Maria Magdalena Rossi.

Knowing the challenge imposed on science for ensuring food security in times of climate change, it is essential to identify the genetic variables that modulate crop yield and quality, understand their mechanisms of action, and evaluate how these mechanisms are affected by the changing environmental conditions. In this context, the general objective of this proposal is to study common factors involved in light and stress signal transduction, aiming to optimize multiple responses for improving the production and nutritional quality of food feedstock. Using Solanum lycopersicum, an eudicot of high nutritional interest for human diet, as model species; this project proposes to expand the knowledge generated by the groups of the leading researchers about the function of light signaling factors, as well as tocopherol metabolism, a well- known stress protector. It is worth mentioning that the background and most of the genetic material to be used have been obtained in the context of previous joint projects granted by FAPESP (2016/01128-9 and 2021/05079-0). To achieve the objective, the following activities are proposed: (i) to investigate the role of phytochrome (PHY)-mediated light signal transduction and nitric oxide (NO) signaling on tomato responses to warm temperature conditions; (ii) to investigate the role of PHY-mediated light signal transduction and NO signaling on tomato fruit cuticle formation; (iii) to investigate the role of B-box (SlBBX) and interacting proteins in shade avoidance and biotic stress; (iv) to investigate the link between SlBBXs and epigenetic regulation and; (v) to engineer plants for high tocopherol content for stress tolerance and nutritional quality improvement. Due to the conserved function of the genetic determinants studied, the information generated will be plausible to be transposed to other species.

O fitness das plantas depende da capacidade de lidar com múltiplos estímulos (a)bióticos ambientais como luz e outros organismos. Complexas redes de sinalização desencadeadas pela percepção desses estímulos, que envolvem a produção endógena de fitohormônios, reprogramam o metabolismo e padrão de desenvolvimento das plantas visando garantir a sobrevivência. Frequentemente, a percepção de estímulos antagônicos obrigam às plantas a decidir entre crescer ou se defender. A sinalização luminosa e por jasmonato (JA), fitohormônio associado ao stress, representam um ponto crucial conflitante entre os programas de crescimento e defesa. Desta forma, aprimorar o conhecimento sobre o papel e funcionamento de fatores comuns à sinalização por luz e JA é fundamental para viabilizar o desenvolvimento de estratégias que permitam desacoplar ambas respostas visando melhorar a produtividade e qualidade nutricional das culturas. Por meio da aplicação de técnicas de interação proteína-proteína de última geração, este projeto propõe avançar no entendimento do crosstalk entre esses dois estímulos. Especificamente, serão caracterizados membros da família de fatores de transcrição BBX utilizando tomateiro como espécie modelo. A compreensão da composição, dinâmica, funcionamento dos complexos de fatores de transcrição BBX permitirá identificar novos mecanismos envolvidos no crosstalk entre luz e JA e, desta forma, aprimorar a compreensão sobre a determinação de caracteres como produtividade e qualidade nutricional.

Pelo seu alto consumo e perfil bioquímico, o fruto de tomate é um importante componente da dieta humana fornecendo quantidades significativas de compostos com atividade antioxidante, como carotenoides e tocoferóis. A biossíntese desses compostos nutracêuticos ocorre nos plastídios, de forma que o número e atividade plastidial incidem diretamente na qualidade nutricional dos frutos. A diferenciação e atividade plastidial estão estritamente controladas pela luz por meio de uma complexa cascata de sinalização da qual fazem parte os fitocromos, como receptores, e os fatores de interação com os fitocromos, como reguladores negativos das respostas controladas por esses fotorreceptores. A cascata culmina na ativação de fatores de transcrição como os genes GLKs (GOLDEN LIKE) que induzem o desenvolvimento plastidial e a expressão de transcritos nucleares necessários à fotossíntese. Adicionalmente, fitormônios e outros sinalizadores, incluindo espécies reativas de oxigênio ou nitrogênio, também influenciam a diferenciação de cloroplastos. Dentre esses, merece destaque o óxido nítrico (NO), responsável por ajustes no balanço hormonal em resposta a sinais luminosos percebidos via fitocromos. Neste contexto, o presente projeto propõe, por meio da aplicação de estratégias de genômica funcional e bioquímica, aprofundar o entendimento acerca do papel da luz, dos fitohormônios e do NO na regulação da diferenciação e atividade plastidial com o intuito de identificar genes e mecanismos que controlem o metabolismo de compostos nutracêuticos em tomateiro.

