Fabiana Fernandes Bressan.

Projeto de extensão nas aldeias indígenas Krucutu e Morro da Saudade/SP. Ações preventivas, informativas e imunizações de cães e gatos. Projeto pelo Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.

Toxocaríase em cães e seres humanos da comunidade do Jd. São Remo, São Paulo (SP). Aspectos epidemiológicos, fatores de risco e potencial zoonótico da população canina. Projeto pelo Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. 26h. 2001.

2a fase da Campanha Nacional de Vacinação (coordenadora de posto)/SUS

A reprogramação nuclear de uma célula somática a um estado embrionário apresenta diversas aplicações, como pesquisas básicas na biologia do desenvolvimento, aplicações médicas em terapia celular, melhoramento genético na agropecuária e conservação de espécies. As principais técnicas utilizadas na reprogramação nuclear são a transferência nuclear de células somáticas (TNCS) e a geração de células tronco induzidas (iPS). Muitos trabalhos tem mostrado uma baixa eficiência no processo de reprogramação nuclear nas duas técnicas, além disso, modificações epigenéticas tem sido apontadas como a principal barreira para uma reprogramação nuclear eficiente, sendo que a desregulação dos genes imprinted e a compactação da cromatina estão entre as prováveis causas. As principais modificações epigenéticas são a metilação do DNA e modificações pós-traducionais das histonas, como acetilação e metilação. Recentemente, a descoberta de mais uma modificação epigenética, a 5-hidroximetilcitosina (5hmC), relacionada ao mecanismo ativo de desmetilação do DNA, oferece uma nova abordagem no entendimento dos mecanismos envolvidos na reprogramação nuclear. Este trabalho propõe investigar o efeito dos agentes modificadores da cromatina Ácido β-Hidroxibutírico (BOHB) e UNC0638 sopbre o epigenoma celular e consequências na reprogramação nuclear. O objetivo deste projeto é, através da manipulação do epigenoma celular in vitro, proporcionar uma maior acessibilidade dos fatores de reprogramação ao genoma celular, aumentando assim a eficiência da reprogramação in vitro por TNCS ou indução gênica à pluripotência. O estabelecimento de novas estratégias para aumentar a eficiência das principais técnicas de reprogramação é importante não somente para a ciência básica, mas também para a produção animal por possibilitar uma maior eficiência na produção de animais clonados. Também, deve contribuir para o surgimento de novas abordagens terapêuticas, como o uso de metabólitos endógenos ou probes químicas, visando a produção efetiva de células-tronco autólogas reprogramadas in vitro ou mesmo a produção animal a partir de tais células.

É conhecido que CTEs e iPS humanas precisam de bFGF mas não LIF enquanto que CTEs e iPS murinas precisam de LIF mas não bFGF para a manutenção da pluripotência in vitro. O estágio "naive" é representado pela massa celular interna do embrião pré-implantação, exemplificado pelas CTEs murinas, e o estágio "primed" pelo epiblasto pós-implantação e CTEs humanas (Nichols & Smith 2009; Ware et al. 2014). Em iPS de outras espécies, o mecanismo de ação das vias de diferenciação/manutenção de pluripotência como JAK/STAT e MAPK, por exemplo, não é bem conhecido. Em experimentos anteriores, pode ser observado em nosso laboratório que a adição de LIF ou inibidores das vias MEK e GSK3 (PD0325091 e CHIR99021, ou 2i) não influenciou positivamente na produção de colônias reprogramadas em bovinos ou suínos (dados não publicados). Em outro estudo recente em suínos foi reportado que o uso de tais inibidores não se mostraram benéficos para a reprogramação (Petkov et al. 2014). Nesta proposta será utilizado o modelo suíno para a produção de células iPS com e sem suplementação de bFGF, LIF e 2i, em delineamento multifatorial. Além da eficiência de reprogramação serão analisadas possíveis vias de sinalização pós reprogramação nestas condições através do perfil de miRNA em busca de vias metabólicas que caracterizem células naive ou primed nas diferentes condições. A geração e estabelecimento destas células possibilitará os experimentos subsequentes com geração de células germinativas, gametas e análise de sua funcionalidade (responsável pela bolsa de IC).

