Paulo Eduardo Brandão.

EMU: Manutenção corretiva e atualização de software e hardware de Sequenciador de automático de DNA ABI 3500 Genetic Analyzer

Despite its 100 lethality and the circa 59,000 human deaths every year, rabies is still in want of an effective treatment. A host of trials is described aiming at impairing the life cycle of Lyssavirus rabies (RABV), the chief worldwide lyssavirus causing rabies, but with limited success. Treatments targeting host factors and to circumvent the lesions caused by RABV have also shown unsatisfactory. As an attempt to shed some light on the treatment of rabid patients, this applications aims a. to assess the effect of the intracerebral transfection of anti-RABV recombinant monoclonal nanobodies as antivirals against rabies in vivo in a post-exposition protocol, b. to select in silico antiviral candidates against RABV using molecular docking and molecular dynamics and c. to test in vitro, in cell cultures, the selected antiviral candidates against RABV, obtained by molecular docking and dynamic and drug repurposing. Molecular dynamics will be run with the ligands Platyphylline, Rufloxacin, 2,3-dehydroofloxacin and 2-[4-(4-Morpholinylsulfonyl)phenyl]-1H-isoindole-1,3(2H)-dione and all RABV proteins (N, P, M, G and L). The in vitro assays will be run in N2A cells inoculated with the PV strain of RABV using the repurposed drugs Methotrexate hydrate, Pitstop 2, Diclazuril or 2,3-dehydroofloxacin. For the in vivo assay, mice intranasally inoculated with the CVS strain of RABV will be injected via the intracerebral route with six different anti-RABV llama-derived nanobodies complexed with a transfection agent. It is expected that the outcomes of this application might improve the candidate anti-RABV protocols already available, such as antibody delivery, the surveying of antiviral candidates in silico and the running of trials on repurposed antiviral drugs, all low-cost proxies to a rational treatment for rabies.

Quasispecies is a term used to describe the collaborative population genetics of multiple sub consensus variants under a dominant genomic sequence of RNA and some DNA viruses. Each variant on the spectrum might show a different fitness, which changes according to the selection pressures such as immune response and host spillovers. For Avian coronavirus (AvCoV), the effects of host shift on the quasispecies evolution has either been assessed with low-coverage sequence methods or at low passage number in cell cultures. Furthermore, the effect of the humoral immunological diversity upon this phenomenon has not been assessed. To cover these aspects, the aims of this project are threefold: to measure the effects of chicken hyperimmune sera against different AvCoV vaccine strains on the fitness of a fixed AvCoV strain in cell culture using qPCR, to assess the quasispecies constitution of this same AvCoV fixed strain after incubation with chicken hyperimmune sera against different AvCoV vaccine strains using deep sequencing and to follow the quasispecies evolution of the AvCoV fixed strain after serial passages in cell culture. To this end, the Beaudette strain of AvCoV will be serially passaged in VERO cells up to the 15th passage and full genome variants and fitness will be assessed with deep-sequencing and qPCR, respectively. In another experiment, the Beaudette strain will be incubated with sera from chicken vaccinated with homologous and heterologous AvCoV strains and analyzed likewise. This project is expected to give results on quantitative indicators of coronaviruses quasispecies, both in terms of the fluctuations of the frequencies of each variant and under a range of immune selection pressures as well as insights on the consequences of vaccination for coronavirus-caused diseases.

