Fábio Luis Forti.

O glioblastoma multiforma (GBM) é o tumor cerebral mais agressivo que cresce e se espalha rapidamente. Sua malignidade se deve também à sua alta resistência às terapias convencionais, prognóstico pobre e alta taxa de reincidência pós-terapias com sobrevida de 1-2 anos apenas. Trabalhos anteriores do grupo têm contribuído para novas propostas de alvos moleculares que oferecem uma vantagem de pré-sensibilização das células tumorais e redução de resistência às terapias. Nós mostramos que a via das Rho GTPases e remodeladores do citoesqueleto de actina são mediadores importantes não só para processos de motilidade, invasividade e estabilidade genômica destas células, mas parecem também estar mediando propriedades tronco-tumorais de GBMs resistentes. Por outro lado, a fosfatase dual DUSP12, escassamente explorada em GBMs e com papéis importantes em hepatocarcinoma (HCC), pode ser outro alvo molecular atuando na resposta destas células às terapias convencionais. Este projeto pretende se focar em duas frentes moleculares distintas, porém visando o mesmo outcome: a quimio e radioresistência terapêutica de GBMs. Para tal, iremos utilizar modelos celulares em monocamada e esferóides de GBMs, normais, quimioresistentes e radioresistentes, desenvolvidos em nosso laboratório, e submetê-los à modulação: 1) da via de Rho GTPases e o citoesqueleto de actina, e 2) da fosfatase DUSP12 e um de seus alvos nucleares, a proteína NAT10, que em HCC e outros cânceres têm mostrado ser um regulador importante do ciclo celular, reparo de DNA, organização da cromatina, expressão gênica e arquitetura nuclear, processos ímpares de manutenção de estabilidade genômica imprescindíveis na transformação e resistência tumoral.

Bolsa de Produtividade em Pesquisa Nível 2 (PQ2) - CNPq (Processo No 304357/2024-3)

NOME: Chamada CNPq/MCTI/FNDCT N 22/2024 - Programa Conhecimento Brasil - Apoio aProjetos em Rede com Pesquisadores Brasileiros no ExteriorSIGLA: ConhecBrasil-REDES

Câncer é uma doença com origens e características complexas. A quimioterapia é uma das principais formas de tratamento do câncer, entretanto a sua eficácia muitas vezes é limitada pelo desenvolvimento de resistência às drogas utilizadas. O ponto chave da resistência a quimioterápicos está associado à falta de conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos neste processo, dificultando o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais específicas. Devido à multiplicidade dos tipos de câncer e heterogeneidade dos tumores, a resistência a drogas antitumorais em geral não é baseada em um único mecanismo, mas em um conjunto de vias moleculares. O objetivo deste projeto é a identificação de genes e vias moleculares envolvidos na resistência a drogas antitumorais, determinar e implementar estratégias terapêuticas para eliminar esses mecanismos e, consequentemente, otimizar a eficácia terapêutica dos quimioterápicos usados na clínica. Serão utilizados como modelos de estudo tumores humanos agressivos e de alta relevância clínica, como melanomas, gliomas, leucemias agudas e hepatocarcinomas. Serão avaliados mecanismos de resistência frente a agentes antitumorais clássicos, como cisplatina e temozolamida, e a novas estratégicas terapêuticas, como terapia fotodinâmica, agentes desestabilizadores do citoesqueleto e novos compostos coordenados de Rutênio e Cobre. Ainda, será avaliado como as células tumorais respondem às lesões de DNA produzidas por agentes quimioterápicos genotóxicos. E, por fim, estratégias celulares conhecidamente envolvidas na resistência à quimioterapia serão investigadas, tais como: mecanismos de reparo de DNA, vias de proteção ao estresse oxidativo, autofagia e alterações da arquitetura do citoesqueleto. Os resultados deste estudo poderão contribuir de forma significativa para a solução ou minimização da resistência tumoral à quimioterapia, maior obstáculo para a cura de pacientes com câncer representando um dos principais problemas de saúde pública.

Modulação da atividade fosfatásica da TCPTP/PTPN2: efeitos na sinalizaçãode células do sistema imune.

Uma melhor compreensão dos mecanismos de ação da tirosina fosfatase DUSP12 pode identificar potenciais relações com distúrbios celulares e sugerir formas de intervenção em sua atividade enzimática tornando-a um alvo de drogas com interesses clínicos. Esta tirosina fosfatase de atividade dual (DUSP) é conhecida por desfosforilar preferencialmente fosfo-tirosinas - mas também fosfo-serina ou fosfo-treonina - de proteínas substratos. Ela é amplamente expressa em diversos tipos de tecidos normais e tumores humanos como mama, cervix, cólon, pulmão, pâncreas, fígado, estômago e sangue. Há evidências experimentais de que estas enzimas podem atuar na regulação direta ou indireta de mecanismos de manutenção de estabilidade genômica como ciclo celular, reparo de DNA, organização da cromatina, expressão gênica e até arquitetura nuclear, os quais são imprescindíveis na transformação e/ou resistência tumoral.
Nosso grupo identificou parceiros protéicos nucleares de DUSP12 em linhagens celulares de adenocarcinoma de mama e pulmão submetidas a diferentes tipos de estresse genotóxico e encontrou conexões funcionais importantes com o citoesqueleto, a cromatina, a maquinaria de splicing e maturação ribossômica. Este projeto pretende investigar detalhes moleculares e funcionais da proteína DUSP12 e de sua interação com as proteínas HP1BP3 e NAT10. O entendimento das relações funcionais entre elas e mecanismos de integridade e organização da cromatina pode apontar a relevância desta fosfatase para processos nucleares envolvidos com a malignidade de certas células tumorais.