Em 2006, Takahashi e colaboradores demonstraram ser possível a obtenção de células-tronco pluripotentes por indução gênica (induced pluripotent stem cell, iPSC). Desde o surgimento desta técnica muito já foi desenvolvido. Diversos modelos animais foram gerados, ampliando ainda mais as possibilidades na pesquisa. Esses permitem a criação de modelos para doenças genéticas humanas, por exemplo, esclerose lateral amiotrófica, autismo, esquizofrenia, doença de Parkinson e Alzheimer e o aprimoramento de características relevantes para produção animal. Nesse sentido, o modelo suíno já é considerado vantajoso sobre os outros modelos animais disponíveis. Os métodos iniciais com que células diferenciadas foram induzidas ao estado de pluripotência se baseavam em um sistema integrativo com vetores virais, permanentemente alterando o genoma. Tais métodos podem produzir mutações que interferam com a função das células produzidas e a expressão residual dos transgenes pode influenciar na função, tumorgenicidade e na diferenciação das células. Métodos alternativos à utilização de vírus são almejados pela segurança que fornece na indução à pluripotência por não ser um sistema integrativo. O vetor epissomal é baseado no em plasmídeo no qual são inseridos os genes EBNA1 e a sequência OriP do herpesvírus Epstein-Barr (EBV), permitindo-o a sua replicação extracromossomal. Ainda o vetor epissomal é espontaneamente e gradualmente eliminado das células. Reconhecendo as vantagens que o modelo suíno traz a pesquisa nas diferentes áreas da biomedicina e agropecuária, e a importância e necessidade de mais estudos na reprogramação de células pluripotentes induzidas, este projeto tem como objetivo a realizar a diferenciação de fibroblastos suínos em iPS pelo uso de vetores epissomais e a subsequente diferenciação induzida in vitro em células progenitoras neurais (responsável pela bolsa de mestrado).

Considerando a importância e necessidade de mais estudos na reprogramação de células pluripotentes induzidas em animais de grande porte, são propostos neste projeto: 1) A padronização do protocolos reproduzíveis de geração de iPS suínas seguras à terapia celular, 2) A geração in vitro em células progenitoras neurais a partir das iPS, e 3) a geração in vitro de células germinativas primordiais capazes de gerar gametas funcionais a partir de iPS. É esperada com a realização desta proposta a consolidação da pesquisa nacional na temática reprogramação celular em modelos animais, com ênfase na modelagem de doenças e diferenciação celular in vitro a serem utilizadas nas medicinas humana e veterinária

A manipulação da reprogramação celular é uma ferramenta importante para o entendimento da biologia celular de células pluripotentes e para o estudo de diferentes doenças teciduais ou genéticas, possibilitando a investigação dos eventos moleculares responsáveis pela competência celular à toti- e pluripotência. A presente proposta objetiva consolidar a tecnologia de produção de células reprogramadas pluripotentes e células germinativas in vitro em espécies de animais domésticos de interesse comercial ou biomédico (em especial bovinos e suínos), com ênfase tanto no aspecto técnico, com a disseminação de protocolos e material biológico para novos estudos e colaborações, como no aspecto científico, através da investigação dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos na reprogramação celular. São propostas 3 metas: 1) A padronização do protocolos reproduzíveis e seguros de geração de iPS animais, 2) A geração de gametas, células germinativas e embriões a partir de células cultivadas in vitro, e 3) A investigação dos mecanismos transcricionais e epigenéticos de reprogramação celular.

A presente proposta constitui a continuidade e a ampliação das atividades do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Células-Tronco e Terapia Celular, um dos Institutos Nacionais de Ciência e Tecnologia criados pelo CNPq/FAPESP em 2008.
Naquela oportunidade, propusemos o desenvolvimento de um extenso programa de pesquisas básicas e clínicas para entender, isolar, cultivar e usar terapeuticamente, tanto em modelos animais como em humanos, as células-tronco somáticas e pluripotentes. Aquele programa de pesquisa também previa o estudo de células-tronco neoplásicas, em particular as associadas às leucemias e aos linfomas.
Considerando a evolução do conhecimento científico sobre as células-tronco neoplásicas que culminaram na proposta de um novo modelo de oncogênese (1, 2) segundo o qual existem múltiplas subpopulações de células-tronco tumorais (CTTs) que exibem maior ou menor dominância na massa tumoral ao longo da evolução da doença, decidimos nesta proposta isolar, cultivar e caracterizar células tumorais individuais (single cell analysis) e estudar o microambiente tumoral com o objetivo de melhor compreender os mecanismos intrínsecos e extrínsecos que levam a gênese do câncer. Adicionalmente, pretendemos realizar um grande esforço para o desenvolvimento de terapias inovadoras contra o câncer, incluindo a imunoterapia e a nanomedicina, que deverão originar estudos pré-clínicos e clínicos em uma variada gama de neoplasias.

Biotecnologias reprodutivas como a produção in vitro de embriões e a transferência de núcleo exercem uma grande contribuição seja para correção de infertilidades, para o aumento na eficiência da produção animal ou mesmo para m melhor entendimento sobre os mecanismos envolvidos no desenvolvimento embrionário inicial. Porém, manipulações in vitro de gametas ou embriões levam a uma potencial alteração da regulação epigenética, podendo causar altas taxas de anormalidades no desenvolvimento e nascimento de indivíduos derivados. A geração de um modelo de indução da pluripotência in vitro, ou seja, a geração de células iPS (do inglês induced pluripotent stem cells) possibilitou estudar o processo de reprogramação in vitro de maneira robusta e precisa. Os genes OCT4 e SOX2 são fundamentais no processo de aquisição e manutenção da pluripotência celular, e recentemente foi reportado que a ação destes dois fatores exerce grande influência sobre a regulação de alguns genes imprinted, em especial, no locus H19/IGF2, sabidamente importantes para o desenvolvimento normal do embrião e sua placenta. A hipótese do estudo é de que os fatores de transcrição OCT4 e SOX2 atuam de modo a proteger o locus dos genes imprinted IGF2/H19 contra uma possível hipermetilação decorrente do processo de reprogramação celular. Desta maneira, este projeto propõe a geração de um modelo experimental onde os fatores em questão sejam estudados, juntos ou em combinação, quanto à sua influência na regulação do imprinting genômico. Espera-se aumentar a eficiência nas técnicas de reprodução assistida obtendo maior sucesso na reprogramação celular, e auxiliando também, portanto, no aprimoramento da medicina regenerativa e translacional (responsável pela bolsa de mestrado).

