Luiziana Ferreira da Silva.

Membro da equipe organizadora e executora do Curso: Análise de fluxos metabólicos: produção de Polihidroxialcanoatos (PGA) e triacilgliceróis (TAG) como modelo de estudo, custeada pelo Centro Brasil Argentina de Biotecnologia

A necessidade de redução do tempo de recuperação e do conforto de pacientes nopós-operatório da cirurgia de alongamento ósseo é um alvo constante na medicina e, apesardo desenvolvimento de inovações nos pregos utilizados atualmente, existe um vasto campopara reduzir o desconforto dos pacientes. Neste contexto, candidatos a materiais-base para aprodução de scaffolds que auxiliem a recuperação têm sido estudados, juntamente àstécnicas de fabricação que possam oferecer personalização e comodidade aos pacientes. Paraisso, a impressão 3D oferece diversas possibilidades em formas e fabricação, parcialmenteresolvendo a personalização, restando desafios com os materiais dos scaffolds. Comomateriais, os poli-hidroxialcanoatos (PHA), poliésteres biocompatíveis, são biopolímerospromissores para abordar questões de rigidez, porosidade e elasticidade em diversos tecidosorgânicos. Em especial, o PHB-co-HHx tem o potencial de acelerar a osteogênese apósprocedimentos de alongamento ósseo, tornando-se ideal para a produção de scaffolds parareparo ósseo. O projeto é desenvolvido com a co-orientação da profa Dra Viviane Abreu Nunes, do Laboratório de Fisiologia da Pele e BioengenhariaTecidual - EACH USP e executada pelo aluno de graduação Otto Oliveira Olival

Inovação e Desenvolvimento de um Processo de Produção de Biopolímero (PHA) com Empresa para Uso em Embalagens, Processo USP: 24.1.05203.01.0 NDA protegido de 09/06/2024 a 03/05/26, coordenador

Burkholderia sacchari foi isolada por este grupo de pesquisa, a partir de solo de canavial no Brasil, destacando-se inicialmente por produzir altos teores de polímeros biodegradáveis e utilizar amplo espectro de substratos como fonte de carbono, tendo nível de biossegurança 1 e alta sensibilidade a antimicrobianos. Suas características permitem propor que este organismo seja utilizado como mais um chassis bacteriano para produzir diversos bioprodutos. O conhecimento da arquitetura da rede metabólica de B. sacchari, associado ao desenvolvimento de ferramentas para edição gênica, permitirão avançar no sentido de consolidar esta bactéria como um dos chassis de interesse para o grupo de Biologia Sintética S2B (Systems Synthetic Biology Center do INOVA USP) e de fluxômica, para a produção de bioblocos ou moléculas de valor agregado definidos pelas equipes colaboradoras.

Desenvolvimento de plataforma inédita de descoberta de fármacos para covid-19 baseada em células humanas primárias, reposicionamento de fármacos e descoberta de novos antivirais. A atividade será avaliada em monoterapia e combinação in vitro, com determinação do mecanismo de ação e resistência.. Neste projeto, o Lab de Bioprodutos atuará produzindo biomateriais P3HB-co-PHAMCL com diferentes teores de 3HAmcl, de modo controlado, avaliando sua aplicação como carreador de fármacos a serem testados no projeto em conjunto com especialistas em nanoparticulas da equipe. Adicionalmente, buscaremos na nossa coleção de microorganismos isolados de diferentes nichos, por aqueles produtores de substâncias com atividade biológica contra as doenças mencionadas.