Proteínas tirosina fosfatases (PTPs) regulam a sinalização e outros processos bioquímicos através da desfosforilação de proteínas no resíduo de tirosina; a interrupção do seu funcionamento pode levar a doenças e distúrbios graves. Dentro da classe I de PTPs de catálise baseada em cisteína, PTPRC (ou CD45) é o protótipo de toda a superfamília e identificado como o elo inicial entre as fosfatases e o sistema imunológico. Esta proposta de projeto está focada na proteína tirosina fosfatase N2 (PTPN2), também conhecida como proteína tirosina fosfatase de células T (TCPTP), que é altamente homóloga à PTP1B, a primeira PTP não-receptora identificada (PTPN1). A PTPN2 é um importante regulador da sinalização celular do sistema imune, desde modelos de camundongos até em doenças humanas, uma vez que é uma fosfatase da via JAK-STAT expressa de forma ubíqua, porém de alta expressão específica em tecidos hematopoiéticos. Os polimorfismos de perda da função de PTPN2 aumentam o risco de diabetes tipo 1 (DM1) e artrite reumatoide (AR) e a superexpressão de PTPN2 reduz a inflamação na nefropatia diabética. Recentemente, o grupo do Dr. Nunzio Bottini mostrou que camundongos portadores de expressão reduzida de PTPN2, que mimetizam a perda de função encontrada em pacientes portadores da variante da PTPN2, aumentaram a gravidade da AR através da desestabilização de uma população de células imuno-protetoras. Esses resultados sugerem que a ativação da PTPN2 pode ser terapêutica em pacientes com AR e provavelmente em outras doenças autoimunes. Inversamente aos inibidores de PTP amplamente explorados nos últimos anos, a descoberta dos ativadores de PTP é um campo incipiente de exploração dessas enzimas. Assim, este projeto tem como objetivo investigar potenciais mutações ativadoras de PTPN2 identificadas com base nas semelhanças entre a estrutura de PTP1B e PTPN2 e testá-las in vitro como possíveis ganhos de função. Em seguida, avaliaremos o efeito das mutações nas principais vias de sinalização reguladas pela PTPN2 utilizando linhas celulares imunes submetidas à mutação de PTPN2 mediada por CRISPR/Cas sob condições de estimulo com citocinas pró-inflamatórias. Finalmente, também planejamos rastrear bibliotecas de compostos que buscam ativadores diretos de PTPN2 in vitro e possivelmente em modelos celulares. Os resultados deste estudo certamente estabelecerão uma correlação translacional entre ativadores de PTPN2 e doenças imunes humanas com potenciais aplicações terapêuticas.

Há cerca de cinco anos nosso laboratório investiga a participação de enzimas da família Rho GTPases e fosfatases de especificidade dual (DUSPs) em mecanismos de manutenção de estabilidade genômica que proporcionam às células maior resistência ou sensibilidade a agentes genotóxicos. Por exemplo, mostramos o envolvimento da fosfatase dual DUSP3 (ou VHR) no reparo de danos ao DNA induzidos por radiação ionizante gama em células tumorais, identificando novos alvos/substratos proteicos pelos quais esta fosfatase estaria atuando na manutenção da estabilidade genômica. Em outros casos mostramos que pequenas GTPases típicas RhoA e Rac1 também estão mediando estabilidade genômica através da via de resposta a danos no DNA (DDR) atuando indiretamente sobre a fosforilação de proteínas quinases Chk1/2 e do sensor de danos ³H2AX, levando a uma menor proliferação e sobrevivência quando células deficientes das GTPases são submetidas a estresse genotóxico por radiação ultravioleta. Surpreendentemente e de forma contrária atua a GTPase Cdc42, cuja superativação é que leva a maior sensibilidade de células tumorais a estresse genotóxico, ou seja, os mecanismos regulados por esta enzima estão atuando opostamente nas proteínas de DDR. Até então, como uma enzima estritamente citosólica e membranar, e ainda de funções regulatórias de citosqueleto bem definidas, especula-se que Cdc42 possa ter efetores e/ou reguladores proteicos downstream desconhecidos que estariam correlacionando esta enzima com mecanismos de estabilidade genômica. Outra fosfatase dual que pretendemos investigar, devido a alta homologia de seu domínio catalítico e funções biológicas com DUSP3, é a DUSP12 ou hYVH1. Esta enzima já foi implicada em diversos processos mostrando um efeito citoprotetor em células expostas a estresse oxidativo (interação com a proteína de choque térmico Hsp70), bem como sua presença e influência em grânulos de estresse, partículas que contêm mRNA, fatores de iniciação de tradução e partículas ribossomais, entre outras. Entretanto, quais seriam os alvos proteicos desta fosfatase e os mecanismos moleculares por eles regulados ainda são questões abertas neste campo. Apesar de Cdc42 e DUSP12 serem enzimas de funções bioquímicas totalmente diferentes elas parecem estar mediando funções biológicas similares na instabilidade genômica promovida por agentes genotóxicos que reduzem a proliferação celular. Assim, e de acordo com a experiência adquirida por nosso laboratório, este projeto vem propor respostas para as seguintes hipóteses: 1º) quais seriam os parceiros proteicos da GTPase Cdc42 e prováveis vias de sinalização controladas por ela em condições celulares instabilidade genômica que estariam mediando seu envolvimento na sensibilização de células tumorais a estresse genotóxico?; 2º) quais seriam os substratos enzimáticos e/ou parceiros proteicos da fosfatase dual DUSP12 em condições de instabilidade genômica promovida estresse oxidativo e/ou agentes genotóxicos, por exemplo, que seriam os responsáveis por novas ou já conhecidas funções biológicas atribuídas a esta enzima? Pretendemos identificar moléculas que interagem com estas enzimas, validar estas interações e mostrar que possivelmente existem mecanismos moleculares precisos e pouco conhecidos, envolvendo-as física e/ou quimicamente em mecanismos de estabilidade genômica, sendo que perturbações nas mesmas levariam e levam a distúrbios celulares frentes diferentes tipos de estresse. Esta investigação deverá ser conduzida em diferentes linhagens celulares humanas transformadas ou não, escolhidas especificamente para cada enzima (Cdc42 e DUSP12), e a abordagem experimental deve incluirá técnicas básicas de: biologia molecular e celular, bioquímica, proteômica, microscopia de fluorescência confocal, bioinformática, e outras. Pretende-se mostrar que GTPase reguladoras do citoesqueleto e tirosina fosfatases també

