Chao Yun Irene Yan.

A diferenciação neural do sistema nervoso central e periférico depende da evolução do transcriptoma regulado por fatores de transcrição. A neurogênese e diferenciação progride gradualmente conforme o padrão de expressão de diversos fatores é alterado. Contudo, considerando a diversidade de tipos de células geradas no sistema nervoso, o número de fatores de transcrição neurais é limitado. 
Em outras palavras, a interação combinatorial no nível bioquímico e genético entre fatores de transcrição ?determina os programas genéticos que especificam a identidade neuronal. A complexidade dessas interações são tipicamente mapeadas numa rede regulatória gênica (Gene Regulatory Network). Estas redes inclui informações sobre os genes-alvo de fatores de transcrição e as relações de retro-regulação.
Aqui, propomos validar mapear o conectoma de outros fatores de transcrição presentes em progenitores neurais recém-egressas da mitose no desenvolvimento do tubo neural posterior/medula espinhal e no desenvolvimento do GRD. Nossas estratégias experimentais incluem mas não se limitam a análises in silico, alterações gênicas no embrião e verificação de fenótipo com ferramentas de biologia celular e molecular.

A complexidade dos processos envolvidos na geração de neurônios funcionais tem posado um desafio para a compreensão completa da diferenciação neural. Neste sentido, o investimento contínuo de esforços para caracterizar as vias de sinalização deflagradas durante a embriogênese do sistema nervoso não só tem valor direto para a área de Biologia do Desenvolvimento, como também pode contribuir com a otimização da diferenciação in vitro para fins terapêuticos. Nesta proposta, nós enfocaremos no papel do fator de transcrição Scratch2, expresso em todos os precursores neurais imediatamente após a cessão do ciclo mitótico e ingresso no processo de diferenciação. Resultados provenientes de vários modelos animais sugerem que a família Scratch tem um papel evolutivamente conservado no controle transcricional durante o desenvolvimento neural. Nós iremos investigar os seguintes aspectos do fator de transcrição Scratch2: 1) Regulação da expressão gênica de Scratch; 2) Genes-alvo de Scratch; 3) Regulação bioquímica da atividade nuclear de Scratch; 4) Papel de Scratch na diferenciação neural de células-tronco embrionárias.

Nesse projeto nos propomos determinar os genes-alvo de cScrt2 durante a diferenciação neural comparando o transcriptoma da medula espinhal em desenvolvimento e após perda de função de cScrt2. Para isto, coletaremos tubos neurais eletroporados com a forma dominante-negativa de cScrt2 (cScrt2N) e sequenciaremos por RNAseq as amostras eletroporadas e controle. A validação será priorizada para sequências de fatores transcricionais.

Neste projeto, nós enfocaremos no papel do fator de transcrição Scratch2, expresso em todos os precursores neurais imediatamente após a cessão do ciclo mitótico e ingresso no processo de diferenciação. Resultados provenientes de vários modelos animais sugerem que a família Scratch tem um papel evolutivamente conservado no controle transcricional durante o desenvolvimento neural. Nós iremos investigar os seguintes aspectos do fator de transcrição Scratch2:
1) Regulação da expressão gênica de Scratch;
2) Genes-alvo de Scratch;
3) Regulação bioquímica da atividade nuclear de Scratch;
4) Papel de Scratch na diferenciação neural de células-tronco embrionárias.

Nosso laboratório tem investigado os mecanismos celulares envolvidos na invaginação do placódio e nossos dados demonstram que a invaginação é precedida pelo realocamento de actina filamentosa e de miosina II na porção apical do tecido. A atividade do complexo PAR é necessária para definição do eixo apico-basal celular em outros contextos experimentais. e a organização e estabilização de microtúbulos durante as fases iniciais de polarização. O efeito da segregação das proteínas PAR é propagado e mantido por diversas vias de sinalização, dentre estas, a via da Cdc42 que é uma GTPase, cuja função é necessária para a polarização apico-basal. Neste projeto, nós propomos investigar a contribuição destes elementos acima mencionados na definição do domínio apico-basal que ocorre durante a conversão do ectoderma pré-placoidal cubóide no placóide do cristalino.