financiamento Erasmus+ EU Programme : Os poli-hidroxialcanoatos (PHA) são biopolímeros produzidos naturalmente por Burkholderia sacchari. Esses biopolímeros são totalmente biodegradáveis, biocompatíveis, não tóxicos e podem ser produzidos a partir de fontes renováveis. O poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato), um copolímero de PHA, é o PHA mais promissor a ser aplicado como material biomédico devido às suas propriedades térmicas e físicas aprimoradas quando comparado aos homopolímeros de P(3HB). Estudos preliminares foram publicados usando este material para produzir nanopartículas para administração controlada de medicamentos. Neste projeto, propomos, pela primeira vez, a produção de nanopartículas de P(3HB-co-3HHx) para encapsular um novo composto, desenvolvido para inibir Ras, uma das oncoproteínas humanas mais estudadas. P(3HB-co-3HHx) produzido por Burkholderia sacchari recombinante a partir de xilose, um importante resíduo hemicelulósico e ácidos graxos, em cultivos de biorreatores no ICB USP (Brasil) será usado para produzir nanopartículas e encapsular a rodamina B e um composto inibidor de Ras na LMU Munich (Alemanha). Diferentes metodologias e formulações serão estudadas para produzir nanopartículas, que serão caracterizadas quanto ao tamanho, interações e eficiência do encapsulamento. Copolímeros com diferentes conteúdos de 3HHx, obtidos por recombinantes recém-obtidos no Brasil, serão testados. A liberação do fármaco e a captação celular do fármaco serão testadas em diferentes linhas celulares de câncer superexpressoras de RAS (pâncreas, mama e pulmão), nas quais a expressão de RAS será determinada concomitantemente por Western Blot e qPCR. Finalmente, experimentos ex vivo serão realizados com tecido de tumor de pulmão se forem obtidos resultados bem-sucedidos gerarão publicações relevantes para as áreas envolvidas.

Esta proposta se concentra o desenvolvimento de bactérias eficientes no uso de açúcares oriundos de hidrolisados hemicelulósicos para produzir polihidroxialcanoatos (PHA), polímeros biodegradáveis e biocompatíveis. O PHA alvo é PHB-co-HHx, um copolímero de 3-hidroxibutirato (HB) e 3-hidroxi-hexanoato (HHx), dotado de flexibilidade suficiente para aplicações médicas, tornando-se mais flexível com o aumento do teor de HHx. Devido às suas propriedades, tem sido alvo de patentes e há empresas investindo na sua produção recentemente. Trabalhos anteriores indicaram que recombinantes de B. sacchari, abrigando genes adequados de Aeromonas sp, foram capazes de converter açúcares e hexanoato a PHB-co-HHx, com um teor de HHx até 15 vezes mais do que tipo selvagem. Uma vez que apenas 50% de hexanoato foi transformado em HHx, melhoramentos adicionais são vislumbrados neste projeto, bem como a modulação do teor de HHx, aumentando a gama de aplicações. Também foi demonstrado que a conversão de xilose a bioprodutos em B. sacchari, embora esteja entre os melhores, pode ainda ser melhorada e esse aspecto também será explorado nas recombinantes a serem construídas. Uma vez obtido o microorganismo apropriado, cultivos batelada alimentada em biorreator serão desenvolvidos e a melhor estratégia para adição tanto de fonte de carbono como co-substrato (hexanoato) serão buscadas, para atingir produtividades máximas de produção de PHB-co-HHx com alto teor de HHx. Ferramentas para análise de fluxos metabólicos serão empregadas em todas as etapas a fim de avaliar os micro-organismos estudados, a influência das modificações aplicadas, bem como das condições de processo conduzidos em biorreator, realimentando para a tomada de decisões em novas modificações genéticas e de processo. Copolímeros produzidos serão extraídos, purificados, (testando-se solventes denominados "verdes") e suas propriedades avaliadas para aplicações médicas. Além do ICB USP, colaboram no projeto IBB IST* (Instituto de Biotecnologia e Bioengenharia, Instituto Superior Técnico, Universidade de Lisboa), LAMAV UENF ** (Laboratório de Materiais Avançados, Univ. Estadual Norte Fluminense,RJ, Brasil) e da Universidade de Westminster (Reino Unido) para desenvolver experimentos de biorreatores (e extração), caracterização de polímeros e aplicações médicas, respectivamente.