As leucemias estão entre os cânceres de maior incidência populacional, tanto em adultos quanto em crianças, e seu tratamento é principalmente medicamentoso com agentes capazes de promover danos ao DNA objetivando destruir as células leucêmicas. Os mecanismos envolvidos com o desenvolvimento da doença ainda não estão totalmente esclarecidos, o que faz com que as terapias utilizadas ainda sejam inespecíficas e limitadas. Alguns trabalhos publicados tem relatado o envolvimento de alterações de expressão e/ou mutações na proteína Nucleofosmina (NPM), que é uma proteína participante da manutenção da integridade genômica. Por outro lado já foi descrito uma expressão diferencial de tirosina fosfatases em diferentes células do sistema imune, correlacionando-as com estágio de diferenciação e ativação. Dentre essas se incluía a fosfatase dual atípica VHR, a qual foi recentemente mostrada por nosso grupo interagir física e possivelmente quimicamente com NPM em células submetidas a condições de estresse genotóxico, mas através de mecanismos ainda desconhecidos. Além disso, outros resultados de nosso grupo sugerem uma participação direta de VHR em mecanismos de reparo de DNA após danos induzidos por radiações ionizantes ou não, possivelmente levando a uma regulação funcional de NPM através de sua desfosforilação diferencial em tirosinas. Desta forma, este trabalho tem como objetivo investigar correlações entre a expressão das proteínas VHR e NPM em linhagens de células leucêmicas (HL-60, THP-1, MOLT-4 e Jurkat) frente ao estresse genotóxico causado por radiação gama e por doxorrubicina, e qual o impacto da superexpressão e/ou silenciamento destas proteínas em mecanismos de reparo de DNA relacionados e na proliferação/sobrevivência celular. Certamente, os conhecimentos levantados neste trabalho poderão contribuir para o entendimento do envolvimento destas duas proteínas (VHR e NPM) no potencial tumorigênico destas células, bem como no de outras proteínas envolvidas com as vias nas quais estas proteínas atuam e/ou regulam, de modo que se possa investir futuramente no aperfeiçoamento de diagnósticos, monitoramento e terapias aplicadas aos diversos tipos de leucemias.

Há cerca de oito anos nosso laboratório investiga a participação de enzimas da família Rho GTPases e fosfatases de especificidade dual (DUSPs) em mecanismos de manutenção de estabilidade genômica que proporcionam às células maior resistência ou sensibilidade a agentes genotóxicos. Por exemplo, mostramos o envolvimento da fosfatase dual DUSP3 (ou VHR) no reparo de danos ao DNA induzidos por radiação ionizante gama em células tumorais, identificando novos alvos/substratos proteicos pelos quais esta fosfatase estaria atuando na manutenção da estabilidade genômica. Em outros casos mostramos que pequenas GTPases típicas RhoA e Rac1 também estão mediando estabilidade genômica através da via de resposta a danos no DNA (DDR) atuando indiretamente sobre a fosforilação de proteínas quinases Chk1/2 e do sensor de danos γH2AX, levando a uma menor proliferação e sobrevivência quando células deficientes das GTPases são submetidas a estresse genotóxico por radiação ultravioleta. Surpreendentemente e de forma contrária atua a GTPase Cdc42, cuja superativação é que leva a maior sensibilidade de células tumorais a estresse genotóxico, ou seja, os mecanismos regulados por esta enzima estão atuando opostamente nas proteínas de DDR. Até então, como uma enzima estritamente citosólica e membranar, e ainda de funções regulatórias de citosqueleto bem definidas, especula-se que Cdc42 possa ter efetores e/ou reguladores proteicos downstream desconhecidos que estariam correlacionando esta enzima com mecanismos de estabilidade genômica. 
Outra fosfatase dual que pretendemos investigar, devido a alta homologia de seu domínio catalítico e funções biológicas com DUSP3, é a DUSP12 ou hYVH1. Esta enzima já foi implicada em diversos processos mostrando um efeito citoprotetor em células expostas a estresse oxidativo (interação com a proteína de choque térmico Hsp70), bem como sua presença e influência em grânulos de estresse, partículas que contêm mRNA, fatores de iniciação de tradução e partículas ribossomais, entre outras. Entretanto, quais seriam os alvos proteicos desta fosfatase e os mecanismos moleculares por eles regulados ainda são questões abertas neste campo.
Apesar de Cdc42 e DUSP12 serem enzimas de funções bioquímicas totalmente diferentes elas parecem estar mediando funções biológicas similares na instabilidade genômica promovida por agentes genotóxicos que reduzem a proliferação celular. Assim, e de acordo com a experiência adquirida por nosso laboratório, este projeto vem propor respostas para as seguintes hipóteses: 1º) quais seriam os parceiros proteicos da GTPase Cdc42 e prováveis vias de sinalização controladas por ela em condições celulares instabilidade genômica que estariam mediando seu envolvimento na sensibilização de células tumorais a estresse genotóxico?; 2º) quais seriam os substratos enzimáticos e/ou parceiros proteicos da fosfatase dual DUSP12 em condições de instabilidade genômica promovida estresse oxidativo e/ou agentes genotóxicos, por exemplo, que seriam os responsáveis por novas ou já conhecidas funções biológicas atribuídas a esta enzima?
Pretendemos identificar moléculas que interagem com estas enzimas, validar estas interações e mostrar que possivelmente existem mecanismos moleculares precisos e pouco conhecidos, envolvendo-as física e/ou quimicamente em mecanismos de estabilidade genômica, sendo que perturbações nas mesmas levariam e levam a distúrbios celulares frentes diferentes tipos de estresse. Esta investigação deverá ser conduzida em diferentes linhagens celulares humanas transformadas ou não, escolhidas especificamente para cada enzima (Cdc42 e DUSP12), e a abordagem experimental deve incluirá técnicas básicas de: biologia molecular e celular, bioquímica, proteômica, microscopia de fluorescência confocal, bioinformática, e outras. Pretende-se assim, mostrar que GTPase reguladoras do citoesqueleto e tirosina fosfatase

