Arthur Henrique Cavalcante de Oliveira.

A Glutamato Desidrogenase (GDH) é uma enzima responsável pelas reações de aminação redutiva do #945;-cetoglutarato transformando-o em glutamato e pela conversão do glutamato em #945;-cetoglutarato através de uma desaminação oxidativa. Em tripanossomatídeos, foi descrito que as formas livres sintetizam #945;-cetoglutarato, a partir de glutamato, para alimentar o ciclo do ácido tricarboxílico e que as formas intracelulares produzem glutamato a partir do #945;-cetoglutarato para fornecer carbonos para vias anabólicas, evidenciando um papel fundamental desta enzima no metabolismo de Leishmania e Trypanosoma. Assim, o objetivo deste trabalho consiste na expressão heteróloga da Glutamato desidrogenase de Leishmania major (LmGDH)e caracterização cinética e estrutural da enzima recombinante. A sequência codificadora da GDH de L. major será amplificada do genoma e clonada em vetores de expressão. Após esta etapa, será desenvolvido um protocolo de expressão da LmGDH para a produção da enzima recombinante na forma solúvel e de conformação correta. De posse da enzima purificada, purificação por cromatografia de afinidade, será feita caracterização da atividade enzimática para obtenção dos parâmetros cinéticos da enzima em relação aos substratos (glutamato e #945; cetoglutarato) às coenzimas (NAD+ e NADH) e ao pH e temperatura ótimos. Estudos espectroscópicos em solução serão realizados para a avaliação da estabilidade da estrutura secundária, terciária e quaternária da LmGDH recombinante e para analisar as mudanças conformacionais para o desempenho da atividade. Por meio da técnica de dicroísmo circular e fluorescência intrínseca de triptofanos, serão obtidos o perfil da estrutura secundária e terciária da enzima, sua estabilidade em diferentes pHs e temperaturas e o perfil energéticos de enovelamento usando de agentes caotrópicos.. A estrutura quaternária será analisada por filtração em gel e SAXS para confirmar as alterações na oligomerização da enzima. O genoma de L. major possui uma sequência codificadora para a GDH que apresenta 28 de identidade com as isoformas da GDH humana, que sugerem possíveis diferenças estruturais para futuros estudos de sítios alvos de drogas. .A GDH de Leishmania ainda não foi caracterizada seu estudo pode contribuir para a elucidação das relações estrutura e função da enzima, bem como, no planejamento de estratégias de combate ao parasita.

O presente projeto tem como objetivo a caracterização estrutural e funcional de proteínas de Leishmania : Nucleosídeo Difosfato Kinase, Carboxipeptidase Termoestável, Fator Imibitório da Migração de Macrófagos e Proteína Calpaína-like . A estratégia é baseada na convergência de estudos de bioquímica estrutural, biofísica e análise funcional para a elucidação das funções dessas proteínas no parasita Os alvos foram clonados e expressos em E.coli. A caracterização estrutural e enzimática dos alvos por meio da clonagem e mutação sítio-dirigida dos genes, purificação das proteínas recombinantes, estudos de espectroscopia e resolução da estrutura tridimensional. Uma abordagem funcional será direcionada para a caracterização das proteínas de L. major por meio da imunolocalização, interação das proteínas com macrófagos, superexpressão constitutiva dos genes nas formas promastigotas do parasita, análise da virulência e proteômica das formas superexpressoras do parasita.