O cultivo e estudo células pluripotentes de origem embrionária permitiu avanços significativos tanto para a terapia celular aplicada quanto aos estudos de ciência básica. Porém, sua manipulação apresenta dificuldades quanto à sua obtenção e utilização como, por exemplo, pelas barreiras éticas e dificuldades imunológicas. Com a possibilidade de indução à pluripotência demonstrada por Kazutoshi Takahashi e Shinya Yamanaka novas possibilidades passaram a ser cogitadas e estudas. Células-tronco pluripotentes obtidas a partir de células diferenciadas de diversos tecidos capazes de serem diferenciadas em outros tecidos por indução gênica (Induced Pluripotent Stem Cell, iPSC) nos permite gerar tipos celulares relevantes que possibilitam a formação ou o reparo de tecido danificado e a geração de novos modelos in vitro de síndromes ou doenças.Infertilidade masculina e feminina afetam uma grande parte da população humana e animal em idade reprodutiva e recentemente foi mostrado que células-tronco embrionárias murinas, assim como iPSCs, podem derivar gametas femininos e masculinos funcionais, se tornando assim de grande interesse para uma possível terapia celular ou progresso nas biotecnologias reprodutivas. No entanto, este processo de reprogramação epigenética ainda é ineficiente por falhas na manutenção do imprinting genômico (genes expressos diferencialmente de acordo com a origem parental). Por isso, neste projeto estudaremos a indução às células germinativas primordiais (CGPs) e seu efeito na expressão dos genes imprinted H19 e o IGF2, sabidamente importantes para a reprogramação celular, essenciais para o desenvolvimento e placentário adequado (responsável pelas bolsas IC e BEPE.IC).

O recente progresso na área de estudos sobre o uso de células-tronco para fins terapêuticos, tanto na medicina humana quanto veterinária, abre a perspectiva de um crescente potencial no médio e longo prazo. Todavia, a área carece ainda do desenvolvimento de produtos que viabilizem sua aplicação em larga escala. Esse projeto tem por objetivo analisar a viabilidade Técnico-Científica do desenvolvimento de um Transportador de células-tronco para uso terapêutico. Atuando há mais de uma década no mercado de biotecnologia reprodutiva, a WTA vem demonstrando durante sua trajetória, uma alta capacidade de inovação. A empresa é responsável pelo desenvolvimento de diversos equipamentos destinados a logística de material biológico de origem animal, possuindo por isso, diversas patentes geradas a partir de suas atividades de pesquisa e desenvolvimento (P&D). O presente projeto será desenvolvido nos moldes do Transportador de Oócitos TO 16i® da WTA, cuja tecnologia inclui a utilização de sensores de temperatura de alta precisão e baterias que permitem uma autonomia de transporte que pode chegar a 24 horas. Assim, os estudos terão por objetivo analisar a viabilidade do desenvolvimento de um equipamento com compartimentos modulares que permitam sua adaptação futura para outras eventuais tecnologias, e, que sejam destinados a princípio, à alocação e transporte de bolsas de transferência contendo células-tronco para uso terapêutico, com capacidade de 300 ml cada. Todo o desenvolvimento do projeto terá por base a utilização de células terapêuticas de origem animal, visando a sua futura adaptação e utilização no campo clínico humano, razão pela qual o projeto conta com apoio e parceria do Hemocentro de Ribeirão Preto e do Centro de Terapia Celular - CEPID, ligado à Faculdade de Medicina Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo (FMRP-USP). Essa parceria permitirá com que as adaptações sigam as normativas ditadas pelas Resoluções RDC nº 20, de 10 de Abril de 2014, que dispõe sobre o regulamento sanitário para o transporte de material biológico; RDC nº 34, de 11 de Junho de 2014 que dispõe sobre as Boas Práticas no Ciclo do Sangue e RDC nº 56, de 16 de Dezembro de 2010 que dispões sobre o funcionamento de laboratórios de células progenitoras hematopoéticas (ANVISA, 2014; ANVISA, 2014; ANVISA, 2010).A metodologia definida utilizará células mesenquimais multipotentes oriundas de tecidos primários somáticos bovinos, obtidas de medula óssea, tecido adiposo e ainda, células mesenquimais multipotentes oriundas de cordão umbilical humano (após aprovação do CEP local e assinatura TCE das doadoras). Essas células serão utilizadas na condução de testes cujo objetivo será verificar a viabilidade, taxa de sobrevivência, manutenção das características imunofenotípicas, potencial de diferenciação e estabilidade cromossômica do material biológico, pós-transporte. Serão conduzidas avaliações após 12, 18 e 24 horas em temperaturas definidas na legislação sobre transporte de material biológico humano vigente, citado anteriormente.

A produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos é uma biotecnologia amplamente difundida no Brasil. Todavia o sistema de produção in vitro, embora viável tecnicamente, ainda provoca alterações celulares e moleculares nos oócitos e embriões, resultando em uma eficiência abaixo da desejável, com taxas que variam de 30 a 50% na produção embrionária. Assim, gerar metodologias que levem à maior conversão de oócitos a embriões e compreender os mecanismos que determinam a competência oocitária é de interesse estratégico para o mercado nacional de produção in vitro de embriões. O microambiente folicular e o metabolismo da célula oocitária são fundamentais para determinar a aquisição da competência pelo oócito. Experimentos avaliando rotas intracelulares ou intercelulares durante a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário serão conduzidas com objetivos finais de investigar mecanismos associados com a competência oocitária e de gerar incremento nas taxas de PIVE bovinos. A primeira estratégia de pesquisa terá foco no metabolismo oxidativo de lipídeos e atividade mitocondrial. Estudos prévios conduzidos por nosso grupo de pesquisas demonstraram deficiência em relação à migração e quantidade de mitocôndrias ativas e gotas lipídicas durante a maturação in vitro (MIV) comparado ao processo in vivo. Considerando que as mitocôndrias oocitárias são responsáveis pelo aporte energético até o estádio de blastocisto, e que a oxidação dos ácidos graxos nas mitocôndrias é o principal mecanismo celular responsável pelo fornecimento energético para o desenvolvimento oocitário e embrionário, a atividade de mitocôndrias e gotas lipídicas é determinante para o sucesso da PIVE. Há relatos de que substâncias moduladoras da beta-oxidação, como a L-carnitina e o bezafibrato, possam estimular o processo oxidativo e levar a incremento nas taxas da produção de embriões. Portanto, esta linha de experimentação visa comparar a atividade mitocondrial e o metabolismo lipídico entre a produção in vivo de embriões e a PIVE, bem como determinar o efeito da adição de moduladores da oxidação mitocondrial (L-carnitina e bezafibrato) durante a MIV nas taxas de produção in vitro. Para esse fim, (1) serão avaliadas tanto o comportamento lipídico e mitocondrial e a beta-oxidação, quanto fatores de estresse celular durante a maturação e desenvolvimento embrionário em sistemas in vivo e in vitro. A segunda e terceira estratégias de pesquisa terão foco nas rotas extracelulares de comunicação entre células do microambiente folicular. Será investigada a hipótese que proteínas presentes em vesículas secretadas por células (VSC) foliculares e presentes no líquido folicular (LF) e miRNAs presentes nas células do cumulus modulam a qualidade oocitária. Para este fim, (2) será feita a identificação e quantificação de proteínas no LF presentes em VSCs (microvesículas e exossomos) relacionando-as à competência oocitária; e (3) determinação do perfil dos miRNAs das células do cumulus correlacionando-os com a competência oocitária. Para os miRNAs relacionados ao potencial de desenvolvimento oocitário, testes funcionais serão realizados através da adição de replicadores (miRNA mimics) ou inibidores (miRNA inhibitors) destes miRNAs alvos, e posterior avaliação do efeito nas taxas de PIVE. A partir dos resultados deste projeto espera-se compreender os efeitos dos sistemas in vitro sobre a beta-oxidação e metabolismo lipídico-mitocondrial, bem como esclarecer os mecanismos de comunicação intercelular dentro no folículo ovariano, caracterizar o perfil de miRNAs nas células do cumulus, e identificar possíveis miRNAs e proteínas biomarcadores de qualidade oocitária. Ainda, espera-se desenvolver novas ferramentas para intensificar a produção in vitro de embriões bovinos, através do incremento na produção embrionária pela adição de moduladores da oxidação mitocondrial que não aumentem o estres

As células de pluripotência induzida (iPS) foram reportadas pela primeira vez em 2006 e desde então vem sendo extensivamente estudadas. Através da técnica, células somáticas adultas adquirem comportamento muito semelhante às células tronco embrionárias, reduzindo as questões éticas relacionadas ao uso destas em pesquisas. Entretanto, os mecanismos biológicos das células iPS ainda não estão completamente elucidados. Assim, pesquisas mais aprofundadas são necessárias para garantir a segurança e eficácia para sua possível utilização em futuras terapias. As células tronco derivadas do tecido adiposo consistem em um tipo de célula tronco mesenquimal multipotente que se destaca pela facilidade, rapidez e segurança de coleta e processamento. A partir de células tronco derivadas do tecido adiposo de coelhos serão produzidas células iPS utilizando a introdução de quatro fatores de transcrição (Oct3/4, Sox2, c-Myc, e Klf4). O comportamento das células será analisado para marcadores de pluripotência Oct4 e Nanog, atividade da fosfatase alcalina, capacidade de diferenciação in vitro em corpos embrióides e formação de tumores in vivo. A partir destes dados, serão realizadas análises comparativas entre as células-tronco derivadas do tecido adiposo e células iPS de coelhos. Espera-se contribuir para o desenvolvimento de uma tecnologia brasileira ainda inédita em coelhos, além de criar uma linhagem de células iPS para futuros estudos aplicados. Com base nos resultados obtidos espera-se adicionar informações importantes à literatura a cerca das propriedades das células iPS, visando sua utilização como modelo experimental para futuras terapias.