O projeto estuda a produção de substâncias com atividade antioxidante, ou precursoras de compostos químicos de alto valor agregado, empregando bactérias como chassis para a produção dessas biomoléculas por rotas biológicas e ainda comparando-as com diferentes chassis. São empregadas linhagens como Burkhholderia sacchari, Pseudomonas putida. As metodologias pra extração e dosagem das biomoléculas estão em desenvolvimento/aprimoramento, em colaboracao com o IB USP. Bactérias já modificadas que se tornaram capazes de produzir algumas dessas moléculas, estão em estudo de seu cultivo em biorreator para aumentar os teores produzidos. A comparação do uso dessas bactérias com o uso de plantas como chassis também integra o projeto, sendo realizada em colaboração com o Prof Dr. Igor Cesarino, do LigninLab do IB USP.

O projeto tem como objetivo melhorar o consumo de xilose na bactéria Burkholderia sacchari utilizando a produção de polímeros biodegradáveis como modelo, o que pode disponibilizar a metodologia de construção de recombinantes para a geração de outros microrganismos produtores de compostos de interesse biotecnológico. Além de melhorar o uso da xilose, pretende-se melhorar o seu consumo por esta bactéria em mistura dos açúcares liberados quando se faz a hidrólise da fração hemicelulósica de resíduos como o bagaço de cana-de-açúcar (glicose, xilose e arabinose). Para isso, pretende-se analisar o metabolismo como um todo, buscando-se organizações gênicas mais eficientes descritas para o catabolismo de xilose, para propor sua inserção na bactéria modelo, e ainda, a partir de indicações prévias de Análise de Fluxos Metabólicos construir recombinantes modificados em genes chave que podem aumentar a eficiência de consumo de xilose e reduzir ou abolir a repressão catabólica para aumentar a eficiência do uso das misturas de açúcares. Finalmente, empregando técnicas de engenharia evolutiva, clones bacterianos apresentando maior velocidade de crescimento em xilose serão buscados, visto que estudos de viabilidade econômica realizados neste grupo indicaram ser este mais um fator a contribuir no melhoramento do uso dos hidrolisados hemicelulósicos. A partir de novos resultado da AFM empregando xilose marcada não radioativamente (13C) espera-se conhecer e modificar as redes metabólicas empregadas pela linhagem selvagem e pelos recombinantes a serem construídos e ainda, encontrar novos alvos para modificação genética que nem sempre são óbvios a partir de uma primeira avaliação. O objetivo é obter a maior quantidade de informação possível acerca do metabolismo da xilose em microrganismo e assim construir uma cepa capaz de utilizar este açúcar isoladamente ou em misturas com maior eficiência. Os polímeros produzidos terão suas propriedades analisadas no Laboratório de Materiais Avançados da UENF, pelo prof. Dr. Ruben Sanchez Rodriguez.

The replacement of petrochemical products such as plastics by renewable, bio-based substitutes is a first-order priority in the technological agendas of our countries. For a successful transition, efficient design-based cell factories are required. While decades of research have increased our knowledge in metabolic network function, the quantitative understanding of the regulatory mechanisms is still far from being complete. With this project, we intend to develop quantitative models to design a 'programmable' balancing between growth and product formation. Using as a case study the production of a bio-plastic (polyhydroxyalkanoate) in Escherichia coli, we want to address the following questions: Which metabolites from central carbon metabolism are the signals that determine the growth rate? Can we reprogram the allocation of cellular resourcesbetween the generation of a product of interest and biomass formation by altering these signals andjor altering the signaling routes? To identify and study the roles of these "signaling metabolites" in the interaction between the metabolic and regulatory networks, we will manipulate the nature and availability of the nutrients and we will change the net stoichiometry of the glycolysis. To get insight into the systemic changes after the proposed manipulations, we will obtain quantitative data on the growth rates, the metabolic fluxes, transcriptional changes, proteomic profiles and concentrations of intracellular metabolites. We intend to develop a comprehensive model able to describe the observed changes and predict the outcome of similar metabolic interventions. With the collaboration between our laboratories at the Delft University of Technology and the University of Sao Paulo, we will have a multidisciplinary team with expertise in molecular biology, polyhydroxyalkanoate synthesis, quantitative proteomics and metabolomics, fluxomics and metabolic modeling. To exchange knowledge and divulge our results, we plan a joint advanced course in Brazil entitled 'Microbial Systems Biology'; half-yearly meetings, and an open workshop at the end of this project. (AU)