O fator inibitório da migração dos macrófagos (MIF), originalmente descrito como uma citocina de células T humanas inibe a migração de macrófagos. MIF é considerado um importante fator no controle de infecção por parasitas. Camundongos resistentes à infecção por L. major e Trypanosoma cruzi tornaram-se susceptíveis, após a deleção do gene do MIF. A descrição na literatura da presença de MIF homólogas na secreção de parasitas sugere uma possível modulação da resposta imunológica pelo parasita, pelo mesmo receptor do macrófago (CD74) do MIF do hospedeiro. Recentemente, foi mostrado que um dos dois MIFs de L. major (LmjMIF1) atua inibindo apoptose, indicando que o LmjMIF contribui para sobrevivência do macrófago infectado. Assim, o objetivo do presente projeto é investigar o papel das interações intersubunidades na manutenção da estrutura e função do MIF de L. major (LmjMIF2), por meio da caracterização biofísica e bioquímica de mutantes de triptofano único e com alterações na cauda C-terminal. 
Sequências mutantes da LmjMIF2 contendo triptofano único e mutações na cauda C-terminal serão produzidos por reações de PCR, clonadas e usadas para expressão em E. coli e purificação as proteínas mutantes. Estudos de desnaturação com dicroísmo circular e fluorescência usando variação térmica e agentes desnaturantes possibilitarão o mapeamento do perfil de mudanças estruturais das regiões dos triptofanos (do núcleo proteico e da cauda C-terminal da molécula). O acompanhamento dessas alterações conformacionais na estrutura terciária desses mutantes, indicará a importância dessas regiões para a manutenção do enovelamento da LmjMIF2 de L. major. O estado oligomérico dos mutantes será avaliado por filtração em gel, por espalhamento de baixo ângulo (SAXS) e por eletroforese de gel nativo. Assim, a mutação sítio-dirigida de triptofanos, mantendo um triptofano próximo às regiões de interface oligomérica, aliada com estudos espectroscópicos em solução, podem contribuir para indicar a estrutura quaternária da MIF2 de L. major em solução e, se essa estrutura é aquela que interage com o receptor dos macrófagos. A avaliação na atividade funcional de inibição de migração de macrófagos será feito com interação com macrófagos imortalizados J774 e indicará o papel do estado de oligomerização na atividade da LmjMIF2. Ainda, após a obtenção de parasitas superexpressando as MIFs mutantes, será avaliada o papel das regiões mutadas na virulência, por lesão de patas de camundongo, e na infectividade, pela invasão de macrófagos.
O estudo da estrutura em solução de mutantes, especialmente da cauda C-terminal, contribuirá para caracterizar a manutenção da estrutura quaternária em solução relacionando-a com a atividade de interação com o receptor do macrófago. Esses estudos viabilizam a identificação de regiões da MIF homóloga de Leishmania, diferentes da MIF humana, que podem ser essenciais para a atividade, durante o ciclo de vida do parasita. Essas regiões podem ser, futuramente, sítios de ligação de novas drogas de combate ao desenvolvimento do parasita.

O bagaço de cana é o principal resíduo do processamento da cana de açúcar e provem da moagem do colmo da cana de açúcar para a extração de seu caldo. Esse material é uma fonte de material rica em biomassa lignocelulósica, sendo composto por 40% de celulose, 24% de hemicelulose, 25% de lignina e 11% de outros compostos orgânicos como óleos, proteínas e cinzas. A forte associação entre a celulose, hemicelulose e lignina é um dos principais fatores que dificultam o aproveitamento dos materiais lignocelulósicos. Desta forma, a deslignificação representa um dos passos mais importantes para a viabilização de processos industriais baseados na conversão de biomassa vegetal. A lignina do bagaço de cana é composta por unidades siringil, guaiacil e uma pequena parte de unidades de hidroxifenil. Diferentes espécies de fungos secretam diferentes enzimas extracelulares que catalisam reações que levam a degradação da lignina, um processo dependente de etapas enzimáticas. Uma das vias de identificação das proteínas envolvidas em processos de degradação da biomassa lignocelulósica é a análise do secretoma de microrganismos. Assim, objetivo do projeto é identificar proteínas de interesse biotecnológico para degradação de lignina, por meio da análise do secretoma da levedura Rhodosporidium fluviale cultivada em meio contendo lignina como fonte de carbono. Esta levedura foi obtida em um consórcio microbiano especializado na degradação da fração de lignina solúvel, derivada do pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar. Experimentos iniciais, em nosso laboratório, indicaram um potencial de crescimento dessa levedura em meio de cultura, cuja única fonte de carbono é a lignina solúvel, purificada do bagaço de cana-de-açúcar. Assim, a análise das proteínas secretadas por essa levedura, durante o crescimento em lignina, contribuirá para a elucidação dos processos enzimáticos envolvidos na obtenção do carbono, pelo R. fluviale, nessas condições.