A heterose, também conhecida como vigor híbrido, é a superioridade apresentada por um híbrido sobre seus genitores a respeito de caracteres como taxa de crescimento, sucesso reprodutivo e produtividade. Embora a heterose tenha sido extensamente utilizada na agropecuária, tanto para o melhoramento de plantas quanto de animais, os mecanismos moleculares que a determinam não têm sido elucidados, dificultando o desenho racional de híbridos de forma rápida e eficiente. No entanto os dados coletados em diversas espécies permitem hipotetizar que alterações no estado epigenético, mediadas por mudanças no padrão de metilação do DNA, participem da determinação do vigor híbrido. Neste contexto, o presente projeto propõe abordar este tema utilizado como espécie modelo o tomateiro, Solanum lycopersicum, cujos frutos carnosos possuem grande importância agronômica e nutricional na dieta humana. Serão utilizados três híbridos e seus respectivos genitores, os quais têm sido obtidos e detalhadamente caracterizados fenotipicamente pelo grupo colaborador coordenado pela Profa. Mathilde Causse do INRA de Avignon, França. A caracterização genômica será realizada por meio da obtenção dos perfis de expressão gênica (RNAseq), de pequenos RNAs de interferência (siRNAs) e do metiloma; dados que serão analisados de forma integrada aos fenotípicos. Os resultados permitirão aumentar o entendimento sobre os mecanismos que determinam a heterose viabilizando, futuramente, a manipulação deste complexo fenômeno.

Desvendando a regulação do metabolismo de vitamina E em Solanum lycopersicum


Chamada FAPESP?CONICET 2013







Processos Associados:
Auxílio Regular: 12/12531-8
Bolsa de doutorado 11/50434-1.



Responsável brasileiro:
Profa. Dra. Maria Magdalena Rossi
Laboratório de Genética Molecular de Plantas
Departamento de Botânica
Instituto de Biociências - Universidade de São Paulo

Responsável argentino:
Prof. Dr. Fernando Carrari
Universidad de Buenos Aires
Facultad de Agronomía
Cátedra de Biologia Aplicada y Alimentos.



Junho 2013
 
 
RESUMO
Além de uma cultura de grande importância econômica e nutricional, o tomateiro (Solanum lycopersicum) é uma espécie modelo para estudos de fisiologia vegetal. Tanto o fruto fresco quanto os produtos derivados do tomate constituem fonte de diversos antioxidantes, incluindo a vitamina E (VTE). O entendimento dos mecanismos responsáveis pela síntese, transporte e acúmulo da VTE em plantas é de grande interesse devido sua importância nutricional, para a saúde humana, e fisiológica, para o desenvolvimento do organismo vegetal. Em 2011, nosso grupo de pesquisa identificou todos os genes da rota biossintética de VTE no tomateiro assim como 12 loci para caracteres quantitativos (QTL) relacionados ao seu conteúdo em frutos maduros. A análise integrada de dados metabólicos, genômicos e genéticos resultou na proposição de 16 genes candidatos como possíveis determinantes genéticos dos QTL mapeados. Entre eles, destacam-se alguns genes que codificam enzimas da rota biossintética, um possível transportador de VTE e genes relacionados à defitilação de clorofila. A degradação de clorofila é um dos processos bioquímicos característicos do amadurecimento do tomate e há evidencias da existência de um crosstalk com o metabolismo de VTE, já que o fitol liberado poderia ser utilizado como precursor da cauda poliprenílica da VTE. Neste contexto, o presente projeto visa aferir o papel de genes envolvidos na biossíntese e transporte de tococromaóis, assim como regulatórios da degradação de clorofila e do amadurecimento, no acúmulo de VTE no tomateiro. Para atingir o objetivo propõem-se duas estratégias: i) identificação e avaliação fenotípica de mutantes e, ii) Caracterização funcional do putativo transportador de VTE.

