Vanessa Morais Freitas.

Curso de 4 horas online ministrado durante o USP Escola em 18 e 19 de janeiro de 2021

O câncer de mama é o tipo de tumor mais comum entre as mulheres, sendo o subtipo triplo negativo (TNBC) o mais agressivo, associado a altas taxas de mortalidade e menor sobrevida em casos metastáticos. A metástase ocorre pelo espalhamento do tumor através da circulação, envolvendo processos como intravasamento e extravasamento de células tumorais através do endotélio. Estudos sugerem que vesículas extracelulares (EVs), liberadas pelas células tumorais, desempenham um papel crucial no preparo do nicho metastático. Essas EVs modulam o microambiente tumoral, aumentando a permeabilidade das células endoteliais (ECs) e permitindo que células tumorais atravessem as junções entre essas células. Além disso, o fluxo sanguíneo exerce um estresse de cisalhamento (FSS, do inglês fluid shear stress), que influencia a adesão e o extravasamento das células tumorais.Dados preliminares do nosso grupo mostraram que pequenas EVs (sEVs) derivadas de células TNBC se acumulam sobre as junções célula-célula de células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) sob FSS. Além disso, análises de espectrometria de massa comparando células endoteliais em condições estáticas e sob FSS identificaram um grupo de proteínas, presentes na membrana plasmática e em junções célula-célula, que são mais abundantes em células submetidas ao FSS. O objetivo deste estudo é identificar as proteínas de junção célula-célula que interagem com sEVs tumorais e investigar como essa interação afeta a adesão de células tumorais circulantes (CTCs) na monocamada de ECs sob FSS.Para isso, células HUVEC serão tratadas com sEVs tumorais, e as proteínas de superfície celular, incluindo aquelas que se ligaram às sEVs, serão biotiniladas para evitar contaminação com vesículas do sistema endossômico-lisossômico presentes no citoplasma. Em seguida, os lisados celulares serão purificados em colunas de estreptavidina-agarose, e as proteínas associadas ao CD63 serão co-imunoprecipitadas, com análise posterior por Western blot e/ou espectrometria de massa. Adicionalmente, ensaios de microfluídica serão realizados para avaliar a adesão, extravasamento e viabilidade de células tumorais circulantes em ECs tratadas ou não com sEVs.Os resultados esperados devem complementar os estudos anteriores do grupo, elucidando um mecanismo inovador pelo qual as sEVs modulam a permeabilidade vascular e promovem a metástase em TNBC. Esses achados podem abrir novas perspectivas para o desenvolvimento de terapias focadas na inibição dessa interação e no bloqueio do preparo do sítio metastático.

O câncer de mama é o tipo de tumor mais frequente entre mulheres no mundo inteiro. O subtipo mais agressivo é o triplo negativo (CMTN), apresentando um prognóstico ruim e uma baixa sobrevida quando metastático. Metástase consiste em uma das principais características do câncer, no qual células tumorais adquirem capacidade de invadir o sistema circulatório e colonizar outros órgãos. O papel de vesículas secretadas por células tumorais no preparo do nicho metastático vem sido recentemente discutido na literatura. Essas vesículas extracelulares (VEs), contém biomoléculas (e.g.: DNA, RNA e proteínas), compõe o microambiente tumoral e são capazes de modular a permeabilidade de células endoteliais (CEs) que revestem os vasos sanguíneos, permitindo o extravasamento das células tumorais para o sítio metastático. Além disso, é também necessário considerar que fluxo sanguíneo exerce uma força friccional constante ? denominada shear-stress - nas CEs, provocando alterações que podem facilitar a adesão e extravasamento de células. Neste projeto, investigaremos o papel de VEs provenientes da linhagem celular humana de CMTP MDA-MB-231 na formação do nicho metastático através da modulação CEs em modelo de fluído estático ou sob shear-stress. Com esse fim, iremos avaliar a morfologia de CEs por microscopia de contraste de fase; modulação de vias de endocitose de VEs por microscopia eletrônica; e faremos análise comparativa da proteômica de proteínas de membrana plasmática de CEs e de VEs, buscando possíveis interações entre essas proteínas por análise in silico. Buscamos desenvolver, através deste projeto, possíveis estratégias de inibição do fenômeno de invasão e metástase em CMTP, levando a uma melhora no prognóstico e sobrevida da doença.

