Elen Haruka Miyabara.

The skeletal muscle corresponds to approximately 40 of the body mass, and its integrity is fundamental for maintaining the quality of life. In this context, a better understanding and discussion of the recent advances in the field of skeletal muscle physiology and pathology will allow the development of better therapeutic strategies to attenuate muscle wasting, improve muscle regeneration and treat muscle diseases. The "1st Symposium on Skeletal Muscle Physiology and Pathology", which will be held at the Butantã campus of the University of São Paulo on November 13-14, 2023, is a scientific meeting organized by researchers from Brazil and abroad to discuss recent advances in the field of skeletal muscle physiology and pathology and novel therapeutical strategies of treatment and prevention, with focus on three central axes: 1) muscle trophism, 2) muscle regeneration, 3) muscle diseases. This event will have the support of the Brazilian Society of Physiology, the Institute of Biomedical Sciences at USP, the Faculty of Medicine of Ribeirão Preto at USP, and the University of Minnesota, USA. The event aims to promote interaction between Brazilian and international researchers, favoring the exchange of ideas, potentially resulting in the establishment of new collaborations in research projects and the exchange of students and researchers. The symposium will also be an opportunity for post-docs and graduate and undergraduate students in the field to interact with other research groups and present their work in the form of "pitch" presentations. Also, due to its free nature and openness to the community, this will be an opportunity to disseminate knowledge to professionals and people related to the field.

The integrity of skeletal muscle mass and function is fundamental for the maintenance of quality of life. Adult skeletal muscles have a remarkable capacity of regeneration after injury mainly due to the presence of muscle stem cells, called satellite cells. In addition, the fibro-adipogenic progenitor cells (FAPs) assist satellite cells during the muscle regenerative process. However, during aging the function of satellite cells significantly decreases, which leads to a significant impairment of muscle regeneration. Considering that the life expectancy has progressively increased worldwide in the last decades, a better understanding of the cellular and molecular mechanisms involved in the deficit of the muscle regenerative potential, which occurs during aging, is essential for the development of more efficient strategies able to improve the regenerative potential of the aged skeletal muscle and consequently increase quality of life. In this context, our preliminary results suggest the potential of an eccentric exercise protocol to attenuate muscle environment culprits associated with aged muscles: inflammation and fibrosis. Therefore, the two main objectives of this project are i) to contribute to the better understanding of the age-related processes that contribute to the decline of the muscle regenerative capacity, and ii) to identify potential therapeutic targets modulated by the eccentric exercise in the muscle, to improve stem cell function and muscle regeneration during aging. Overall, our purpose is to analyze the potential of therapeutic targets, by manipulating their expression in satellite cells, FAPs and regenerating muscles from aged mouse models. Finally, we will also analyze the impact of these manipulations in the aged muscle niche on age-related processes of human skeletal muscle progenitor cells.

O músculo esquelético possui apreciável capacidade regenerativa, a qual é especialmente atribuída à ação das células tronco musculares nomeadas células satélite. Adicionalmente, as células progenitoras fibro-adipogênicas (FAPs) residentes no músculo esquelético proporcionam um nicho favorável à atuação das células satélite durante a regeneração muscular. No entanto, durante o envelhecimento as FAPs agem de forma ineficiente após lesão muscular, se apresentando acumuladas e secretando de maneira aberrante fatores profibróticos na musculatura esquelética. Por conseguinte, ocorre comprometimento da ativação e diferenciação das células satélite durante a regeneração muscular no idoso. Neste contexto, a melhor compreensão dos mecanismos celulares e moleculares que culminam na reduzida resposta regenerativa muscular que ocorre durante o envelhecimento é fundamental para o desenvolvimento de estratégias mais eficientes na melhoria da capacidade regenerativa muscular e da qualidade de vida de idosos, visto que a expectativa de vida destes indivíduos tem crescido expressivamente nas últimas décadas. Assim, considerando que 1) nosso grupo reportou previamente que a ausência do adrenoceptor beta 2 em camundongos acarreta remodelamento anormal do tecido conjuntivo em músculos em regeneração e comprometimento da função de células tronco musculares, e consequentemente da regeneração muscular estrutural e funcional, 2) resultado preliminar do nosso laboratório sugere que o adrenoceptor beta 2 influencia a expressão gênica de IL33, a qual é secretada por FAPs, durante a regeneração muscular em camundongos jovens, 3) o adrenoceptor beta 2 contribui para a regulação do metabolismo de lipídios e glicose durante o envelhecimento e a estimulação beta 2 adrenérgica promove a reparação de lesões musculares em camundongos idosos submetidos à simpatectomia química, bem como atenua a redução do número de células satélite e da atividade simpática; e 4) as FAPs influenciam criticamente a função das células satélite e a reparação da matriz extracelular durante a regeneração muscular e atuam de forma aberrante durante o envelhecimento, o que contribui para a deficiente capacidade regenerativa muscular; é possível hipotetizar que a sinalização dependente do adrenoceptor beta 2 exerce influência sobre a função das FAPs durante a regeneração muscular em idosos. Dessa forma, o objetivo geral deste projeto é investigar a influência do adrenoceptor beta 2 sobre a função das FAPs no contexto da regeneração muscular de idosos.