A senescência foliar se inicia no momento no qual a folha apresenta o maior potencial fotossintético e durante sua progressão ocorre o declínio da atividade fotoquímica pela degradação da maquinaria fotossintética e a realocação de nutrientes para outras regiões da planta. Diversas evidências indicam que o retardo da senescência, mantendo a produção de fotoassimilados ativa por maiores períodos, pode resultar no aumento da produtividade da planta tornando-se um caráter de grande de interesse agronômico. A degradação de clorofila também se mostra um processo cuja manipulação é interessante para o aprimoramento da qualidade nutricional das culturas. A defitilação da clorofila libera fitol, o qual é um precursor direto para a síntese de tocoferóis, compostos com atividade de vitamina E. A vitamina E é um poderoso antioxidante que atua na proteção de pigmentos, proteínas e ácidos graxos poli-insaturados do aparato fotossintético contra espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas durante a fotossíntese. Já na saúde humana, a vitamina E tem demonstrado participar na prevenção de doenças cardiovasculares, câncer de mama e proteção contra o estresse oxidativo induzido por nicotina. A maior parte dos estudos de ambos os processos utilizam a planta modelo Arabidopsis thaliana ou gramíneas, tornando escassas as informações relativas a plantas com frutos carnosos. Neste sentido, Solanum lycopersicum é um excelente modelo de estudo não apenas pela disponibilidade de recursos genético e genômicos, mas também pela importância agronômica e nutricional desta espécie. Desta forma, o presente projeto pretende estudar a dinâmica destes dois processos em tomateiro por meio da avaliação do efeito do atraso no início da senescência na fisiologia da planta e, da caracterização funcional de enzimas defitiladoras da clorofila e fitol quinase (envolvida na reciclagem do fitol). Os resultados aumentarão o nosso conhecimento sobre as bases genéticas de caracteres de interesse agronômico possibilitando o desenvolvimento de novas estratégias para o melhoramento vegetal.

Além de uma cultura de grande importância econômica e nutricional, o tomateiro (Solanum lycopersicum) é um relevante modelo de estudo para estudos de fisiologia vegetal. Tanto o fruto fresco quanto os produtos derivados do tomate constituem fonte de diversos antioxidantes, incluindo a vitamina E (VTE). O entendimento dos mecanismos responsáveis pela síntese, transporte e acúmulo da VTE em plantas é de grande interesse devido sua importância nutricional para a saúde humana e fisiológica para o desenvolvimento do organismo vegetal. Em estudo anterior, loci para caracteres quantitativos (QTL) relacionados ao conteúdo de VTE em frutos maduros foram determinados a partir da realização de um perfil metabólico das diferentes isoformas de tocoferol (α, β, µ e δ) em uma população de linhagens introgredidas (ILs) de S. pennellii. A análise integrada de dados metabólicos, genômicos e genéticos resultou na proposição de 16 loci candidatos que poderiam explicar as mudanças no conteúdo de tocoferol nas ILs. Em conjunto, esses resultados representam um importante passo para o entendimento dos componentes genéticos envolvidos na determinação da variação natural do conteúdo de VTE em frutos de tomate, uma vez que fornece uma vasta plataforma de dados para estudos funcionais que irão contribuir para elucidação da regulação da biossíntese de tococromanóis na espécie. Nesse sentido, o objetivo do presente projeto é aprofundar o entendimento do impacto de três grupos de genes candidatos na biossíntese e acúmulo de VTE, por meio de análises funcionais. Este estudo propõe para cada um dos genes: (i) realizar um perfil transcricional dos alelos cultivado e selvagem, assim como avaliar o impacto da presença dos alelos selvagens na expressão do resto dos genes da rota biossíntética de VTE; (ii) determinar a localização subcelular das proteínas e; (iii) aferir o efeito do silenciamento gênico sob o conteúdo de VTE utilizando o sistema de VIGS (Virus Induced Gene Silencing). Os resultados a serem obtidos permitirão estabelecer estratégias para a manipulação do metabolismo de forma de aprimorar o valor nutricional do tomate.