Glioblastoma é o mais comum tumor primário cerebral, e apesar da combinação cirúrgica com tratamentos de radio e quimioterapia, o prognóstico ainda é muito ruim. O aumento da proliferação e migração celular desses tumores está diretamente relacionado com sua agressividade, a qual tem sido relacionada com as vias das Rho GTPases. Evidências funcionais do papel de RhoA em gliomas foram demonstradas com a inibição de ROCK, levando a ativação de Rac1 e aumento da invasão e migração celular. Além disso, já foi demonstrado que Rho GTPases atuam em mecanismos de reconhecimento e reparo de dano no DNA em células tumorais. Por exemplo, nosso grupo mostrou recentemente que a atividade de RhoA em linhagens tumorais humanas afeta a sensibilidade dessas células frente a radiação ionizante gama e não-ionizante ultravioleta, através de vias de reparo de DNA, como HR, NHEJ e NER, por mecanismos moleculares ainda desconhecidos. Assim, este projeto visa investigar a via de sinalização da GTPase Rho, incluindo seus componentes downstream e a própria polimerização do citoesqueleto de actina, em células de glioblastoma após serem submetidas a danos no DNA. Além disso, pretende-se investigar também se este envolvimento da via de Rho possui ou não dependência frente à proteína supressora de tumor p53 e ao estresse oxidativo promovido pelos tratamentos já existentes, como radiação-gama e cisplatina. Ao fim, pretende-se utilizar os resultados dessa pesquisa para aprofundar a elucidação de vias de sinalização envolvendo Rho GTPase e mostrar que tanto esta enzima como outros componentes desta via, bem como o próprio citoesqueleto de actina, são alvos promissores para o desenvolvimento e o emprego de novos tratamentos contra os diversos tipos de glioblastomas, ou mesmo do aperfeiçoamento de tratamentos já existentes.

O carcinoma hepatocelular (HCC) é a sexta neoplasia mais frequente, sendo a terceira causa de morte atribuída por câncer. A fisiopatologia do HCC é um tema em evolução e parece ser multifatorial. Igualmente aos demais cânceres, o HCC surge a partir de mutações em determinados genes. Estudos recentes têm sugerido que a enzima SCD1 (estearoil-CoA desaturase 1) está associada a predisposição genética à hepatocarcinogênese em camundongos e ratos, enquanto que a supressão desta pode reduzir a proliferação em linhagens de células HCC, de forma dependente de Akt. Diversos estudos têm mostrado que a SCD1 está aumentada em muitos tipos de câncer e em diversas disfunções metabólicas, tais como diabetes, obesidade, esteatose hepática não-alcoólica e em outras doenças que predispõem ao surgimento do câncer. Entretanto, os mecanismos moleculares e o entendimento sobre a influência da SCD1 na instabilidade genômica que podem resultar no desenvolvimento do carcinoma hepatocelular permanecem desconhecidos. Dessa maneira, o presente projeto pretende avaliar o potencial da enzima SCD1 em promover instabilidade genômica e alterações metabólicas e morfológicas que levam à transformação tumoral em células hepáticas não tumorigênicas. Para os ensaios, serão desenvolvidos três modelos celulares de hepatócitos não tumorigênicos e tumorigênicos. Os dois primeiros serão compostos pelas linhagens humanas normais PHH (hepatócitos primários imortalizados não tumorigênicos) e HepaRG/diferenciadas, que serão transfectadas para superexpressar a enzima SCD1. O terceiro consiste na linhagem de carcinoma hepatocelular HepG2, que será utilizada para a indução de um perfil de resistência ao inibidor comercial de SCD1, onde as células resistentes serão isoladas e estudadas frente às linhagens parentais sensíveis a este composto. Além disto, para este último modelo, também será determinado o perfil metabólico de células de HCC resistentes ao tratamento com inibidores para esta enzima, afim de descrever possíveis alvos terapêuticos. Após o estabelecimento dos três modelos celulares, serão realizados os ensaios biológicos, os quais serão comuns para todas as linhagens, como por exemplo a viabilidade celular determinada por meio do método colorimétrico de MTT. Em seguida, serão avaliados os parâmetros metabólicos por meio da: análise do perfil lipídico por espectrometria de massa, determinação do consumo de oxigênio e avaliação da acidificação do meio, afim de verificar as alterações decorrentes da superexpressão e/ou inibição da SCD1. Para avaliar a indução de instabilidade genômica nos modelos previamente estabelecidos, serão realizados ensaios para observar: alterações no ciclo celular; formação e morfologia dos fusos mitóticos, distribuição cromossômica; indução de danos globais no DNA e produção de espécies reativas de oxigênio. Além destes, serão investigadas vias de sinalização que provavelmente serão moduladas pela alta expressão de SCD1 ou, sob resistência ou não a inibidores da mesma: PIP3/Akt/PTEN; beta-catenina; ERK1/2, Ciclinas D1 e B1; histonas gH2AX e H2AX; CHK1 e CHK2 (vias de respostas a danos no DNA); LC3B; e p53. Estas proteínas participam de diversos processos, como reparo do DNA, indução ou inibição da proliferação celular, autofagia e indução de algum tipo de instabilidade genômica. Dessa maneira, os resultados obtidos neste projeto irão contribuir para a elucidação do papel da SCD1 no surgimento do HCC e no perfil de resistência frente aos seus inibidores comerciais. Consequentemente, estes achados podem culminar na descoberta de novos alvos moleculares, assim como podem potencializar a validação dos inibidores da SCD1 na prevenção e tratamento do HCCs.

