Lourdes Isaac.

Juntamente com a alunas da Liga Científica de Divulgação Científica Virginia Schall estamos preparando uma nova exposição de cartazes sobre o tema Grandes Endemias, destinada ao público em geral.

Sou supervisora desta liga formada por alunas do Curso de Ciências Biomédicas da USP

Curso para professores da Rede Pública de Ensino Médio e Fundamental

Foram feitas exposições em estações do Metrô e de trens da cidade de São paulo

Quantificamos proteínas do sistema complemento e procedemos com avaliações funcionais com a finalidade de identificar alterações em pacienets com suspeita de deficiência do complemento.

Auxílio na modalidade temático

A deficiência completa de Fator H (homozigota) é um fenômeno raro, com apenas 23 casos em 13 famílias diferentes descritos na literatura. Em função da ausência dessa proteína, principal co-fator de Fator I, há descontrole na formação da alça de amplificação da via alternativa. Com isso, há consumo exagerado de C3 e excessiva produção do fragmento C3b. Nesta situação, a concentração de C3 intacto cai, acompanhada também pela redução significativa de Fator B. Indivíduos com deficiência completa de Fator I ou de Fator H apresentam quadro semelhante àquele observado nos deficientes primários de C3, ou seja, maior suscetibilidade a infecções por bactérias encapsuladas. Nosso grupo estudou um paciente (ESY) com deficiência de Fator H acompanhado de baixo nível sérico de C9, de origem japonesa e filho de pais consanguíneos. Ao estudar a concentração plasmática de várias proteínas do sistema complemento do paciente, observamos níveis normais de Fator I e properdina, contudo baixos níveis de Fator H e Fator B no soro, associados com a consequente redução da concentração de C3, sugerindo desregulação da Via Alternativa. O RNAm de Fator H do paciente foi sequenciado e uma mutação de troca de nucleotídeo CG453TCA453T foi encontrada, responsável pela troca de códon de Arg127His na molécula de FH deste paciente. Em estudo prévio realizado em cultura de fibroblastos do paciente, foi provado que a mutação Arg127His causa um retardo na secreção com acúmulo da proteína mutante no retículo endoplasmático, mas não afetou a sua atividade funcional, uma vez secretada. Em experimentos in vitro, a cultura de fibroblastos do paciente, quando tratados com curcumina, observou-se aumento da secreção do Fator H mutante, mantendo função preservada na regulação do sistema complemento. A curcumina é um polifenol hidrofóbico derivado do rizoma da planta Curcuma longa. Vários trabalhos têm mostrado que esse composto possui um amplo espectro de atividades atuando como agente antioxidante, antinflamatório, anti-microbiano e anti-cancerígeno. Contudo, sua biodisponibilidade oral é baixa devido à relativa baixa absorção no intestino e rápido metabolismo no fígado, sendo eliminado nas fezes. Recentemente, novas formulações de curcumina em nanopartículas (Theracurmin?) foram empregadas em ensaios clínicos, mostrando melhor absorção e biodisponibilidade, possibilitando o uso de doses mais baixas do que as anteriormente empregadas. Desta forma, após aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa, iniciamos o tratamento do paciente com Theracurmin?. O paciente foi submetido a extensa avaliação clínica e laboratorial, mostrando sinais e sintomas com características de lúpus eritematoso sistêmico (em baixo grau de atividade com SLEDAI 4/105), presentes antes mesmo do início do protocolo de tratamento. Iniciamos com a realização da curva de curcumina com dose de 2g de Theracurmin? (para estudo farmacocinético), antes do tratamento com 2g de 12/12h, e posteriormente com 4g de 12/12h. O paciente mostrou boa tolerância a Theracurmin?, sem sintomas adversos ou efeitos colaterais. Nos resultados preliminares, foi possível identificar através de Cromatografia Líquida de alta resolução acoplada à espectrometria de massas de repetição ? LC-MS/MS, níveis variáveis de curcumina no soro do paciente ao longo do tratamento. Em análise preliminar, o tratamento causou um discreto aumento de Fator H no soro do paciente, detectado por ELISA e Western Blot. Tais resultados, entretanto, não afetaram a concentração de C3 no soro do paciente. O grau de atividade da doença manteve-se estável ao longo de todo o tratamento.