As células satélite, uma população pós-natal de células tronco musculares, são importantes para o desenvolvimento muscular pós-natal pois se fundem de forma a proporcionar o crescimento das fibras musculares. Além disso, as células satélite contribuem para a manutenção da integridade da massa muscular, além de serem essenciais para que o marcante processo regenerativo do músculo esquelético seja bem sucedido. Em geral, a regeneração muscular esquelética engloba a instalação de um processo inflamatório, seguida da ativação de células satélite, e subsequente proliferação destas. Em seguida, uma pequena fração dessas células retorna à quiescência e a maioria delas se diferencia para reconstituir o tecido muscular previamente lesado. As alterações morfológicas que ocorrem durante a regeneração muscular são bem conhecidas, no entanto as alterações moleculares envolvidas nesse processo ainda não são totalmente elucidadas. Neste contexto, estudos iniciais sugeriram que o adrenoceptor β2 poderia ser um possível regulador do processo regenerativo muscular, ao demonstrarem que o tratamento com agonistas β2-adrenérgicos sintéticos em animais antecipa a proliferação de células satélite e melhora a estrutura e a função de músculos esqueléticos em regeneração. Trabalhos posteriores publicados pelo nosso grupo avaliaram a regeneração muscular em camundongos knockout para o adrenoceptor β2 e demonstraram que o adrenoceptor β2 é importante para a regeneração morfológica e funcional do músculo esquelético, pois este receptor está envolvido 1) na regulação do recrutamento de macrófagos para o tecido muscular em regeneração, por meio da ativação de TGF-b receptor I (TβR -I) / Smad2/3 e redução da expressão de akirina 1, um quimioatraente de macrófagos (SILVA et al., 2014); e 2) no remodelamento do tecido conjuntivo intramuscular durante a regeneração do músculo esquelético, por meio da redução da atividade da matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) (SILVA et al., 2016). Diante do exposto, embora esses trabalhos tenham reportado a importância do adrenoceptor β2 para o processo regenerativo muscular, há ausência de estudo sistemático sobre o papel do adrenoceptor β2 na função das células satélite. Dessa forma, este projeto tem como objetivo investigar o papel do adrenoceptor β2 na proliferação e diferenciação das células satélite.

A síndrome de Marfan (SMF) é caracterizada por uma desordem sistêmica autossômica dominante que acomete o tecido conjuntivo, pois ocorre mutação no gene fibrilina-1, com consequente alteração na proteína fibrilina-1. Tal proteína é a principal componente de microfibrilas presentes na matriz extracelular de tecidos conjuntivos elásticos e não-elásticos. Considerando-se que: 1) os mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento de fadiga muscular, na redução do tamanho e número de fibras musculares e de força muscular de indivíduos com SMF ainda não estão bem esclarecidos e há ausência de estudos sistemáticos caracterizando a força muscular e a resistência à fadiga muscular desses indivíduos; e que 2) modelos animais da SMF têm sido desenvolvidos para aprofundar as investigações e melhor compreensão desta síndrome; o melhor entendimento da função contrátil muscular em indivíduos com essa síndrome é essencial para o desenvolvimento de melhores estratégias de reabilitação muscular de pacientes com SMF. Além disso, tendo em vista que 3) trabalhos têm demonstrado a eficácia do exercício excêntrico na prevenção da perda de massa muscular e/ou na melhoria da força muscular; a aplicação deste exercício poderia ser uma viável estratégia de reabilitação fisioterapêutica de pacientes com SMF. Portanto, o presente projeto tem como objetivo contribuir para o melhor entendimento da função contrátil muscular esquelética de camundongos modelo da SMF (com mutação na fibrilina-1) e investigar o efeito de um protocolo de exercício excêntrico (corrida em declive) sobre a reabilitação estrutural e funcional do músculo esquelético desses animais. Para tanto serão avaliados aspectos macroscópicos, histológicos, moleculares e funcionais dos músculos sóleos de camundongos com SMF e selvagens controle e submetidos a um protocolo de exercício excêntrico.