Como solução ao paradigma de identificar o maior número de compostos ativos em coleções sintéticas e/ou oriundas de extratos naturais, o desenvolvimento de métodos on-line que incorporem identificação e caracterização tem sido explorado. Nesse contexto, o desenvolvimento de novos ensaios de triagem de ligantes de proteínas tem se destacado na procura de hits. Amplamente difundido, o uso de ensaios enzimáticos off-line em solução envolve várias limitações, entre elas a pouca compatibilidade das enzimas com solventes orgânicos. A baixa estabilidade aliada ao alto custo de purificação torna os ensaios on-line utilizando enzimas em solução uma etapa pouco viável para triagem de alta eficiência. Em contrapartida, a realização dos ensaios biológicos on-line, empregando enzimas imobilizadas é uma alternativa valiosa. Os biorreatores ou IMERs (do inglês: Immobilized enzyme reactor) possuem maior estabilidade na presença de solventes orgânicos e variações de temperatura, além de permitir a reutilização e o uso de pequenas quantidades de enzima. Diferentes métodos de imobilização e uma grande variedade de suportes cromatográficos disponíveis ampliam, sobremaneira, as possibilidades de utilização de biorreaotres enzimáticos em estudos on-line, com diferentes formatos e configurações. O uso da cromatografia seletiva de afinidade, utilizando IMERs tem sido explorado com eficiência e demonstrado grandes vantagens como uma das técnicas de triagem de alta eficiência. A cromatografia seletiva de afinidade pode ser explorada através de cromatografia frontal, zonal (linear e não linear). Além disso, a cromatografia zonal pode ser empregada com sistemas 2D hifenadas a diferentes detectores. Enzimas imobilizadas em partículas magnéticas têm sido também eficientemente utilizadas em triagem de ligantes em coleção combinatórias naturais ou sintéticas. O objetivo deste projeto é desenvolver modelos de triagem para os seguintes alvos: ACE, as colinesterases AChE de formiga e humana, e BChE humana, nucleotídeo difosfato quinase (NDK) de Leishmania, NTPDases de T. cruzi e Leishmania e fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) de T. cruzi e Xantina oxidase (XO).

A nucleosídeo difosfato kinase b (NDKb) é uma enzima responsável pela produção de nucleosídeos trifosfatados e está envolvida com vários processos celulares. A NDKb é secretada no meio extracelular e considerada um fator de patogenicidade em patógenos intracelulares como Mycobacterium tuberculosis, Vibrio cholerae e L. amazonensis. Este projeto tem por objetivo caracterizar a atividade cinética da enzima recombinante nucleosídeo difosfato kinase b (NDKb) de L. major e avaliar o efeito de mutações no sítio ativo e na interface oligomérica, relacionando as alterações na estrutura com a atividade catalítica e funcional da enzima. Mutações sítio-dirigidas foram realizadas e testes de expressão mostraram que os mutantes foram produzidos em E. coli e serão purificados e caracterizados nesse projeto. A caracterização cinética com doadores de fosfato está em andamento no laboratório e, nesse projeto, serão obtidos os parâmetros cinéticos com nucleotídeos doadores e aceptores de fosfato da proteína recombinante selvagem e dos mutantes, via análise cromatográfica, usando HPLC, dos produtos da reação. Estudos de estrutura em solução de dicroísmo circular, de fluorescência intrínseca do triptofano e de filtração em gel e SAXS serão realizados para a avaliação da estabilidade da estrutura secundária, terciária e quaternária da NDKb nativa e mutantes. A exposição de proteínas secretadas a vários ambientes, inclusive com alterações no pH, justificam os diferentes experimentos com variação de pH para analisar as mudanças estruturais e de atividade da NDK, durante o ciclo de vida do parasita. Com fluorescência, serão avaliadas a supressão e anisotropia de fluorescência intrínseca, que informam sobre o acesso de supressores e do movimento da estrutura, permitindo inferências sobre a estrutura nos diferentes ambientes de pH e agentes desnaturantes. Ainda, com dicroísmo circular, será obtido o perfil por desnaturação térmica, por agentes caotrópicos e por variação de pH, com o intuito