Além de uma cultura de grande importância econômica e nutricional, o tomateiro (Solanum lycopersicum) é um relevante modelo de estudo para estudos de fisiologia vegetal. Tanto o fruto fresco quanto os produtos derivados do tomate constituem fonte de diversos antioxidantes, incluindo a vitamina E (VTE). O entendimento dos mecanismos responsáveis pela síntese, transporte e acúmulo da VTE em plantas é de grande interesse devido sua importância nutricional para a saúde humana e fisiológica para o desenvolvimento do organismo vegetal. Em estudo anterior, loci para caracteres quantitativos (QTL) relacionados ao conteúdo de VTE em frutos maduros foram determinados a partir da realização de um perfil metabólico das diferentes isoformas de tocoferol (α, β, µ e δ) em uma população de linhagens introgredidas (ILs) de S. pennellii. A análise integrada de dados metabólicos, genômicos e genéticos resultou na proposição de 16 loci candidatos que poderiam explicar as mudanças no conteúdo de tocoferol nas ILs. Em conjunto, esses resultados representam um importante passo para o entendimento dos componentes genéticos envolvidos na determinação da variação natural do conteúdo de VTE em frutos de tomate, uma vez que fornece uma vasta plataforma de dados para estudos funcionais que irão contribuir para elucidação da regulação da biossíntese de tococromanóis na espécie. Nesse sentido, o objetivo do presente projeto é aprofundar o entendimento do impacto de três grupos de genes candidatos na biossíntese e acúmulo de VTE, por meio de análises funcionais. Este estudo propõe para cada um dos genes: (i) realizar um perfil transcricional dos alelos cultivado e selvagem, assim como avaliar o impacto da presença dos alelos selvagens na expressão do resto dos genes da rota biossíntética de VTE; (ii) determinar a localização subcelular das proteínas e; (iii) aferir o efeito do silenciamento gênico sob o conteúdo de VTE utilizando o sistema de VIGS (Virus Induced Gene Silencing). Os

O grupo de pesquisa do Laboratório de Genética Molecular de Plantas do IB-USP trabalha desde 2006 na identificação de genes que determinam o conteúdo de açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos e vitamina E (-tocoferol) no fruto de tomate a partir da caracterização fenotípica de linhagens introgredidas (ILs) de S. pennellii num fundo genético de S. lycopersicum. Bermúdez et al. (2008) identificaram e caracterizaram 127 genes candidatos possivelmente envolvidos nas mudanças observadas entre as ILs e S. lycopersicum através da clonagem e sequenciamento dos alelos de ambas as espécies. Em particular, a partir dos resultados obtidos no contexto do Auxilio Regular FAPESP 08/50946-0 (vigente até 30/06/2010), quatro desses genes se apresentam particularmente interessantes: um gene de galacturonosil transferase, uma chaperona DnaJ, um gene que codifica para uma lisina decarboxilase e um transportador de tocoferol. Para testar a hipótese do envolvimento destes genes nos caracteres metabólicos, estudados foram obtidas plantas transgênicas expressando uma construção para desencadear o silenciamento dos mesmos. O presente projeto pretende dar continuidade aos estudos realizados caracterizando genotípica e fenotípicamente as plantas transgênicas. Além disso, propõe a identificação, clonagem e caracterização de genes envolvidos no metabolismo da vitamina E através da comparação entre os alelos de S. pennellii e S. lycopersicum. Desta maneira, os dados gerados contribuirão para aprimorar o entendimento dos fatores regulatórios subjacentes do metabolismo que determinam a composição química de um fruto de grande importância industrial e nutricional.