A leptospirose é uma zoonose mundialmente disseminada que representa um grave problema de saúde pública. Microorganismos patogênicos, notadamente os que atingem a circulação sanguínea como a leptospira, desenvolveram múltiplas estratégias de evasão ao sistema imune do hospedeiro, em especial ao sistema complemento. Recentemente demonstramos que proteínas secretadas por espécies patogênicas de Leptospira são capazes de inibir as três vias de ativação do sistema complemento humano. Além disso, identificamos uma protease da classe das termolisinas como uma das proteínas responsáveis pelos efeitos observados no sobrenadante total. Considerando esta importante atividade biológica, acreditamos que seja de grande relevância avaliar o potencial vacinal desta termolisina, bem como efetuar a caracterização bioquímica da proteína, sendo estes os objetivos do Sub-projeto 1. Nos ensaios in vivo utilizaremos o modelo experimental de hamsters, os quais são susceptíveis à infecção por leptospiras. Os animais serão imunizados com a termolisina recombinante utilizando o hidróxido de alumínio como adjuvante. Os controles serão compostos por um grupo de hamsters imunizados com a vacina comercial (FarrowsureB, Pfizer) e outro com o veículo PBS e hidróxido de alumínio. Sangrias pelo plexo retro-orbital serão realizadas para acompanhamento do título de anticorpos anti-termolisina. Após as imunizações os animais serão desafiados com a estirpe virulenta L. interrogans sorovar Kennewiki. Os hamsters que sobreviverem à infecção serão sacrificados e os órgãos coletados para a realização de diferentes análises, tais como a histopatológica e a cultura de leptospiras. Já a caracterização bioquímica da termolisina será composta de ensaios de especificidade, cinética enzimática e prospecção de novos substratos. A análise do potencial vacinal e caracterização bioquímica de potenciais fatores de virulência são de grande importância, podendo contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e/ou preventivas na leptospirose. 
Nosso grupo demonstrou anteriormente que a termolisina recombinante possui atividade proteolítica sobre a molécula de C3, representando um potencial candidato ao efeito observado no sobrenadante total das culturas. Desta forma, a identificação de quais moléculas do MAC (C5b-9n) são clivadas por esta metaloprotease ou por demais enzimas presentes no sobrenadante de culturas de leptospiras patogênicas bem como seu sítio de clivagem, são de grande importância. Assim, no Sub-projeto 2 avaliaremos se diversas estirpes de leptospira são capazes de secretar proteases que degradam as moléculas C5, C6, C7, C8 e C9. A habilidade de degradar moléculas do complemento pode contribuir para os processos de invasão e disseminação da bactéria no organismo.

The complement system plays a major role in innate and adaptive immunity and the component C3 is a central protein for all three activation pathways. Human C3 deficiency is a rare autosomal recessive inherited disease strongly associated with severe recurrent infections and increased susceptibility to immune complex-mediated diseases, particularly glomerulonephritis. In this work, we studied a 7-year-old daughter of consanguineous parents who presented and extremely low levels of serum C3 (<0.1 mg/ml; normal: 1.0?1.6 mg/ml) determined by ELISA. The patient?s and her family sera were also analyzed by Western blot when we confirmed the absence of C3 alpha- and beta-chains in the patient´s serum. The reverse-transcriptase polymerase chain reaction was used to amplify C3 mRNA from LPS-stimulated fibroblasts from the patient. After sequencing the C3 mRNA, we observed the skipping of the exon 27 (99 nt) in the C3 gene, which normally codifies the 1131-1163 aa, corresponding to the C3 dg fragment (TED domain). In order to further investigate this abnormality, we are currently sequencing the flanking intronic regions of the exon 27 in the genomic DNA of this patient. In this patient the thioester bond is not formed and additionally this mutation induces instability in the C3 mutated protein leading to its early degradation and absence in the patient?s serum. To our knowledge this is the first study of C3 deficiency caused by skipping of Exon 27.

A leptospirose é uma das principais zoonoses mundiais causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira eliminadas principalmente na urina de roedores. O desenvolvimento de resposta imune durante a leptospirose é fundamental para a proteção do indivíduo e a ativação do sistema complemento é importante para a morte destas bactérias. Recentemente, nosso grupo mostrou que espécies não-patogênicas de Leptospira morrem em minutos se incubadas in vitro com soro humano, fonte de proteínas do sistema complemento. Por outro lado, justamente as estirpes virulentas de Leptospira conseguem sobreviver, escapar do sistema complemento ao se ligarem a proteínas reguladoras do hospedeiro como Fator H e C4BP. Neste projeto pretendemos entender em profundidade os recursos empregados por essas bactérias para escapar dos mecanismos de imunidade inata do hospedeiro. As perguntas centrais que norteiam este projeto são: O que torna a superfície de leptospira capaz de ativar ou não a via alternativa do sistema complemento? Quais componentes bacterianos interagem com proteínas reguladoras da ativação do sistema complemento? Quais outros mecanismos de evasão as formas virulentas de leptospiras empregam para escapar do sistema complemento? Há secreção de proteases bacterianas capazes de clivar proteínas do sistema complemento? Qual a real importância do sistema complemento para a eliminação in vivo dessas bactérias? Acreditamos que a compreensão aprofundada destes processos poderá ser importante para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas contra a leptospirose.

Auxílio Integrado do CNPq