Recent papers and patents have shown that P(HB-co-HHx) is a promising biodegradable copolymer of the polyhydroxyalkanoate family (PHA), combining the short-chain (SC) monomer hydroxybutyrate (HB) and the medium-chain (MC) monomer hydroxyhexanoate (HHx), improving properties and applications, when compared with PHA with only SC or MC monomers. Since it can be processed into films, it is interesting to reduce its cost of production to make it a commodity. Aeromonas spp naturally produces a copolymer with 5-25 mol% HHx units, however only 10-20% of cell dry weight (CDW) is accumulated as PHA. B. sacchari accumulates up to 80% of CDW as PHB, but incorporates up to 2mol% HHx. Different strategies will be applied to produce P(HB-co-HHx) with variable HHx or MC monomer: construction of recombinants, metabolic flux and elementary mode analysis. HB fractions are obtained feeding bacteria with a sugar or sugarcane bagasse derivatives, however HHx incorporation depends on feeding with more scarce and expensive medium-chain fatty acid (MCFA). Raw material can represent up to 40% of costs of PHA production thus, finding cheaper and more sustainable alternatives is of high interest. It was found that MCFA could efficiently be produced with a mixed microbial fermentation (MMF) technology by anaerobic digestion, with the potential to transform acidified organic waste streams (acetic acid, ethanol etc.) into MCFA mixtures with a hexanoic acid yield of 0.85 mol C/mol C substrate in synthetic medium. MMF will be adapted to and optimized for a real feedstock (sugarcane bagasse and vinasse) to generate MCFA-containing streams appropriate to feed bacterial PHA production. This involves setting required effluent standards of MMF for the type and concentration of the fatty acids, or for other disturbing components (N or water content). Operation conditions and appropriate organic waste stream will be selected based on the requirements to feed PHA production. Starting from a single bacterial species, tailor-made copolymer will be produced, controlling monomer composition (MC monomer content from 0.5 to 25 mol% or more) from biomass, an approach not yet developed. Therefore the aim of this proposal is not merely incremental, having also the relevance of combining and improving two biological processes (MMF and PHA production) to contribute to sustainably produce an environmentally friendly material starting from low-grade biomass.

Responsavel pela atuacão do ICB USP com a empresa holandesa ChainCraft B. V., em trabalho que associou dois desenvolvimentos para gerar biopolímeros controlando-se a sua composição monomérica, variando assim suas propriedades e aplicações: a partir de resíduos de industria alimentícia e restaurantes, ou ainda bagaço de cana-de-açúcar, a empresa empregou sua tecnologia (Mixed Microbial Fermentation, MMF) para gerar misturas de ácidos graxos de cadeia média (MCFA) apropriados a alimentar B. sacchari de modo a produzir o copolimero alvo; enquanto a USP construiu recombinantes capazes de utilizar estes MCFA e açúcares para produzir o copolimero com diferentes teores de 3HHx e outros monómeros de cadeia media (HAmcl), tornando possível a produção de polímeros não acumulados em altos teores naturalmente, controlando sua composição monomérica, fator essencial para conferir propriedades e aplicações específicas, como se observa no levantamento de patentes depositadas por diversas empresas até o momento.