A síndrome de Marfan (SMF) é uma desordem sistêmica autossômica dominante do tecido conjuntivo em que ocorre mutação no gene fibrilina-1, resultando em alterações na proteína fibrilina-1, a principal constituinte de microfibrilas da matriz extracelular, presente em tecidos conjuntivos elásticos e não-elásticos. Apesar de pouco estudadas, alterações na musculatura esquelética de camundongos deficientes de fibrilina-1 e de pacientes com SMF são frequentes, tais como, diminuição no número e no tamanho de fibras musculares, fibrose muscular, deposição de tecido adiposo, fragmentação de fibras musculares, hipotonia, redução da força e susceptibilidade à fadiga. Embora um trabalho tenha relatado um déficit na regeneração muscular em animais com mutação na fibrilina-1, os mecanismos celulares e moleculares que caracterizam a prejudicada resposta regenerativa muscular desses indivíduos ainda não foram sistematicamente investigados. Ademais, a investigação de possíveis estratégias terapêuticas no intuito de melhorar o potencial regenerativo do tecido muscular desses indivíduos tem sido pouco explorada. Diante do exposto, o objetivo deste estudo é contribuir para o melhor entendimento dos aspectos morfológicos, celulares, moleculares e funcionais do processo regenerativo muscular em indivíduos com SMF, especialmente da função das células satélites utilizando-se do método genético que se baseia no sistema Cre/loxP para marcar geneticamente as células satélites em modelo animal de SMF (favor verificar detalhes no projeto); bem como testar possíveis estratégias terapêuticas [tratamento farmacológico com Ang-(1-7) e transplante de células satélites hiperexpressantes da proteína de choque térmico 70 kDa; HSP70] no intuito de melhorar a capacidade regenerativa do tecido muscular desses indivíduos.

Projeto de Auxílio à Pesquisa - INFRA-USP (2013.1.14328.1.6)

Com o avanço da idade ocorre perda gradual da massa muscular e um marcante déficit do potencial regenerativo da musculatura esquelética em idosos. Diante do crescente aumento da expectativa de vida e da importância da integridade muscular para a manutenção da qualidade de vida, torna-se cada vez maior o interesse na investigação de estratégias terapêuticas capazes de minimizar os efeitos deletérios do envelhecimento sobre a musculatura esquelética. Neste contexto, o estudo de possíveis agentes terapêuticos na atenuação do referido déficit regenerativo muscular em idosos ainda é pouco explorado. Um bom candidato seria o aminoácido leucina, por ser um agente anabólico, o que poderia maximizar a recuperação do tamanho das fibras musculares em regeneração, acarretando na melhora da estrutura e consequente função muscular. Evidências mostram que a suplementação com o aminoácido leucina ativa fatores envolvidos com o início da tradução como o eIF-4E e o eIF-4G além da fosforilação da p70S6K resultando no ganho de massa muscular. Além disso, tem sido descrito que a suplementação com leucina em modelos animais de atrofia ou caquexia muscular resulta em aumento da massa muscular pelo aumento de síntese proteica, na qual a via PI3K/Akt/mTOR é altamente ativada. Neste contexto, o papel da suplementação nutricional com o aminoácido leucina na regeneração muscular em jovens e idosos ainda necessita ser explorado. Portanto, o objetivo deste projeto é investigar o efeito da suplementação com o aminoácido leucina na regeneração de músculos esqueléticos de ratos jovens e idosos criolesados. Para tanto, serão analisados aspectos macroscópicos (massa muscular), histológicos (morfologia geral), imunohistoquímicos (detecção de células satélites em proliferação e de células musculares em diferenciação), moleculares (ensaio de síntese protéica, perfil de ativação de elementos das vias PI3K/Akt/mTOR e ubiquitina proteassoma) e funcionais (análise da contração muscular) da regeneração do músculo tibialis anterior de ratos jovens e idosos submetidos à criolesão.