O Coronavírus aviário ACoV (Nidovirales: Coronavirinae: Coronaviridae:Gammacoronavirus), conhecido
como Vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV)é um vírus RNA-linear simples fita de sentido positivo
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com 27kb que codificam para a poliproteína replicase e um conjunto de proteínas estruturais localizadas no
envelope (S, E e M) e no nucleocapsídeo (N). Uma variedade de sorotipos é conhecida em função de
polimorfismos na proteína S e todos podem levar a doenças dos tratos respiratório, entérico, reprodutivo e
renal de Galus gallus. N oBrasil, o tipo BRazil de ACoV é o mais prevalente, ocorrendo sob a forma de, pelo
menos, quatro sublinhagens disseminadas pelo país e com uma baixa proteção conferida por vacinas do tipo
Massachusetts. Com resultado de altas taxas de mutação e evolução, como outros vírus RNA o ACoV evolui
como uma nuvem de variantes ao redor de uma sequência dominante, o que é conhecido como espectro de
mutantes ou quase-espécies. Frente a ausência de sequências de genomas completos de ACoV tipo Brazil e
dos poucos dados disponíveis sobre quase-espécies em ACoV, este estudo foi desenhado para gerar
sequencias de genomas completos de isolados de ACoV do referido tipo e estudar a constituição de espectro
de mutantes utilizando sequenciamento profundo e analise de mutantes. Para este fom, amostras de órgãos
de frangos serão triadas para a presença de ACoV utilizando-se RT-PCR e as amostras tipificadas como tipo
Brazil por sequenciamento de Sanger dirigido ao gene S serão levadas a tentativas de isolamento em ovos
embrionados de galinha. Isolados em número máximo de 15 serão filtrados por membranas de 0.45 µm,
tratados com DNAse e RNAse e o RNA extraído será utilizado para síntese de dsDNA ramdômico seguida de
preparação de bibliotecas de DNAe sequencimanto profundo com a plataforma NextSeq500? (Illumina). A
seguir, genomas completos serão montados e o espectro de mutantes analisados com o software CLC
Genomics Workbench software (Qiagen). Os resultados esperados são tanto contribuir para o entendimento
da evolução de Coronaviridae quanto dar suporte aos campos de Vacinologia e Epidemiologia Molecular em
bronquite infecciosa das galinhas.

Coronaviruses (Nidovirales: Coronaviridae: Coronavirinae) use a wide range of mammalian and avian species as hosts, having evolved with the ancestors of these animals since at least 293 million years, leading to diverse kinds of virus-host relationships such as pathologic processes of the respiratory, reproductive, enteric and urinary tracts or asymptomatic infections as in Chiropterans, the targets of the most recent evolutionary and epidemiological investigations regarding coronaviruses. The co-evolution of the coronavirus-host systems has been widely investigated regarding phylogeny, quasi-species population genetics, cell pathology, immune response, receptors and transmission, but studies based on codon usage are scarce. In this regard, this Project aims to measure codon usage for structural and non-structural proteins genes in coronavirus species regarding the codon usage found in different replication sites in mammalian and avian species, to define the evolutionary forces that rule codon usage in Coronavirinae and to study in a compared manner the selection regime in Coronavirinae based on both codon usage and nucleotides. The expected outcomes are the contribution to the understanding of the molecular evolution of coronaviruses and hosts, allowing the prediction of the fitness of new coronaviruses to different hosts, as well as the validation of codon-based molecular phylogeny methods to be applied to other virus-host systems.

A raiva é uma zoonose de evolução 100% letal e continua um problema de saúde pública. O protocolo atual utilizado para tratamento da raiva humana propõe o uso de antivirais como quetamina, ribavirina, midazolam e amantadina, mas a falta de reprodutibilidade do sucesso do mesmo em pacientes humanos é um problema atual. Este projeto tem por objetivos testar in vitro em células da linhagem BHK-21 protocolos antivirais baseados em interferência por RNA (RNAi) utilizando short-interfering RNAs (siRNAs) contra a seqüência-líder e conta mRNA da nucleoproteína (N) de amostras de vírus da raiva (RABV) fixa (PV) e duas amostras de campo (isoladas de cão e de bovino) com diferentes doses letais e protocolos de transfecção, aplicando-se a seguir in vivo em camundongos o protocolo mais eficiente também frente às três cepas virais por administração de siRNA via intra-craniana, medindo-se as eficiências de inibição in vitro e in vivo por imunofluorescência direta e PCR quantitativa para mRNA de N, além de se avaliarem possíveis efeitos tóxicos por meio de PCR quantitativa para mRNA de Beta-actina. Pretende-se com isto contribuir para o desenvolvimento de antivirais que possam ser somados àqueles já existentes para aprimorar o tratamento de pacientes com raiva e diminuir a letalidade da doença.

Valor total = R$ 179.000,00

Valores: R$150.957,29 	US$26.374,10

PROCAD Novas Fronteiras em colaboração com o Programa de Pós-Gaaduação em Ciência Animal da UFERSA, sob coordenação geral do Prof. Sidnnei M. Sakamoto (UFERSA) e com colaboração do Prof. Dr. Marcos Bryan Heinemann (UFMG)

Valor = R$ 18.708,00

VALOR TOTAL 	R$ 56.671,00

VALOR TOTAL 	R$ 41.360,72

VALOR TOTAL R$ 150.832,61