O Rio Tietê nasce na Serra do Mar e após percorrer 1.150 km deságua no rio Paraná. Neste percurso, da nascente até a sua foz, este Rio que corta o estado de São Paulo de leste a oeste passando por áreas preservadas de Mata Atlântica, trechos de cerrados e cerradões. Além destas áreas preservadas, o Rio Tietê e os seus afluentes passam por Regiões Metropolitanas como a cidade de São Paulo onde o rio recebe uma grande parte de poluentes industriais e esgoto doméstico. Embora este rio desempenhe papel estratégico do ponto de vista ambiental e social, poucos estudos visando conhecer a sua diversidade microbiana têm sido realizados, permitindo que a ação humana altere as condições físico-químicas do Rio, podendo levar a perda de diversidade microbiana antes mesmo de ser conhecida e/ou explorada do ponto de vista biotecnológico. Dessa forma, os objetivos do presente projeto será fazer, por meio de métodos moleculares e de cultivo, um diagnóstico da diversidade microbiana (bactérias, arqueias e fungos) do sedimento e corpo d água da Bacia do Rio Tietê e avaliar o potencial biotecnológico destes microrganismos. Para isso, os níveis de poluentes e da qualidade o sedimento e da água de pelo menos 14 pontos nos Rios Capivari e Tietê serão caracterizados a fim de avaliar as condições físico-químicas das diferentes regiões do Rio. Posteriormente, por meio de bibliotecas metagenômicas, a diversidade de pelo menos 8 locais será avaliada, permitindo verificar se existe correlação entre os níveis de poluentes e a diversidade microbiana. Com base nestas análises, 4 pontos serão selecionados para uma análise mais detalhada, envolvendo isolamento de microrganismos, metagenômica funcional, metatanscriptômica e clonagem de grandes fragmentos de DNA (30-40Kb). Os microrganismos isolados serão catalogados e organizados em uma coleção de cultura para prospecção de diferentes atividades de importância biotecnológica como agroenergia, biocatálise e biotransformação

O projeto é financiado pela FAPESP, processo 2010/51692-1, e coordenado pela Dra. Marilda Keico Taciro. Sua ênfase consiste na aplicação de técnicas de Engenharia Metabólica para avaliar processos de produção de polihidroxialcanoatos

Polihidroxialcanoatos (PHA) constituem uma família de poliésteres acumulados por diversas bactérias, na forma de grânulos intracelulares de reserva de carbono e energia. Suas propriedades termoplásticas, biodegradabilidade e biocompatibilidade permitem que sejam utilizados como substitutos dos plásticos convencionais em diversas aplicações, o que lhes confere grande relevância sob o ponto de vista ambiental além de serem produzidos a partir de matérias-primas renováveis pela agricultura. Sua produção depende da natureza química da matéria-prima oferecida como fonte de carbono à bactéria, bem como das vias metabólicas que esta possui. A PHA sintase é a enzima chave para a biossíntese de PHA, uma vez que sua especificidade pelo substrato definirá a natureza do polímero final. A obtenção de PHA sintases mais flexíveis tem sido buscada utilizando diversas estratégias a fim de obter novos PHA com novas composições monoméricas o que lhes confere novas propriedades e aplicações. Recentemente, foi construída uma biblioteca metagenômica de solo de Mata Atlântica que representa uma fonte de recursos genéticos brasileiros, nem sempre alcançados por técnicas de isolamento e cultivo convencionais que podem abrigar novos genes ou conjuntos de genes com potencial para a síntese de novos PHA. O presente trabalho buscará, nesta biblioteca, a clonagem e caracterização de fragmentos de DNA que contenham genes da biossíntese de PHA para expressá-los em mutantes com diferentes arcabouços metabólicos, avaliando o tipo de polímero produzido e analisando possibilidades de aplicação, por meio da determinação de suas propriedades em conjunto com o LAMAV UENF (Laboratório de Materiais Avançados, Univ. Federal do Norte Fluminense, Prof. Dr. Ruben Sanchez).

Among the sugars of lignocellulose, xylose, present in the hemicellulose, is recovered more easily and in better yields than glucose. Our objective is to increase the efficiency (yield and productivity) of bioprocesses using the biomass hemicellulosic fraction and strains tolerant to inhibitor compounds usually present in the hemicellulosic hydrolysates: the ethalonogenic Escherichia coli KO11 and the PHA-producing Burkholderia sp. F24. Polyhydroxyalkanoates (PHA) are polymeric bacterial products that can be used as biodegradable plastics. This research focuses on fundamental understanding of those cellular factors that we consider still the most essential in improvement of xylose utilization by bacteria and of process consolidation aspects to reach the level required in commercial production of biofuels and bioplastics from the hemicellulosic hydrolysates. The following strategies are proposed: (i) construction of genome based in silico models of xylose metabolism, (ii) through analysis of those in silico models a metabolic engineering strategy will be proposed to increase yield and productivity of the bioproduct. (ii) ecobiotechnology techniques will be also applied, such as
evolutionary engineering to obtain strains with better performance. (iv) high cell density fed-batch cultivations with the best strains will be performed using hemicellulosic hydrolysate as carbon source. (v) From yield and productivity values obtained in this project, a preliminary economic evaluation will be performed to verify the economic potential of this technology.