Bolsa - Mestrado

Lignocelulose é constituído pelos polímeros celulose, hemicelulose e lignina, encontrados na parede celular das plantas como uma matriz complexa e estável. A estrutura complexa do lignocelulose limita a degradação das paredes celulares das plantas pela ação enzimática, restringindo seu uso de enzimas em aplicações de biorefinaria como biobranqueamento de polpas de celulose e a produção de açucares fermentáveis a partir de biomassa das plantas. Enzimas individuais são ineficientes contra a matriz de polímeros encontrada em lignocelulose, e a biorefinaria de biomassa necessita o uso de misturas de enzimas com especificidades diferentes. A meta da proposta atual e a identificação, caracterização e engenharia das propriedades catalíticas de enzimas com o objetivo de desenvolvimento de biocatalizadores que podem ser combinados em misturas enzimáticas para a biorefinaria de lignocelulose. A estratégia geral focalizará na caracterização de enzimas identificadas em projetos genomicos dos fungi Aspergillus niveus, Aspergillus japonicus e Chaetomium thermophilum e das bactérias Bacillus subtilis e Clostridium thermocellum, utilizando uma série de técnicas microbiológicas e bioquímicas em conjunto com abordagens de biologia molecular estrutural. Estes estudos iniciais serão conduzidos em paralelo com analises mais sofisticados com o intuito de identificar em mais detalhes as modificações nos polímeros de parede celular das plantas produzidas pelas enzimas. Estes atividades fornecerão informações para orientar o programa de engenharia de enzimas que melhorará as suas propriedades catalíticas usando estratégias de desenho racional e evolução dirigida visando aplicações de biorefinaria na indústria de polpa de celulose e papel no desenvolvimento de tecnologias na área de bicombustíveis.

Este projeto é uma continuidade de nossa linha de pesquisa, que vem sendo apoiada pela FAPESP, cujo objetivo é o estudo sistemático das propriedades estruturais e cinéticas da (Na,K)-ATPase do tecido branquial de diferentes espécies de caranguejos e camarões afim de se tentar estabelecer um modelo para a adaptação dos crustáceos a ambientes de diferentes salinidades. A manutenção da osmolalidade da hemolinfa dos crustáceos é atribuída à (Na,K)-ATPase e este mecanismo de adaptação sugere que as respostas dos crustáceos devem envolver uma rápida ativação do transporte de íons que deve ser primária a qualquer outra resposta fisiológica deste animal. No presente projeto pretende-se investigar a sinalização celular vinculada à regulação da (Na,K)-ATPase bem como suas conseqüências diretas na captação de NaCl através das brânquias durante a aclimatação a ambientes hiposalinos e a ambientes marinhos. Para isso serão realizados os seguintes estudos: 1) relacionar o processo de aclimatação do C. danae com a expressão diferencial do FXYD2 (subunidade g da Na,K-ATPase); 2) estudar o efeito do FXYD2 fosforilado por PKA na atividade catalítica da (Na,K)-ATPase de C. danae; 3) clonagem e o sequenciamento do FXYD2 presente na preparação da (Na,K)-ATPase branquial de C. danae; 4) estudar o efeito das poliaminas em diferentes meios salinos, relacionando-os as proteínas cinases que são ativadas durante o estresse osmótico, utilizando cultura de células das brânquias de C. danae; 5) elaboração de um protocolo de purificação da (Na,K)-ATPase de C. danae, afim de se obter uma fração enriquecida da enzima visando a identificação de seu padrão de clivagem, e posteriormente a conformação ligada ao sítio de ligação do NH+4; 6) identificar o papel que outros reguladores endógenos (dopamina, octopamina) teriam na (Na,K)-ATPase das células branquiais cultivadas; 7) estabelecer a seqüência de aminoácidos da (Na,K)-ATPase, a fim de identificar os possíveis resíduos envolvidos na ligação dos cátions; 8) relacionar o FXYD2 com as proteínas cinases estimuladas por poliaminas e a sua ação final diante da atividade da (Na,K)-ATPase em diferentes meios salinos, utilizando-se cultura de células das brânquias de C. danae.