A introdução de germoplasma selvagem tem se apresentado como uma importante fonte de diversidade para o melhoramento vegetal. Diversos genes de resistência já foram identificados em espécies selvagens de tomate e incorporados às variedades comerciais de Solanum lycopersicum. Mas, recentemente, esta estratégia se revelou para caracteres de interesse agronômico no que respeita à composição metabólica de frutos. Em 2006, Schauer et al. identificaram 889 loci metabólicos quantitativos (QMLs, quantitative metabolic loci) e 326 loci associados a rendimento (YALs, yield-associated loci) distribuídos ao longo do genoma de tomate em linhagens introgredidas de Solanum pennellii. Um subgrupo destes caracteres, relacionados ao conteúdo de aminoácidos, ácidos orgânicos e açúcares, localizados em 16 regiões genômicas, foi estudado por Bermudez et al. (submetido, ver anexo) sendo caracterizados 127 genes candidatos que poderiam estar envolvidos nas mudanças metabólicas observadas. O presente projeto pretende aprofundar o estudo destas regiões abordando duas estratégias. A primeira é a construção de um mapa físico a partir do ordenamento de clones de BAC e COS que permita avaliar o grau de colinearidade das regiões ortólogas de ambas as espécies. Isto será complementado com o sequenciamento de alguns clones para a realização de uma análise comparativa mais detalhada. A segunda estratégia visa à análise funcional de alguns dos genes candidatos identificados para acrescentar evidências que fortaleçam as suas candidaturas.

A introdução de germoplasma selvagem tem se apresentado como uma importante fonte de diversidade para o melhoramento vegetal. Diversos genes de resistência já foram identificados em espécies selvagens de tomate e incorporados às variedades comerciais de Solanum lycopersicum. Mas, recentemente, esta estratégia se revelou para caracteres de interesse agronômico no que respeita à composição metabólica de frutos. Em 2006, Schauer et al. identificaram 889 loci metabólicos quantitativos (QMLs, quantitative metabolic loci) e 326 loci associados a rendimento (YALs, yield-associated loci) distribuídos ao longo do genoma de tomate em linhagens introgredidas de Solanum pennellii. Um subgrupo destes caracteres, relacionados ao conteúdo de aminoácidos, ácidos orgânicos e açúcares, localizados em 16 regiões genômicas, foi estudado por Bermudez et al. (2008) sendo caracterizados 127 genes candidatos que poderiam estar envolvidos nas mudanças metabólicas observadas. O presente projeto pretende aprofundar o estudo de 14 destes genes associados a mudanças no conteúdo de açúcares, aminoácidos, vitaminas C e E, e ácidos graxos observadas entre S. lycopersicum e S. pennellii através de ferramentas de genômica funcional; com o fim último de identificar genes alvos para o melhoramento da qualidade nutricional de tomate.