Esta proposta tem como objetivo a geração de células pluripotentes autólogas bovinas através da tecnologia de indução gênica, tecnologia esta ainda inédita no país, e sua consequente utilização na produção de animais clonados visando o aumento da eficiência da técnica de transferência núcleo, abrindo a possibilidade de utilização desta em escala comercial. Espera-se, com isso, que a tecnologia a ser implementada através desta proposta seja difundida e divulgada no meio científico e possibilite sua aplicação à campo; e que o conhecimento adquirido nesta seja utilizado para uma melhor adequação destas células à terapia e medicina veterinária aplicada, além de contribuírem para o desenvolvimento da pesquisa básica.

No presente subprojeto objetiva-se montar uma estrutura pioneira para a produção de modelos animais mediante modificações genéticas direcionadas (de precisão) visando o estabelecimento da rotina de terapias celulares e gênicas de precisão. Para tal, serão incorporadas infra-estrutura e tecnologias necessárias para criação animal, através de um biotério específico para criação e manutenção de minipigs, os quais serão utilizados como modelos animais para estudos em medicina regenerativa e translacional bem como serão adquiridos equipamentos para o fim específico de produção de vetores e seleção de células e embriões para transferência para receptoras. Suínos são utilizados como modelo em diversas áreas do conhecimento e acrescentam muito ao conhecimento adquirido em murinos por se tratar de um modelo que se assemelha mais aos seres humanos, além de ter também interesse agropecuário. Enfatiza-se que o enfoque da proposta é multi-disciplinar, uma vez que propõe a criação de um serviço onde diversas áreas de conhecimento serão beneficiadas. São exemplos a área farmacêutica, ciências biológicas, biomedicina, além das próprias medicinas humana e veterinária, dentre outras.

Estratégias como a transferência nuclear e a reprogramação induzida vêm sendo empregadas com o objetivo de induzir células somáticas a um estado pluripotente similar ao embrionário. O processo de reprogramação nuclear é extremamente desejável e possui importantes contribuições tanto no estudo da ciência básica como aplicada, como por exemplo, no aumento da eficiência das biotécnicas de produção animal ou na medicina, com a possibilidade de terapia celular autóloga para o tratamento de inúmeras enfermidades. Diversos estudos relatam que as células-tronco induzidas à pluripotência (iPSCs), do mesmo modo que as células pluripotentes embrionárias (CTEs), são capazes de se diferenciar em células similares às primordiais germinativas (PGCs) e até mesmo desenvolverem-se em gametas (oócitos e espermatozoides). Dentro do contexto da medicina regenerativa, a produção in vitro de PGCs a partir das células iPS representa uma importante ferramenta para as biotecnologias da reprodução, fornecendo uma plataforma ideal para sua potencial aplicação no diagnóstico e tratamento de infertilidades humanas e animais, assim como pode elucidar os mecanismos moleculares do desenvolvimento de PGCs e biotecnologias reprodutivas ligadas à produção animal.A eficiência de tal reprogramação à pluripotência, assim como a posterior diferenciação induzida em células similares a PGCs (PGCCLS) ainda apresenta uma eficiência bastante baixa, dificultando sua utilização na medicina translacional e regenerativa. Uma explicação para tal é a falha na reprogramação epigenética que leva a uma incompleta restauração do estado celular indiferenciado, e em especial, no processo de aquisição e manutenção de imprintings genômicos.Neste contexto, esta proposta tem como objetivo gerar células germinativas mediante reprogramação de células somáticas induzidas à pluripotência e estudar os perfis temporais de expressão gênica e epigenética durante os processos de desdiferenciação e comprometimento celular no modelo bovino, que nos permite o estudo da expressão alelo específica de genes imprinted relacionados ao desenvolvimento. Para tal, serão analisadas a expressão gênica global e epigenoma de células capazes submetidas à indução in vitro da pluripotência e posterior comprometimento em PGCCLs. Os resultados obtidos nesta proposta proverão respostas importantes e ainda inéditas acerca dos mecanismos moleculares envolvidos na reprogramação nuclear (beneficiária de bolsa PD).