A regeneração do músculo esquelético é essencial para a integridade muscular, no entanto os mecanismos intracelulares envolvidos nesse processo ainda não estão totalmente esclarecidos. Um possível regulador do processo regenerativo muscular seria o receptor beta2-adrenérgico, pois têm sido descrito que agonistas beta2-adrenérgicos sintéticos são capazes de maximizar a recuperação do tamanho das fibras musculares em regeneração, acarretando na melhora da estrutura e consequente função de músculos de animais jovens. Além disso, estudos têm mostrado que o agonista beta2-adrenérgico clembuterol é capaz de antecipar a proliferação de células satélites em músculos jovens transplantados. Nosso grupo também demonstrou recentemente que o agonista beta2-adrenérgico formoterol melhora a regeneração estrutural e funcional de músculos esqueléticos de ratos idosos (Conte, T. C. et al., 2012). Portanto, o receptor beta2-adrenérgico possivelmente deve exercer um papel importante no processo regenerativo muscular. Dessa forma, nós decidimos estudar o papel do receptor beta2-adrenérgico na regeneração muscular utilizando-se camundongos knockout para este receptor. Para tanto, serão analisados aspectos macroscópicos (peso corporal e muscular), histológicos (coloração de azul de toluidina), imunohistoquímicos (detecção de macrófagos, células satélites ativadas/em proliferação e de células musculares em diferenciação no tecido muscular dos camundongos knockout), celulares (utilizando-se cultura de células satélites isoladas de músculos por meio do fluorescence activated cell sorter - FACS, para análise da proliferação e da diferenciação celular in vitro), moleculares (mensuração do conteúdo de AMPc tecidual, detecção da expressão de proteínas relevantes para o processo regenerativo muscular como miostatina, akirina-1 e de proteínas da via PI3K/ AKT/mTOR) e funcionais (análise da contração muscular) em diferentes fases da regeneração (1, 3, 10 e 21 dias após lesão) dos músculos soleus. O papel do receptor beta2-adrenérgico nos processos de proliferação das células satélites e subsequente diferenciação in vitro, também será abordado por meio do silenciamento pós-transcricional do gene do receptor beta2-adrenérgico através da transfecção de células satélites (isoladas dos membros posteriores de camundongos selvagens) com RNA de interferência.

É bem estabelecido que as proteínas de choque térmico (HSPs) desempenham o importante papel citoprotetor contra diversos estímulos nocivos. No músculo esquelético foi demonstrado que a HSP70 induzível (HSP70i) exerce importante proteção contra lesões induzidas por contrações repetidas e por congelamento. No entanto a influência das HSPs na regeneração muscular e na atrofia muscular e subsequente recuperação não é bem esclarecida, poucos trabalhos têm tocado nessas questões demonstrando que a indução de HSPs no músculo esquelético pelo radicicol é capaz de melhorar a regeneração do tecido muscular (Conte et al., 2008), no entanto os mecanismos intracelulares envolvidos nesse processo ainda não são conhecidos. Além disso, a indução de HSPs induzida por temperatura elevada é capaz de atenuar a atrofia de músculos e de estimular a síntese protéica (Naito et al., 2000). Considerando-se que 1) estratégias terapêuticas mais eficientes no intuito de prevenir os efeitos deletérios sobre o músculo esquelético ou melhorar a resposta muscular podem ser extremamente interessantes em situações de demanda reduzida (desuso da musculatura esquelética) e de demanda aumentada (recuperação de massa muscular após lesão ou após períodos de imobilização) respectivamente; e 2) a indução de HSPs têm conferido a proteção e/ou melhor recuperação de diversos tipos celulares; nós propomos investigar o efeito da indução de HSPs (utilizando-se a indução farmacológica pelo tratamento com radicicol e camundongos transgênicos hiperexpressantes de HSP70i) na prevenção contra atrofia muscular e na melhoria da recuperação do músculo esquelético após injúria e atrofia.

A regeneração muscular esquelética é essencial para a integridade muscular. Apesar de o processo regenerativo muscular ter sido amplamente estudado, os possíveis agentes terapêuticos capazes de melhorar tal processo ainda foram pouco explorados. Nesse contexto, o papel da estimulação elétrica de alta voltagem (EEAV) e do laser de baixa potência Arseneto do Gálio (GaAs, 904 nm) na regeneração muscular ainda necessitam ser esclarecidos. Portanto, o objetivo deste projeto é investigar o efeito da EEAV e do laser GaAs na regeneração de músculos esqueléticos de ratos criolesados. Para tanto os músculos tibialis anterior (TA) serão submetidos ao tratamento diário com EEAV ou com o laser GaAs (por favor verificar detalhes do tratamento na sessão Material e Método) começando no 1 dia após a lesão muscular até o 3º, 10º e 21º dias pós-lesão, períodos estes em que os animais serão sacrificados e os músculos serão removidos para posterior análise morfológica (através da coloração de azul de toluidina, imunohistoquímica para detecção de células satélites de fibras em regeneração muscular), determinação da expressão gênica dos fatores regulatórios miogênicos (MyoD, Myf-5, miogenina e MRF-4) e da função contrátil.