A alta expressão e atividade nuclear de enzimas fosfatases é majoritariamente atribuída às serina/treonina fosfatases (S/TP). Poucas tirosina fosfatases (PTP) de ação em eventos bioquímicos e biológicos nucleares tem sido caracterizadas. Uma das sub-famílias PTP cujos substratos são bastante diversificados e pouco explorados, é a das fosfatases de especificidade dual (DUSP), mais especificamente o sub-grupo das enzimas atípica (aDUSPs). Algumas destas enzimas são capazes de desfosforilar resíduos de tirosina e treoninas ou serinas de substratos proteicos, como as quinases ativadas por mitógenos (MAPK). Porém, funções biológicas que não são mediadas por MAPKs já foram identificadas como dependentes de algumas DUSPs, o que de fato deve ser atribuído a substratos ainda desconhecidos destas enzimas. Por exemplo, a DUSP3 ou VHR, é uma fosfatase dual que além de inibir MAPK para um controle fino da proliferação celular, tem funções nucleares identificadas por nosso grupo em mecanismos de reparo de DNA, que provavelmente deve-se à substratos ainda desconhecidos desta enzima. Nossa hipótese foi confirmada por duas publicações recentes nossas de que DUSP3 interage fisicamente com proteínas nucleares envolvidas direta e indiretamente com reparo de DNA, como Nibrina, Nucleolina, Nucleofosmina e Ribonucleoproteína C. Porém, como se dá esta interação e se DUSP3 está promovendo a desfosforilação destas novas proteínas alvo, ainda não sabemos. Além disso, qual a funcionalidade destas novas interações de DUSP3, ou seja, como elas estão afetando mecanismos biológicos controlados por estas quatro proteínas, são questões abertas que precisam de maior investigação. E por fim, como a alteração funcional destas quatro proteínas através do silenciamento de DUSP3 está afetando mecanismos específicos de reparo de DNA, como por exemplo, o reparo por excisão de nucleotídeos (NER) do DNA lesado por radiação ultravioleta, também faz parte da problemática levantada por este projeto. Em suma, pretendemos aprofundar o conhecimento das enzimas DUSP em relação a novas funções biológicas conhecendo melhor seus substratos proteicos e mecanismos moleculares de interação.

A DUSP3 é uma fosfatase dual que além de inibir MAPK para um controle fino da proliferação celular, tem funções nucleares relacionadas a mecanismos de reparo de DNA, que devem-se aos novos substratos desta enzima identificados por nosso grupo. Essa hipótese foi confirmada ao demonstrarmos que DUSP3 interage fisicamente com proteínas nucleares envolvidas com reparo de DNA como Nucleolina, Nucleofosmina e Ribonucleoproteína C. Porém ainda desconhecemos como esta interação ocorre e se DUSP3 está promovendo a desfosforilação destas. Saber se a DUSP3 interfere na desfosforilação de NUCL, NPM e hnRNP C1/C2 em potenciais resíduos de tirosina e treonina levando a alteração de suas funções biológicas mais clássicas, bem como saber se a interação dessas proteínas com DUSP3 pode ser independente de sua atividade como fosfatase, nesse caso, uma interação que pode direcioná-las para facilitar ou impedir sua interação com ou fosforilação por outras proteínas direcionando-as ao reparo de DNA, é o principal desafio deste projeto. Esta busca por desvendar os mecanismos envolvendo DUSP3 e estabilidade genômica contribuirá significativamente para a área de sinalização envolvendo DUSPs, indo ao encontro à outros dados biológicos do grupo que estão em fase de publicação. Além disso, é adequado ressaltar que vários trabalhos recentes da literatura estão relacionando as enzimas DUSPs com eventos nucleares diversos, incluindo os de estabilidade genômica. Por exemplo, fosfatase dual Cdc14 encontrada no núcleo de células de mamíferos mostrou ser de extrema importância para o reparo de DNA e envelhecimento precoce após danos promovidos por radiação gama. Além desta há a DUSP6 e a DUSP12 que também foram mostradas serem mediadoras importantes da estabilidade genômica, e são a prova de conceito até então existente de que tirosina fosfatases duais são enzimas relevantes para mecanismos regulatórios de dano e reparo de DNA e até então pouco exploradas, como por exemplo, o reparo por excisão de nucleotídeos (NER) do DNA lesado por radiação ultravioleta, o qual é foco da problemática levantada neste projeto.

A alta expressão e atividade nuclear de enzimas fosfatases é majoritariamente atribuída às serina/treonina fosfatases (S/TP). Poucas tirosina fosfatases (PTP) de ação em eventos bioquímicos e biológicos nucleares tem sido caracterizadas. Uma das sub-famílias PTP cujos substratos são bastante diversificados e pouco explorados, é a das fosfatases de especificidade dual (DUSP), mais especificamente o sub-grupo das enzimas atípica (aDUSPs). Algumas destas enzimas são capazes de desfosforilar resíduos de tirosina e treoninas ou serinas de substratos proteicos, como as quinases ativadas por mitógenos (MAPK). Porém, funções biológicas que não são mediadas por MAPKs já foram identificadas como dependentes de algumas DUSPs, o que de fato deve ser atribuído a substratos ainda desconhecidos destas enzimas. Por exemplo, a DUSP3 ou VHR, é uma fosfatase dual que além de inibir MAPK para um controle fino da proliferação celular, tem funções nucleares identificadas por nosso grupo em mecanismos de reparo de DNA, que provavelmente deve-se à substratos ainda desconhecidos desta enzima. Nossa hipótese foi confirmada por duas publicações recentes nossas de que DUSP3 interage fisicamente com proteínas nucleares envolvidas direta e indiretamente com reparo de DNA, como Nibrina, Nucleolina, Nucleofosmina e Ribonucleoproteína C. Porém, como se dá esta interação e se DUSP3 está promovendo a desfosforilação destas novas proteínas alvo, ainda não sabemos. Além disso, qual a funcionalidade destas novas interações de DUSP3, ou seja, como elas estão afetando mecanismos biológicos controlados por estas quatro proteínas, são questões abertas que precisam de maior investigação. E por fim, como a alteração funcional destas quatro proteínas através do silenciamento de DUSP3 está afetando mecanismos específicos de reparo de DNA, como por exemplo, o reparo por excisão de nucleotídeos (NER) do DNA lesado por radiação ultravioleta, também faz parte da problemática levantada por este projeto. Em suma, pretendemos aprofundar o conhecimento das enzimas DUSP em relação a novas funções biológicas conhecendo melhor seus substratos proteicos e mecanismos moleculares de interação.

