariotos e se inicia com a transcrição dos rRNAs no nucléolo. Mais de 170 fatores atuam de forma transitória no processamento dos precursores para gerar os rRNAs maduros que formarão as subunidades ribossomais no citoplasma. Entre as proteínas envolvidas na síntese de ribossomos está a Nip7p, uma proteína nucleolar de 21 kDa associada ao complexo pré-60S em Saccharomyces cerevisiae. Nip7p é conservada e possui ortólogas em eucariotos e em Archaea. A análise da seqüência primária revela a presença de um domínio conservado na região C-terminal, denominado PUA, encontrado em diversas proteínas associadas a modificações no RNA. A estrutura tri-dimensional de PaNip7, ortóloga de Nip7p em Pyrococcus abyssi foi resolvida por difração de raios-X até 1,8Å de resolução, utilizando o método SIRAS. Comparação estrutural seguida por ensaios in vitro confirmaram o envolvimento do domínio PUA na interação com RNA. Além disso, tanto Nip7p como suas ortólogas PaNip7 e HsNip7 interagem com seqüências ricas em uridina, indicando que atuam de forma semelhante no processamento do rRNA. Análise funcional de primer extension comprovou que ocorre um bloqueio no processamento da região espaçadora ITS2 na ausência de Nip7p. Nip7p interage com várias proteínas do complexo pré-60S, entre as quais Nop8p e Nop53p, ambas associadas ao processamento do pré-27S.A ortóloga humana de Nip7p, HsNip7, interage também com as proteínas FTSJ3 e SUMO-2. HsNip7 e FTSJ3 colocalizaram na região nucleolar de células HEK293.