O projeto do Centro de Terapia Celular (CTC) tem como foco a realização de pesquisas avançadas, básicas e aplicada s.com células-tronco (CT). O CTC congrega 9 pesquisadores principais (Pls) com reconhecida liderança nesta área no Bra sil. equipe se complementa com a participação de 20 pesquisadores associados e 10 colaboradores estrangeiros. A atual proposta continua e expande a experiência adquirida pelo grupo no projeto CEPID em vigor, tanto no aspecto cientifico: como nos aspectos de disseminação do conhecimento e de transferência tecnológica para a sociedade, como pode ser verificado no sítio: http://ctc.fmrp.usp.br . O projeto científico compreende um ambicioso programa de pesquisa multidisciplinar * que objetiva estudar aspectos moleculares, celulares e biológicos das CT normais e patológicas e avaliar, criticamente e. o seu papel terapêutico. Os estudos serão conduzidos com CT pluripotentes (CT Embrionária e CT de pluripotência induzida) e C i somáticas (CT Hematopoética, CT Mesenquimal e CP Endoteliai). No território das CTE pretendemos a geração de linhagens : brasileiras que possam ser expandidas e usadas em protocolos pré-clínicos e clínicos, bem como contribuir par a o , entendimento dos mecanismos da pluripotência. Serão geradas iPSCs derivadas de doentes com Disceratose Congênita: Anemia de Fanconi, Hemofilia A e Doença de Parkinson com o objetivo de entender mecanismos envolvidos na patologia. na 1 manutenção da pluripotência e no processo de diferenciação celular. CT Hematopoéticas serão derivadas de CTEs e de iPSCs i e estabelecidas linhagens celulares tanto de CT normais como leucêmicas para os estudos dos mecanismos envolvidos no i controle da hematopoese normal e neoplásica. Modelos animais transgênicos de leucemia promielocítica aguda serão gerados e usados para estudos básicos e pré-clínicos. CT do Câncer serão estudadas tendo como foco os mecanismos de trans1 cá o Epitélio-Mesenquimal e Endotélio-Mesenquimal (EMT e EndMT) . Estes mecanismos também serão estudados no contex to d2. . reprogramação celular e na geração de CT.Na arena clínica serão realizados ensaios clínicos usando CT mesenquimais no tratamento do diabetes insulino-dependente dos tipos 1 e 2, da Anemia Aplástica grave adquirida refratária, na prevenção da Doença do Enxerto contra o Hospedeiro (DECH) aguda e crônica e da falha de enxertia no transplante alogênico haploident ico Por fim serão desenvolvidos processos de produção de CT em grande escala em condições GMP para permitir o seu uso.

Estudos com modelos animais têm mostrado que transplantes de células tronco embrionárias ou pluripotentes podem ter sucesso para tratamento e cura de diversas doenças, muitas delas extremamente complexas. A medicina regenerativa amparada pelo desenvolvimento de biotecnologias emerge com futuro promissor, sendo uma das opções terapêuticas mais almejada. Neste contexto, a obtenção de linhagens de células tronco a partir de embriões caninos ainda é um desafio como modelo para a terapia celular, no entanto, alguns autores já demonstraram que a obtenção destas células a partir de fêmeas inseminadas e castradas é possível, mesmo sendo um processo laborioso. Em contrapartida, a produção de células tronco induzidas (iPS) a partir de fibroblastos de cão abre caminhos para a obtenção de células pluripotentes e o estudo de sua aplicabilidade nas mais diversas áreas. Esta proposta tem como objetivo o isolamento e cultivo de células derivadas de embriões em fase pré implantacional de cães; o estabelecimento de uma linhagem geneticamente induzida de células tronco de cães (iPS - induced Pluripotent stem cell), e a posterior caracterização das mesmas. Espera-se, a partir de análises comparativas, que as iPS produzidas (modelo in vitro) necessitem das mesmas condições de manutenção e apresentem o mesmo comportamento em cultivo que as células tronco embrionárias (modelo in vivo), comprovando sua aplicabilidade a partir de um modelo comparativo de desenvolvimento.