A alta expressão e atividade nuclear de enzimas fosfatases é majoritariamente atribuída às serina/treonina fosfatases (S/TP). Poucas tirosina fosfatases (PTP) de ação em eventos bioquímicos e biológicos nucleares tem sido caracterizadas. Uma das sub-famílias PTP cujos substratos são bastante diversificados e pouco explorados, é a das fosfatases de especificidade dual (DUSP), mais especificamente o sub-grupo das enzimas atípica (aDUSPs). Algumas destas enzimas são capazes de desfosforilar resíduos de tirosina e treoninas ou serinas de substratos proteicos, como as quinases ativadas por mitógenos (MAPK). Porém, funções biológicas que não são mediadas por MAPKs já foram identificadas como dependentes de algumas DUSPs, o que de fato deve ser atribuído a substratos ainda desconhecidos destas enzimas. Por exemplo, a DUSP3 ou VHR, é uma fosfatase dual que além de inibir MAPK para um controle fino da proliferação celular, tem funções nucleares identificadas por nosso grupo em mecanismos de reparo de DNA, que provavelmente deve-se à substratos ainda desconhecidos desta enzima. Nossa hipótese foi confirmada por duas publicações recentes nossas de que DUSP3 interage fisicamente com proteínas nucleares envolvidas direta e indiretamente com reparo de DNA, como Nibrina, Nucleolina, Nucleofosmina e Ribonucleoproteína C. Porém, como se dá esta interação e se DUSP3 está promovendo a desfosforilação destas novas proteínas alvo, ainda não sabemos. Além disso, qual a funcionalidade destas novas interações de DUSP3, ou seja, como elas estão afetando mecanismos biológicos controlados por estas quatro proteínas, são questões abertas que precisam de maior investigação. E por fim, como a alteração funcional destas quatro proteínas através do silenciamento de DUSP3 está afetando mecanismos específicos de reparo de DNA, como por exemplo, o reparo por excisão de nucleotídeos (NER) do DNA lesado por radiação ultravioleta, também faz parte da problemática levantada por este projeto. Em suma, pretendemos aprofundar o conhecimento das enzimas DUSP em relação a novas funções biológicas conhecendo melhor seus substratos proteicos e mecanismos moleculares de interação.

O nosso maior objetivo com a criação do Núcleo de Apoio à Pesquisa em Proteólise e Sinalização Celular (NAPPS), com apoio da da Pró-reitoria de Pesquisa da USP, é criar um equipe de cientistas focados no estudo funcional desses peptídeos intracelulares. A equipe proposta, somando as expertises individuais, tem plenas condições para mapear as redes de interações proteicas celulares que esses peptídeos podem modular, bem como entender as vias de síntese e metabolismo desses peptídeos e fazer as correlações necessárias entre proteólise e sinalização celular. Também, essa equipe esta preparada para aplicar esse conhecimento na geração de inovações na área biomédica..

Proteínas fosfatases de especificidade dual (DUSP) são membros de uma grande família de proteínas tirosina fosfatases (PTPs) e tem sido implicadas como reguladores centrais de vias de sinalização e mitogênica mediada pela família de MAP quinases (MAPK). Uma dessas MAPK fosfatases é a proteína VHR, de 185 aminoácidos, que foi clonada baseada na sua homologia com a primeira DUSP identificada, a proteína VH1 do vírus Vaccinia. VHR é uma DUSP pequena com especificidade para as MAPKs Erk2 e Jnk, sendo uma molécula importante na progressão do ciclo celular. Vários estudos têm mostrado a importância da participação de proteínas fosfatases da família serina/treonina no mecanismos de dano/reparo no DNA. Alguns trabalhos relacionam a atuação de PP2A na resposta ao dano no DNA regulando positivamente/negativamente importantes proteínas, tais como ATM, CHK1, p53, e pH2AX. É praticamente inexistente a identificação de proteínas tirosina fosfatases mediando atividades nucleares como remodelamento de cromatina, mitose, dano/reparo de DNA. Desta forma, o presente projeto tem a intenção de investigar o envolvimento da proteína VHR (DUSP3) e sua função nos mecanismos de reparo e de resposta a danos no DNA em células tumorais de melanoma humano, submetidas à radiação ultravioleta. Além disso, pretende-se investigar a interação de VHR com outras clássicas que sabidamente participam direta ou indiretamente das vias de sinalização de reparo de DNA e construir ou predizer novas redes de interação protéica em células de melanoma humano.