Rede iberoamericana composta por pesquisadores do Brasil, Argentina, Uruguai, México, Portugal e Espanha e inclui a participação de empresas (PHB industrial S/A e Biopolis, S.L.). O objetivo é promover cooperações, intercâmbios para o desenvolvimento de processos de produção de polihidroxialcanoatos e outros bioprodutos.

Objetivo General
Mejoramiento de los procesos de obtención de polihidroxialcanoatos(PHAS), polímeros biodegradables de alto valor agregado y compatibles con la preservación del ambiente, para mejorar la competitividad de industrias productoras

Trata-se de um projeto relacionado à produção de polihidroxialcanoatos por bactérias selvagens e recombinantes, vinculada à Rede Temática de Bioprodutos

Pretende-se estudar a produção bacteriana de copolímeros híbridos, biodegradáveis e biocompatíveis, da família dos polihidroxialcanoatos (PHA), compostos de monômeros de 3-hidroxibutirato e 3-hidroxialcanoatos de cadeia carbônica de tamanho médio (3HB-co-3HAMCL). Estudos e patentes dos últimos 5 anos mostram que este material tem sido buscado por diversas instituições e empresas, pois a literatura indica que apresentará propriedades físicas e mecânicas diferentes daquelas apresentadas por outros PHA, por ser composto de monômeros de cadeia carbônica curta (HASCL, com 4 átomos de carbono) e média (HAMCL, 6 ou mais átomos de C), ou seja, composição mista, mais rara devido à especificidade das enzimas envolvidas na sua produção. Isto tem impacto relevante sobre suas aplicações e sobre o estudo da produção biotecnológica de PHA. As estratégias para estudo da biossíntese e controle da composição monomérica destes materiais serão: a) o isolamento de bactérias para a produção de PHA contendo monômeros híbridos; b) o estudo de B. sacchari, bactéria caracteristicamente produtora de HASCL, avaliando o seu potencial para a produção de PHA híbridos, pelo uso de precursores específicos ou pela construção de recombinantes e c) o estudo de espécies de Pseudomonas, caracteristicamente produtoras de HAMCL, avaliando o seu potencial para a produção de PHA híbridos pela construção de recombinantes. Serão empregadas como matérias-primas óleos vegetais ou ácidos graxos derivados destes óleos. Espera-se chegar a uma condição ou conjunto de condições (microrganismo - condição de cultivo-matéria-prima) que levem à produção de 3HB-co-3HAMCL, controlando sua composição monomérica, de modo a variar suas propriedades. Os materiais mais promissores terão suas características físico-químicas avaliadas em conjunto com o Prof. Dr. Ruben Sanchez Rodrigues do Laboratório de Materiais Avançados da Universidade Federal Norte Fluminense (LAMAV UENF).

O projeto se propõe a comprovar a hipótese de que haja uma nova via catabólica para o propionato em Burkholderia sacchari e que ainda não foi descrita do ponto de vista molecular em bactérias. Estudará também o papel de genes da única via já conhecida, o ciclo de 2-metilcitrato (2MCC), sobre o catabolismo deste ácido e sobre a síntese de 3-hidroxivalerato(3HV). Em presença de sacarose e propionato, este último gera unidades 3HV que são esterificadas com unidades 3HB (3-hidroxibutirato), pela bactéria, resultando no acúmulo intracelular do copolímero P3HB-co-3HV, que é biodegradável, mais maleável e com maior número de aplicações industriais. Em B. sacchari, O 2MCC e uma outra via ainda não conhecida competem, pelo propionato, com a via de síntese de polímero, reduzindo a geração de 3HV. A descrição desta via permitirá controlar a produção do polímero, e terá impacto sobre o conhecimento existente no assunto em outros procariotos, já que há necessidade de comprovação molecular de outras vias propostas até o momento em bactérias.