Os gânglios de raiz dorsal (GRD) pertencem ao sistema nervoso periférico, são localizados bilateralmente a medula espinhal e são constituídos de corpos celulares de neurônios sensitivos primários. Embora se saiba que estas estruturas são derivadas de células da crista neural há uma grande carência de estudos que visem entender molecularmente seu desenvolvimento. Recentemente nós clonamos no laboratório a seqüência codificadora do gene cScratch2 de galinha, um membro da superfamília Snail/Slug de fatores de transcrição que sabidamente atuam no desenvolvimento da crista neural e derivados. Estudos preliminares realizados por nosso grupo com embriões de galinha nos dão subsídios para acreditar que este gene exerce um papel fundamental no desenvolvimento do GRD. Neste projeto nós propomos investigar a função do fator de transcrição cScratch2 no desenvolvimento do GRD por meio de ensaios funcionais de aumento e diminuição da expressão desta em diversas fases do desenvolvimento embrionário de galinha. Além disso, tencionamos correlacionar a ação cScratch2 sobre a transcrição de genes-alvo com o seu efeito biológico na neurogênese em GRDs.

O desenvolvimento dos tecidos durante a embriogênese é resultado de múltiplos e concomitantes processos de sinalização e morfogênese. A formação do cristalino do olho é um exemplo clássico e ilustrativo destes processos. O cristalino se forma a partir da monocamada de epitélio cúbico sobrejacente à vesícula óptica denominada placódio do cristalino A aposição da vesícula óptica ao placódio marca o início de intensos eventos de sinalização e morfogênese ao final do qual todos os precursores dos componentes básicos do olho ficam corretamente posicionados no eixo próximo-distal: a vesícula do cristalino aposicionada distalmente ao neuroepitélio progenitor retiniano do cálice óptico, e a córnea recobrindo a vesícula do cristalino 
Neste projeto, nós propomos investigar a participação de mecanismos celulares na morfogênese inicial do placódio do cristalino utilizando para isto o modelo do embrião de galinha. A nossa estratégia para compreender os processos que regem a morfogênese do cristalino é tentar determinar se algum dos mecanismos envolvidos na morfogênese de outras estruturas epiteliais são relevantes para a formação do cálice óptico e a vesícula do cristalino. Especificamente, exploramos o papel de GTPases e proteínas PAR de polaridade celular na definição do eixo apico-basal celular e a segregação de proteínas do citoesqueleto envolvidas na contração apical.

Dentre os elementos que regem a embriogênese da crista neural, a superfamília de fatores de transcrição Snail se destaca pela conservação evolutiva de sua importância nas etapas de delaminação e migração. O gene Scratch é um membro desta superfamília cuja expressão foi identificada em diferentes regiões do sistema nervoso em formação. Experimentos de ganho e perda de sua função produziram alterações no desenvolvimento de precursores neurais em Drosophila e C. elegans. Identificamos uma seqüência homóloga a Scratch2 (Scrt2) em Gallus gallus (cScrt2) através de busca em uma base de dados de proteínas, o que possibilitou a clonagem de sua seqüência parcial. Análises por RT-PCR e hibridização in situ mostraram que sua expressão se inicia no tubo neural, logo após seu fechamento. Neste projeto, nós nos propomos a investigar papel do fator de transcrição Scratch na neurogênese do tubo neural e gânglios da raiz dorsal. Especificamente, iremos realizar experimentos funcionais e mecanísticos em embriões de galinha. Nossos dados preliminares indicam que Scratch pode ter um papel na neurogênese da medula espinhal e dos gânglios da raiz dorsal.

O objetivo principal deste trabalho é caracterizar os mecanismos celulares que modulam a presença de junções adesivas na embriogênese ocular. Especificamente, iremos investigar: A importância das junções aderentes no desenvolvimento ocular;o papel das GTPases Rac1 e Cdc42 na estabilização de junções aderentes; participação de IQGAP1 na modulação de junções aderentes. Para tal, utlizaremos a técnica de superexpressão gênica por eletroporação in ovo de formas dominante negativas de GTPases e a o IQGAP1 de humanos.