As fosfatases são hidrolases de aminoacil-fosfomonoésteres específicos, amplamente distribuídas na natureza, encontradas em procariontes e eucariontes. Estas enzimas são divididas em fosfatases alcalinas e ácidas, sendo que dentre as últimas e em mamíferos, há uma subfamília de proteínas codificadas por cerca de 100 genes, que especificamente desfosforilam proteínas fosfotirosinas, denominadas proteínas tirosina fosfatases (PTPs). As PTPs são divididas em quatro classes, incluindo a das fosfatases atípicas, que possuem especificidade dual (DUSP) por desfosforilarem fosfotirosinas e fosfotreoninas ou fosfoserinas, e ainda outros substratos diversos. Um exemplar deste tipo é a DUSP3 ou VHR (vaccinia virus phosphatase VH1-related), proteína de 185 aminoácidos apresentando um sítio catalítico raso que permite atuar em subtratos contendo fosfo-Tyr e fosfo-Thr. É sabido que essa proteína é superexpressa em linhagens celulares humanas de câncer de colo uterino e possui localização preferencialmente nuclear, desempenhando um papel fundamental na progressão do ciclo celular. DUSP3 é conhecida por regular negativamente a família de quinases ativadas por mitógeno (MAPK) inativando o sinal extracelular desfosforilando-as. O presente trabalho buscou identificar interações entre VHR e outras proteínas que estejam direta ou indiretamente envolvidas em processos de reparo no DNA. Utilizando a técnica ?pull down?, que nos permitiu precipitar VHR com outras proteínas através de sua fusão com GST, essas proteínas alvos foram reveladas em gel SDS-PAGE seguidos de coloração por prata. Bandas de proteínas diferencialmente precipitadas e/ou expressas foram excisadas dos géis, digeridas por tripsina e identificadas por espectrometria de massas gerando uma lista total de 46 proteínas mais significativas. Dos possíveis novos alvos, cerca de seis apresentando melhores dados proteômicos e maior representatividade, foram validados através de Western blot, Imunofluorescência e Imunoprecipitação. Nucleolina, Nucleofosmina, hnRNP e Histona H1 foram os alvos que se mostraram mais promissores e passíveis de maior investigação biológica futura. Além destes, todas as outras proteínas foram usadas como ?seed list? para geração de redes de interação proteína-proteína em função do tempo pós-tratamentos, dando uma noção de como flutuações ocorrem nos interactomas da fosfatase VHR em células HeLa expostas a estresses genotóxicos do tipo radiação ionizante e, dessa forma, como esta fosfatase pode estar contribuindo direta ou indiretamente com processos de resposta a danos e reparo de DNA.

O mecanismo pelo qual uma célula responde a algum dano no seu material genético é extremamente importante. A resposta pode ser via reparo do dano, propriamente dito, e se a lesão for muito grave, ocorre ativação do mecanismo de morte celular programada (apoptose) ou a célula entra em senescência. Se estes mecanismos falharem, pode ocorrer a formação do câncer. Resultados recentes de nosso grupo demonstraram que a proteína RhoA GTPase está diretamente envolvida com a regulação da senescência e do ciclo celular de células tumorais transformadas por Ras induzidas por agentes estressores. RhoA, Cdc42 e Rac1 pertencem a família das proteínas sinalizadoras Rho GTPases, as quais atuam como interruptores moleculares estando ativa ligada a GTP e inativa ligada a GDP; os componentes desta família estão relacionados aos mais diversos processos celulares como por exemplo migração celular, adesão, endocitose e oncogênese. No entanto, apesar das proteínas Rho estarem envolvidas em um amplo espectro de atividades biológicas, há poucas informações sobre a atividade das Rho GTPases na manutenção da integridade genômica e mais especificamente qual é o seu papel nos processos de reparo do DNA ao longo do ciclo celular após lesão promovida por radiação ionizante tipo gama. Desta forma, este projeto propõem um estudo do mecanismo de ação das GTPases RhoA, Cdc42 e Rac1 para que se possa esclarecer mais um passo do importante mecanismo de controle da estabilidade genômica em células tumorais e suas implicações e/ou inter-relações com radioterapias.

Recentemente descrevemos pela primeira vez a ação dual de FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2) em células malignas dependentes dos oncogenes ras, envolvendo disparo das vias mitogênicas de ERK-MAPK e de PI3K e, também, iniciação de uma via nova, mediada por FGFR-TyrKinase→RhoA-GTP, que bloqueia o ciclo celular e causa senescência. Esta dualidade contraria a noção de que FGF2 é oncogênico, sugerindo que pode ativar mecanismos supressores de tumor e inibir a proliferação maligna irreversivelmente. Para avançar no estudo deste fenômeno propomos uma hipótese geral para a ação dual de FGF2 no ciclo celular, promovendo a transição G0→G1→S e inibindo G2→M. A inibição de G2→M é reversível em células normais e citotóxica em malignas. Estão também incluídas as seguintes hipóteses complementares: a) Ciclina D1 complementa a ação oncogênica de Ras; b) a ação citotóxica de FGF2 não depende das vias supressoras de tumor de pRb e de p53. A análise experimental deste conjunto de hipóteses envolverá 2 linhagens celulares de camundongo e 2 de humanos, transformadas pelo oncogene K-ras ou pela quimera ER-rasV12, cujo produto, ER-RasV12, é induzível por hidroxi-tamoxifen. A abordagem total compreenderá, de um lado, modelagem matemática e simulação do ciclo celular em computador e, de outro, análise experimental da dinâmica do ciclo celular por citômetro de fluxo. A meta de longo prazo é um modelo de resolução em múltipla escala indo das vias moleculares de sinalização ao fluxo das células através das fases do ciclo celular. Além das vias funcionais o projeto também contempla a análise das vias de interação física das isoformas de FGF2 de 18 e 22kDa com FGFRs e proteínas intracelulares.