A introdução de germoplasma selvagem tem se apresentado como uma importante fonte de diversidade para o melhoramento vegetal. Diversos genes de resistência já foram identificados em espécies selvagens de tomate e incorporados às variedades comerciais de Solanum lycopersicum. Mas, recentemente, esta estratégia se revelou para caracteres de interesse agronômico no que respeita à composição metabólica de frutos. Em 2006, Schauer et al. identificaram 889 loci metabólicos quantitativos (QMLs, quantitative metabolic loci) e 326 loci associados a rendimento (YALs, yield-associated loci) distribuídos ao longo do genoma de tomate em linhagens introgredidas de Solanum pennellii. Um subgrupo destes caracteres, relacionados ao conteúdo de aminoácidos, ácidos orgânicos e açúcares, localizados em 16 regiões genômicas, vem sendo estudado pelo nosso laboratório e têm sido caracterizados 127 genes candidatos que poderiam estar envolvidos nas mudanças metabólicas observadas. O presente projeto pretende aprofundar o estudo destas regiões abordando duas estratégias. A primeira é a construção de um mapa físico a partir do ordenamento de clones de BAC e COS que permita avaliar o grau de colinearidade das regiões ortólogas de ambas as espécies. Isto será complementado com o sequenciamento de alguns clones para a realização de uma análise comparativa mais detalhada. A segunda estratégia visa à análise funcional de alguns dos genes candidatos identificados para acrescentar evidências que fortaleçam as suas candidaturas.

Os elementos de transposição (TEs) constituem parte importante do material genético dos eucariontes, podendo representar desde 45 % em humanos até 50-80 % no genoma de gramíneas. No banco de dados do SUCEST, foi encontrado um abundante espectro de TEs sendo expressos. O elemento mais freqüente foi o transposon MuDR. Resultados obtidos em nosso laboratório revelaram que existem pelo menos três classes destes transposons em plantas e que estas existiam previamente à divergência entre mono e dicotiledôneas. Dentro de cada uma das classes são mantidas as relações filogenéticas entre as espécies. Cada classe apresenta padrões de inserção genômica, assim como freqüência de ?stop codons? e ?frame shifts? distintos, estas observações sugerem diferenças nos níveis de atividade dos elementos. Neste contexto, este projeto visa a clonagem de elementos MuDR de cana de açúcar para sua posterior caracterização genômica e funcional, sendo os objetivos específicos: a clonagem de pelo menos um elemento MuDR para cada uma das três classes identificadas, caracterização estrutural dos elementos clonados (introns, exons, TIRs, etc), caracterização das regiões flanqueadoras, avaliação do número de cópias, identificação da contribuição dos parentais do híbrido, e o estudo da expressão dos elementos.

Elementos de transposição são seqüências genéticas móveis responsáveis em parte por gerar variabilidade genética. Variabilidade esta gerada como conseqüência de capacidade intrínseca de mudar de lugar nos genomas em que se encontram associados. Este projeto pretende analisar o impacto destes elementos em genomas de plantas e em bactérias. A abordagem experimental será diversificada uma vez que elementos distintos e com conhecimento inerente heterogêneo são a base deste projeto. Em plantas, daremos continuidade aos trabalhos iniciados pelo grupo quando do isolamento e caracterização do retrotransposon Retrolyc1 e o estudo estará centrado no controle da expressão do elemento em nível transcricional. Ainda no contexto de Solanaceae, iniciaremos uma busca por retroelementos em plantas silvestres e cultivadas de Solanum dando ênfase ao estudo do polimorfismo de inserção associado à ploidia e domesticação das espécies selecionadas. A partir do projeto SUCEST foram identificadas 21 famílias de elementos de transposição presentes e expressos no genoma de cana de açúcar. Pretendemos aprofundar os estudos em quatro destas famílias sendo elas a família dos transposons do tipo Mu e hAT, assim como dos retroelementos Tnt1 e Hopscotch. De um lado, será avaliada a atividade de transposição destes elementos e também a contribuição dos progenitores em elementos de transposição na constituição do genoma híbrido de cana de açúcar. A função integrase é uma atividade protéica associada ao corte da cadeia fosfodiéster da molécula de DNA e é comum as transposases, recombinases e integrases, sendo que o que as diferencia é o modo em que o corte é efetivamente gerado na molécula. Neste contexto a ampliação dos estudos do grupo para incluir integrases presentes nos genomas bacterianos tem como objetivo a comparação do conteúdo em integrases e das regiões associadas de quatro linhagens de Xylella fastidiosa. A avaliação da contribuição genética de cada uma das regiões associadas às integrases