O câncer de mama é a doença maligna mais comum, que afeta as mulheres, sendo o subtipo triplo negativo (TN) considerado o de pior prognóstico com alta frequência de metástase. Sabe-se que as plaquetas possuem papel importante na metástase tumoral, que podem receber RNAs e proteínas de células tumorais que ocasionam uma modificação na funcionalidade das mesmas. Essas plaquetas educadas pelo tumor (TEPs) promovem a sobrevivência das células tumorais circulantes (CTCs) protegendo da vigilância imunológica, bem como influenciam na adesão celular, parada na vasculatura e permeabilidade vascular, contribuindo para disseminação metastática. A assinatura de miRNAs (pequenos RNAs não-codificantes) de TEPs tem sido apontada como ferramenta de biópsia líquida com potencial diagnóstico, prognóstico e terapêutico. Entretanto, a assinatura de miRNAs de TEPs em tumores TN, bem como a associação com CTCs e outras células ainda não foi elucidada. A hipótese é que o perfil de miRNAs das TEPs de pacientes com TN metastático contribui para disseminação tumoral. A expressão de miRNAs de plaquetas é anormal e específica para cada tumor. Os miRNAs de plaquetas teriam maior precisão e especificidade do que os marcadores convencionais de detecção tumoral e miRNAs circulantes no diagnóstico de tumor. Os miRNAs enriquecidos com plaquetas podem influenciar o tumor: regulando a proliferação, metástase, resposta imune, trombose e terapia antitumoral. Temos uma oportunidade única de combinar a experiência de centros de pesquisa de duas regiões do país para elucidar o perfil molecular de TEPs em tumores TN através do sequenciamento NGS. Posteriormente, correlacionar a assinatura de miRNAs com o fenótipo invasivo e tronco das CTCs, caracterização fenotípica de macrófagos associados ao tumor (MATs) e ativação do endotélio através de estudos funcionais. Esse conhecimento será importante para a identificação de alvos terapêuticos e biomarcadores, que vão melhorar a precisão prognóstica e preditiva.

Bioimpressão 3D é uma abordagem emergente para a produção de modelos organotípicos que recapitulam a interação entre células e célula-matriz in vivo. A engenharia tecidual recria modelos 3D de órgãos saudáveis ou de doenças humanas que podem ser aplicados em testes de segurança e eficácia de medicamentos, cosméticos e em transplantes com a bioimpressão de órgãos. Neste projeto, desenvolveremos modelos de pele, mama normal e tumoral, e pulmão que contribuirão na substituição de animais na pesquisa.

O câncer é a principal causa de morte nos países economicamente desenvolvidos e a segunda principal causa de morte nos países em desenvolvimento. O processo tumoral acontece a partir de uma sucessão progressiva de alterações genéticas, cada uma conferindo um ou outro tipo de vantagem de crescimento, levando a uma progressiva conversão de células normais em células com fenótipo maligno. O microambiente em que os tumores se desenvolvem podem regular aspectos do tumor como, por exemplo, a angiogênese, invasão e metástase. Esse microambiente é formado pelos componentes do estroma tumoral, fibroblastos, células endoteliais, células do sistema imunológico, proteínas e proteoglicanos da matriz extracelular, fatores de crescimento e proteases que remodelam esses componentes. Uma dessas metaloproteases de matriz extracelular são as ADAMTS (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs ou adamalysin-thrombospondin), enzimas MMP-relacionadas dependentes de Zn2+ / Ca2+ secretadas e que estão envolvidas nas seguintes funções: processamento de colágeno, clivagem dos proteoglicanos da matriz, angiogênese, clivagem do fator de Von Willebrand, inflamação, organogênese e fertilidade. Apesar de descrita como uma protease extracelular, dados publicados do nosso laboratório mostram que tanto por imunolocalização, quanto por Western Blot que ADAMTS-1 está presente no núcleo de três linhagens celulares mamárias humanas (MCF-10A, MCF-7 e MDA-MB-231). Além dos nossos dados, não existem outros estudos que descrevam a famílias das ADAMTSs no núcleo, no entanto dados da literatura mostram que outras metaloproteases da matriz, MMP-2, MMP-3 e o inibidor de MMP, TIMP-1 já foram observadas no núcleo de células. Desta forma, pretendemos avaliar em qual contexto ADAMTS-1 alcança o núcleo e se a indução da protease neste compartimento celular está envolvida com alterações morfológicas ou nas funções básicas, como proliferação e migração celular. As informações obtidas nesse projeto nos ajudarão a entender a função de ADAMTS-1 no núcleo e possuem potencial para trazer novas informações sobre processos básicos das células, como secreção, endocitose e transporte nucleo-citoplasmático de proteínas.