Src é uma oncoprotéina produto do oncogene viral v-src que apresenta alta atividade quinásica em diversos tipos de tumores humanos promovendo alterações intracelulares que levam a malignicidade dos mesmos tornando-os metastáticos. A atividade de Src é regulada negativamente por Csk (C-terminal Src kinase), uma proteína que pode ser recrutada para várias localizações subcelulares sob ativação de quinases da família de Src (SFK), como por exemplo, as regiões de caveolos e ?rafts? de membrana em condições de estresse oxidativo (H2O2), quando da ligação de hormônios (Insulina) ou de fatores de crescimento (EGF) aos seus receptores transmembranares. Um dos domínios de Csk que não tem atividade catalítica, mas tem função essencial no ?binding? a outros substratos protéicos (SFK) é o SH2. O estado de oxidação da ponte dissulfeto do domínio SH2 de Csk altera sua atividade catalítica in vitro em substratos miméticos de fosfo-peptídeos sintéticos do tipo poli(Glutâmico)4Tirosina (Mills et al, 2007).
A fim de saber se estados redox intracelulares nas proximidades da localização de Csk afetam sua ligação e atividade in vivo, ou seja, em culturas de linhagens celulares, providenciamos construções de Csk selvagem e mutada na ponte dissulfeto (C164A) em vetores de expressão para células de mamíferos contendo uma cauda ou ?tag?, p-CMV-HA-Csk, pRK5-MYC-Csk e pFLAG-CMV, para investigar o impacto do estado de oxidação do domínio SH2 de Csk na sua atividade catalítica, na sua localização subcelular e no seu envolvimento nos mecanismos de sinalização intracelular envolvendo SFKs (Yang et al, 2007). A abordagem experimental envolverá a transfecção de três diferentes linhagens celulares humanas como HeLa, HNF e HEK com as construções citadas, seguida de experimentos de imunoprecipitação, imunoblot e imunofluorescência para Csk para alguns de seus efetores intracelulares conhecidos. A identificação de ligantes desconhecidos de Csk a partir das imunoprecipitações deverá ser acompanhada por

Nos últimos anos descrevemos mecanismos moleculares anti-proliferativos específicos de AVP e FGF2 em células tumorais de camundongo transformadas pelo oncogene ras e mostramos que a GTPase RhoA intermedeia um mecanismo de senescência disparado por AVP e FGF2, bloqueando o ciclo celular em G1/S, sendo que a ablação de RhoA torna as células tumorigênicas resistentes a senescência. Mais recentemente, geramos um conjunto de dados sugerindo um provável e inédito papel fosfatase dual atípica DUSP3/VHR nos focos de reparo de DNA induzidos por radiações ionizantes (IRIF) em células tumorais humanas, mostrando que VHR co-localiza com p-H2AX, p-ATF2, p-JNK e, surpreendentemente, com a proteína Mre11, integrante do complexo MRN (Mre11/Rad50/Nbs1) de reparo de DNA. Em suma, baseando-se nestes resultados prévios, este projeto propõe como hipóteses gerais: 1ª) que VHR está regulando, seja somente por interação física ou quimicamente, a atividade de enzimas relacionadas ou integrantes dos complexos reparadores de lesão no DNA; e 2ª) que as GTPases RhoA/Rac1/Cdc42 estão mediando a instabilidade genômica promovida por agentes genotóxicos físicos (como radiação ionizante gama e UVC), ou através de um controle do tráfego de proteínas entre citoplasma-núcleo dependente de dinâmica de citoesqueleto ou através de regulação da atividade enzimática nuclear. Esta investigação deverá ser conduzida em duas linhagens celulares humanas transformadas (HeLa e MeWo) e a abordagem experimental deve incluir técnicas básicas de: microscopia de fluorescência confocal, bioquímica, proteômica, bioinformática, biologia molecular e cultura celular. Pretende-se assim, mostrar que GTPases e tirosina fosfatases também são componentes da complexa rede funcional por trás da difícil manutenção da integridade genômica, constituindo-se assim em potenciais alvos de ação de drogas inibidoras para o tratamento de diversos tipos de câncer.

Nosso laboratório vem, há décadas (ARMELIN, 1975), trabalhando na definição de 
mecanismos moleculares envolvidos no controle do ciclo celular, recentemente dando 
ênfase à linhagem Y1 de células adrenocorticais de camundongo (LOTFI et al, 2000). Os resultados que obtivemos nos últimos 4 anos (LEPIQUE et al, 2000; LOTFI; ARMELIN, 2001; FORTI et al, 2002; SCHWINDT et al, 2003; ROCHA et al, 2003) nos permitiram elaborar um módulo de rede de sinalização que integra sinais iniciados nos receptores 
transmembranares de FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2), ACTH (Hormônio 
Adrenocorticotrópico) e AVP (Arginina-Vasopressina). FGF2 é um forte mitógeno para as células Y1, enquanto ACTH e AVP são antagonistas da ação mitogênica de FGF2. 
Adotamos a tática experimental de estudar as interações de FGF2 com ACTH ou A VP com o objetivo de encontrar vias moleculares de sinalização que integrassem os sinais 
oriundos dos respectivos receptores e explicassem o antagonismo entre esses hormônios. O racional dessa abordagem envolvia a premissa provável de que esse objetivo levaria a reações importantes do módulo de controle da transição GO-G1-S do ciclo celular das células Y1. De fato, essa premissa se realizou e os resultados experimentais obtidos levaram ao cerne do módulo de controle procurado. Neste momento, resultados não publicados e observações preliminares nos permitem propor um módulo ampliado da via mitogênica disparada pelos receptores de FGF2, que regula a transição GO-G1-S do ciclo celular das células Y1. Este módulo de rede de sinalização inclui hipóteses cuja validação experimental é a meta deste projeto temático. O plano experimental envolve: a) aplicação da tecnologia convencional do DNA recombinante a cultura de células de camundongo (clonagem e sequenciamento de genes e ESTs, construção de vetores de expressão, transfecções transientes e permanentes, etc.); b) bloqueio funcional de genes/proteínas por interferência de RNA (RNAi); c) análise de expressão gênica por

Propusemos, recentemente, que ACTH tem efeitos antagônicos na transição G0-G1-S do ciclo de células adrenais: estimula G0-G1 (efeito mitogênico) e inibe G1-S (efeito 
antimitogênico). os objetivos deste projetos são estudar os mecanismos moleculares que possam explicar estas açoes antagônicas de ACTH. Partimos da hipótese de que o sistema CAMP/PKA não é suficiente para explicar o mecanismo de transdução do sinal de ACTH. O projeto contempla a possibilidade do receptor de ACTH desencadear, independentemente, a ativação da adenilato ciclase/cAMP/PKA e ativação de outras vias, provavelmente, PKC. Além disso, o receptor de ACTH também pode acionar a via de Ras/Raf/ERK para induzir a transcrição dos proto-oncogenes Fos e Jun.