Diferentemente da maioria dos genes nos mamíferos, os genes imprinted caracterizam-se por serem expressos de modo monoalélico, sendo a determinação do alelo expresso dependente de sua origem parental. Tal determinação é fruto de marcações epigenéticas estabelecidas na linhagem germinativa, as quais são mantidas após a fertilização e durante o desenvolvimento. Muitos genes imprinted são expressos em tecidos placentários e fetais durante o desenvolvimento e são essenciais para o desenvolvimento placentário e para o controle do crescimento fetal. Por esta razão, muitas das alterações observadas em animais ou seres humanos obtidos por tecnologias reprodutivas, tais como fertilização in vitro, injeção intracitoplasmática de espermatozoide, ou transferência nuclear, são atribuídas a modificações epigenéticas nestes genes. Em ruminantes, um dos genes imprinted apontado como responsável pelas anormalidades observadas em animais produzidos por biotécnicas reprodutivas é o gene IGF2R (Insulin-like growth factor 2 receptor). O controle epigenético do gene IGF2R é determinado por metilação do DNA em regiões de metilação diferencial (DMR) e pelas modificações pós-traducionais das proteínas histonas associadas. Além disso, o transcrito anti-senso não-codificante do IGF2R, chamado de Airn, também desempenha importante papel na regulação do imprinting genômico do gene IGF2R. Dessa forma, utilizando modelos experimentais baseados na produção de indivíduos ou linhagens celulares híbridas (Bos taurus x Bos indicus) que permitem rastrear, através de polimorfismos de base única (SNP), as modificações epigenéticas alelo-específicas, bem como realizar ensaios de expressão alelo-específica este projeto visa determinar os mecanismos epigenéticos responsáveis pelo controle do imprinting genômico do gene IGF2R em bovinos valendo-se de agentes modificadores da cromatina (agentes desemetilantes de DNA e hiperacetilantes de histonas) para correlacionar as marcações epigenéticas à expressão alelo-específica. Adicionalmente, este projeto avaliará o impacto das técnicas de produção in vitro de embriões bovinos (FIV e clonagem) no imprinting genômico do gene IGF2R. Os resultados deste projeto contribuirão para o entendimento dos mecanismos epigenéticos relacionados ao desenvolvimento embrionário e fetal, em especial aqueles relacionados à dinâmica das alterações epigenéticas envolvidas no imprinting genômico; outrossim, os resultados deste projeto poderão representar importante avanço na busca de protocolos de produção in vitro de embriões que minimizem as alterações epigenéticas observadas.

Estratégias como a transferência nuclear e a reprogramação induzida vêm sendo empregadas com o objetivo de induzir células somáticas a um estado pluripotente similar ao embrionário. O processo de reprogramação nuclear é extremamente desejável e possui importantes contribuições tanto no estudo da ciência básica como aplicada, como por exemplo, no aumento da eficiência das biotécnicas de produção animal ou na medicina, com a possibilidade de terapia celular autóloga para o tratamento de inúmeras enfermidades. Uma série de estudos, porém, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Neste contexto, estudos específicos sobre os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na reprogramação tornam-se essenciais para um maior entendimento deste processo e, portanto, para a melhoria de sua caracterização e eficiência. Esta proposta tem como objetivo estudar a reprogramação nuclear induzida pela transferência de núcleo de células somáticas, pela expressão de fatores de pluripotência conhecidos e também pela combinação das técnicas em bovinos. Para tal, será analisada a expressão de genes sabidamente essenciais para a pluripotência, modificações epigenéticas relacionada a estes genes (metilação de DNA), assim como a capacidade de desenvolvimento in vitro e in vivo de embriões produzidos através das técnicas. Os resultados obtidos nesta proposta proverão importantes respostas acerca dos mecanismos moleculares envolvidos na reprogramação nuclear.

Recentes estudos epidemiológicos confirmam que as patologias causadas por mutações no DNA mitocondrial (mtDNA) são uma das principais causas de doenças em humanos, afetando no mínimo uma em 4.000 pessoas. Todavia, devido ao padrão de segregação único dessas patologias, não existem métodos eficientes que impeçam a sua transmissão de uma geração para a outra. A transferência de núcleo é até o momento o único método com potencial para a prevenção da herança dessas patologias, todavia, vários entraves inviabilizam o seu emprego neste sentido. Recentemente nós desenvolvemos uma nova metodologia que possibilita a remoção de mais de 60% das mitocôndrias do oócito/zigoto, o qeu criou novas perspectivas para a transferência de citoplasma como ferramenta para a prevenção da herança de doenças mitocondriais maternas. Se uma grande quantidade de mitocôndrias fosse introduzida no zigoto depletado, o mtDNA mutante seria diluído para um reduzido nível, potencialmente prevenindo a transmissão de muitas patologias causadas pelo mtDNA. Neste contexto, este projeto propõe a investigação de duas metodologias para introdução de uma grande quantidade de mitocôndrias no zigoto depletado e aumentar significativamente nos embriões e nos animais nascidos a contribuição do mtDNA introduzido. Para tanto, será testado o uso de duas fontes de mitocôndrias, i) da fração citoplasmática rica em mitocôndrias obtida pela centrifugação do zigoto (mitocôndrias de origem embrionária), e ii) de mitocôndrias purificadas provenientes de células somáticas (mitocôndrias de origem somática). Será analisado se há efeito da origem das mitocôndrias introduzidas sobre o desenvolvimento a termo bem como a heteroplasmia nos animais nascidos. Caso haja diminuição da heteroplasmia durante o desenvolvimento, outros estudos serão realizados para desvendar os possíveis motivos desta queda.

A presente proposta de criação de um Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Terapia Celular (INCTC) constitui a continuidade e a ampliação das atividades do Centro de Terapia Celular (CTC-CEPID-FAPESP), um dos Centros de Excelência em Pesquisa, Inovação e Difusão criados pela FAPESP em 2001 com o objetivo de ser um novo paradigma para a organização da pesquisa no Estado de São Paulo. O CTC-CEPID, da mesma forma que deverá atuar o futuro INCTC, desenvolve atividades nos três setores que constituem o escopo do projeto: pesquisa científica na fronteira do conhecimento, difusão do conhecimento para a sociedade e inovação tecnológica em estreita colaboração com o setor produtivo.