Mestrado, FAPESP

O estudo de estrutura e função de proteínas de Leishmania possibilita o entendimento das bases moleculares da interação parasita/hospedeiro e a apresentação de novos alvos a serem utilizados no desenvolvimento de terapias contra o parasita. O presente projeto tem como objetivo a caracterização estrutural e funcional de proteínas de Leishmania identificadas anteriormente em estudo de subproteoma de vesículas de espécies de Leishmania e implicadas na interação parasita/hospedeiro. A estratégia é baseada na convergência de estudos de biologia estrutural e análise funcional para a elucidação das funções dessas proteínas na biologia do parasita, focalizando fatores patogênicos. Dois alvos foram selecionados no subproteoma baseando-se nas funções imunomodulatórias que elas exercem em outros organismos patogênicos (NDK, Nucleosídeo Difosfato Kinase e MIF, Fator Inibitório de Migração de Macrófagos) Os dois alvos de estudo selecionados ainda não foram caracterizados em parasitas tripanossomatídeos. O projeto será desenvolvido por meio de duas abordagens de estudo. A primeira direcionada para a caracterização estrutural e enzimática dos três alvos por meio da clonagem e mutação sítio-dirigida dos genes, purificação das proteínas recombinantes, estudos de espectroscopia e resolução da estrutura tridimensional. A segunda abordagem será direcionada para a caracterização funcional das proteínas de L. major por meio da imunolocalização, interação das proteínas com macrófagos, superexpressão constitutiva dos genes nas formas promastigotas do parasita, análise da virulência e proteômica das formas superexpressoras do parasita.

Universal - 2008 - Proc. 475119/2008-8
O objetivo do projeto é a caracterização estrutural e funcional de duas proteínas de L. braziliensis, identificadas anteriormente em estudo de subproteoma de vesículas de espécies de Leishmania e, possivelmente, envolvidas na interação parasita/hospedeiro. A estratégia do projeto é baseada na associação de estudos de caracterização estrutural e cinética com análise funcional para elucidação das funções dessas proteínas na biologia do parasita. Os dois alvos, a Nucleosídeo Difosfato Kinase (NDK) e o Fator Inibitório de Migração de Macrófagos (MIF), foram selecionados com base nas funções imunomodulatórias que elas exercem em outros organismos patogênicos. O projeto será desenvolvido por meio de duas abordagens de estudo. A primeira direcionada para a caracterização estrutural e enzimática dos dois alvos por meio da clonagem e mutação sítio-dirigida dos genes, purificação das proteínas recombinantes, estudos de cinética enzimática, espectroscopia em solução e cristalização para resolução da estrutura tridimensional. A segunda abordagem será direcionada para a caracterização funcional das proteínas de L. braziliensis por meio da imunolocalização, interação das proteínas com macrófagos, superexpressão dos genes nas formas promastigotas de L. braziliensis, análise da virulência dos parasitas superexpressores.

A leishmaniose mucocutânea (ML) usualmente apresenta manifestações clínicas severas afetando a faringe e laringe, podendo ser letal se não adequadamente tratada. Na maioria dos casos a forma mucocutânea ocorre após a cutânea, podendo ser diagnosticada após meses ou anos depois da cura da lesão cutânea (2). Normalmente esse diagnóstico não é feito antes da destruição parcial da mucosa ou cartilagem do nariz do paciente (3). A freqüência de casos em que se detectou a forma ML em pacientes com lesões iniciais da CL não é conhecida e apenas com um minucioso exame otorrinolagológico é que se detecta tal manifestação (4). Um estudo, com 220 pacientes com LC (Jequié, Bahia), mostrou que 6 deles apresentaram ML concomitantemente com CL, sendo que esse diagnóstico foi feito com menos de 30 dias da progressão da doença (4). 
Para avaliar se há um papel do parasita no resultado clínico observado um nível de investigação é o do genoma expresso desses isolados. A grande conservação do genoma das diferentes espécies de Leishmania sugere que a diferença nos níveis e padrões de expressão de proteína seja uma chave para compreender diferenças clínicas resultantes. Por isso propomos a análise comparativa dos proteomas dos isolados que geram manifestações clínicas distintas em área endêmica única. O objetivo geral do projeto é a análise proteômica dos isolados de L. braziliensis provenientes de pacientes com manifestações clínicas diferentes: 1) Leishmaniose cutânea e (CL), 2) Leishmaniose mucocutânea concomitante com a cutânea oriundos da mesma região endêmica (LM+CL). Essa análise visa identificar proteínas diferencialmente expressas em L. braziliensis que tenham correlação com as manifestações clínicas apresentadas pelos pacientes, de mesma área endêmica, portando a mesma espécie do parasita.

Mestrado - FAPESP

Pós-doutorado - FAPESP