Com o avanço da idade ocorre perda gradual da massa muscular e um marcante déficit do potencial regenerativo da musculatura esquelética em idosos. Diante do crescente aumento da expectativa de vida e da importância da integridade muscular para a manutenção da qualidade de vida, torna-se cada vez maior o interesse na investigação de estratégias terapêuticas capazes de minimizar os efeitos deletérios do envelhecimento sobre musculatura esquelética. Neste contexto, o estudo de possíveis agentes terapêuticos na atenuação do referido déficit regenerativo muscular em idosos ainda é pouco explorado. Bons candidatos são os agonistas b2-adrenérgicos sintéticos, por serem agentes anabólicos capazes de maximizar a recuperação do tamanho das fibras musculares em regeneração, acarretando na melhora da estrutura e conseqüente função de músculos jovens. Além disso, estudos têm mostrado que o agonista b2-adrenérgico clembuterol é capaz de antecipar a proliferação de células satélites em músculos jovens transplantados e que este mesmo agonista induz a expressão de genes musculares envolvidos na diferenciação miogênica em camundongos adultos. Portanto, agonistas b2-adrenérgicos poderiam minimizar o déficit regenerativo muscular em idosos não apenas através da melhora do trofismo das fibras musculares em regeneração, mas também através da melhora do processo regenerativo. Considerando-se que 1) apesar de se conhecer os efeitos benéficos de agonistas b2-adrenérgicos sobre a regeneração muscular em nível estrutural, os mecanismos intracelulares envolvidos nesse processo ainda estão pouco esclarecidos, e que 2) ainda não se conhece o possível papel de agonistas b2-adrenérgicos sobre a atenuação do déficit regenerativo muscular em indivíduos idosos; nós decidimos estudar o papel do agonista b2-adrenérgico formoterol (mais seletivo ao adrenoceptor b2 do que os agonistas da velha geração e, portanto, menos deletério ao coração) em aspectos histológicos (proliferação de células satélites), moleculares (síntese e degradação protéica, perfil de ativação de elementos das vias reguladoras do trofismo muscular: dependente de AMPc, P13K-AKT-mTORC1 e ubiquitina-proteassoma) e funcionais da regeneração dos músculos soleus e tibialis anterior (TA) de ratos jovens e idosos.

Fosfolipases A2 secretadas (sPLA2) são enzimas que catalisam a hidrose da ligação acil Sn-2 de glicerofosfolípides, de modo cálcio dependente, gerando ácidos-graxos livres e lisofosfolipides. As sPLA2 oriundas de veneno de cobras podem ser classificadas farmacologicamente em neurotóxicas e não-neurotóxicas. Um bom exemplo de sPLA2 neurotóxica é a crotoxina (CTX), um componente do veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus. Entre as sPLA2 não-neurotóxicas, dois tipos diferentes são descritos: a "clássica" Asp-49, a qual hidrolisa glicerofosfolipides como citado anteriormente, e a "variante" Lys-49, que é homóloga à Asp-49, porém é descrita como não-catalítica. As miotoxinas II (Mt II) e III (Mt III) isoladas do veneno de Bothrops asper, são exemplos bem caracterizados de Lys-49 e Asp-49, respectivamente. Apesar da CTX (sPLA2 neurotóxica) e das miotoxinas Mt II e Mt III (sPLA2 não-neurotóxica) induzirem lesão muscular esquelética com características estruturais bem conhecidas e similares, os mecanismos intracelulares que medeiam tal lesão são pouco explorados. Nesse sentido, possíveis candidatas a mediadoras intracelulares dessa ação são as proteínas de choque térmico (HSPs), uma vez que essas proteínas estão envolvidas em várias situações de lesão celular. Portanto, o objetivo desse projeto é investigar o papel das HSPs na ação miotóxica induzida por sPLA2 neurotóxica (CTX) e não-neurotóxicas (Mt II e Mt III) no músculo gastrocnemius de camundongos e em cultura primária de fibras musculares tratados com radicicol, um indutor de HSPs.