Estratégias como a transferência nuclear e a reprogramação induzida vêm sendo empregadas com o objetivo de induzir células somáticas a um estado pluripotente similar ao embrionário. O processo de reprogramação nuclear é extremamente desejável e possui importantes contribuições tanto no estudo da ciência básica como aplicada, como por exemplo, no aumento da eficiência das biotécnicas de produção animal ou na medicina, com a possibilidade de terapia celular autóloga para o tratamento de inúmeras enfermidades. Uma série de estudos, porém, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Neste contexto, estudos específicos sobre os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na reprogramação tornam-se essenciais para um maior entendimento deste processo e, portanto, para a melhoria de sua caracterização e eficiência. Esta proposta tem como objetivo estudar a reprogramação nuclear induzida pela transferência de núcleo de células somáticas, pela expressão de fatores de pluripotência conhecidos e também pela combinação das técnicas em bovinos. Para tal, será analisada a expressão de genes sabidamente essenciais para a pluripotência, modificações epigenéticas relacionada a estes genes (metilação de DNA), assim como a capacidade de desenvolvimento in vitro e in vivo de embriões produzidos através das técnicas. Os resultados obtidos nesta proposta proverão importantes respostas acerca dos mecanismos moleculares envolvidos na reprogramação nuclear (beneficiária de bolsa doutorado).

O objetivo geral do projeto é estabelecer a técnica de isolamento, caracterização e manutenção do potencial de diferenciação em diversos tecidos (multipotência) de células tronco adultas derivadas do tecido adiposo de bovinos e bubalinos, visando futuramente a sua utilização na técnica de transferência nuclear animal.

A utilização da proteína fluorescente verde (GFP) como marcador de células de origem fetal nas placentas de clones bovinos servirá de modelo inédito para estudo morfofisiológico e imunológico da interação materno-fetal, visto que possibilitará o seu mapeamento, diferenciando as células fetais das maternas. Tal modelo terá aplicação direta, principalmente porque estes são animais que apresentam problemas em relação ao seu desenvolvimento. Com o auxílio deste modelo, pretendemos verificar, além dos processos imunológicos, a migração de células fetais para o epitélio uterino, apoptose, proliferação celular e o transporte de substâncias entre a mãe e o feto. Para tanto utilizaremos 08 bovinos clonados e 08 bovinos de fertilização in vitro (FIV) e 30 bovinos de inseminação artificial (IA) ou monta natural com idade até 90 dias de gestação, os quais terão seu desenvolvimento interrompido mediante abate humanitário das receptoras e recuperação do útero gestante. Serão coletadas as membranas fetais (âmnio, alantóide e cório), placentônios, carúnculas e áreas intercarunculares. Uma parte das amostras será recortada e fixada, por perfusão ou imersão para verificação da morfologia e realização de imuno-histoquímica. Uma parte das amostras será coletada em nitrogênio líquido para extração do mRNA e verificação da expressão do gene "bovine lymphocyte antigen" (gene BoLa) do complexo de histocompatibilidade maior (MHC), homólogo ao gene "preimplantation embryonic development gene" (gene Ped) de camundongo, e para a realização da técnica de imuno-histoquímica em cortes congelados. Os resultados obtidos serão comparados entre bovinos , FIV, de IA ou monta natural para auxílio da detecção das razões de tantas alterações placentárias, perdas embrionárias, abortos espontâneos, mortalidade pós-natal e síndrome do bezerro grande em animais manipulados em laboratório. Projeto Jovem Pesquisador FAPESP.

Diversas técnicas genômicas vêm sendo aplicadas com o objetivo de seqüenciar e caracterizar a função dos diversos genes e regiões desconhecidas do genoma. Via de regra estes estudos finalizam por sugerir funções a determinados genes e outras regiões específicas. Entretanto, para que um mecanismo de função de um gene seja estabelecido há necessidade de que sejam estabelecidos modelos de estudos que freqüentemente utilizam experimentos envolvendo animais geneticamente modificados, como por exemplo os animais knock out. A proposta de trabalho deste projeto é estudar a viabilidade de estabelecimento de linhagens celulares de fibroblastos fetais bovinos provenientes de um bovino macho que receberam uma construção portando o gene da proteína fluorescente verde, freqüentemente utilizada como gene repórter, em regiões aleatórias do genoma e caracterizar as linhagens quanto a localização do inserto por FISH (hibridização in situ fluorescente). Finalmente, o estudo visa em especial à busca de células que receberam a construção em cromossomos sexuais (X ou Y) no intuito de gerar, mediante utilização da célula como doadora de núcleo, um animal que produza gametas segregando o gene GFP e, portanto, gere após fecundação in vitro ou produção de embriões por transferência nuclear blastócitos auto-sexáveis (onde embriões de somente um dos sexos serão transgênicos e emitirão fluorescência quando devidamente analisados) (beneficiária de bolsa de mestrado).