O câncer de mama representa o 2º câncer mais letal em todo o mundo, sendo a malignidade mais frequente e mortal na população do sexo feminino. Durante a progressão tumoral, a angiogênese é estimulada por células tumorais e garante o aporte de nutrientes e oxigênio garantindo o crescimento sustentado das células tumorais. Antes da formação desses novos vasos, as condições presentes no microambiente tumoral incluem acidose, hipóxia, limitação de nutrientes e em células metastáticas, ausência de substrato adesivo. Acreditamos que somente células resistentes à essas condições inóspitas podem sobreviver e dar continuidade ao crescimento do tumor. Em contrapartida, o modelo in vitro convencionalmente utilizado no estudo do câncer não reproduz fielmente o microambiente tumoral, pois apresenta pH neutro, normóxico, com meios nutritivos e substratos bidimensionais plásticos tratados para facilitar a adesão celular. Nosso laboratório, utilizando PCR array, avaliou a expressão gênica de células tumorais de mama em diferentes situações de estresse e observamos o aumento da expressão de genes envolvidos na angiogênese quando as células tumorais são cultivadas em pH ácido. Além disso, observamos que células tumorais resistentes ao pH ácido, produzem mais vesículas extracelulares do que as células controle. Essas vesículas podem levar informações específicas para células do microambiente tumoral, incluindo as células endoteliais. Temos o intuito de investigar se a diminuição no pH em culturas de células tumorais poderia induzir a formação de novos vasos por células vizinhas (endoteliais). Além da angiogênese temos a intenção de estudar se as vesículas podem modificar o comportamento das células tumorais aumentando moléculas de adesão e consequentemente o comportamento adesivo de células tumorais ao endotélio. Também investigaremos se a internalização de vesículas extracelulares é diferente entre células endoteliais de diferentes origens, o que pode nos trazer mais informações sobre a formação dos sítios pré-metastáticos. Essas informações irão contribuir para o melhor entendimento da angiogênese e metástases dos tumores, o que pode aumentar as chances de conseguirmos novas terapias para barrar a progressão dos tumores de mama.

O câncer de mama representa o 2º câncer mais letal em todo o mundo, sendo a malignidade mais frequente e mortal na população do sexo feminino. Durante a progressão tumoral, a angiogênese é estimulada por células tumorais e garante o aporte de nutrientes e oxigênio garantindo o crescimento sustentado das células tumorais. Antes da formação desses novos vasos, as condições presentes no microambiente tumoral incluem acidose, hipóxia, limitação de nutrientes e em células metastáticas, ausência de substrato adesivo. Acreditamos que somente células resistentes à essas condições inóspitas podem sobreviver e dar continuidade ao crescimento do tumor. Em contrapartida, o modelo in vitro convencionalmente utilizado no estudo do câncer não reproduz fielmente o microambiente tumoral, pois apresenta pH neutro, normóxico, com meios nutritivos e substratos bidimensionais plásticos tratados para facilitar a adesão celular. Nosso laboratório, utilizando PCR array, avaliou a expressão gênica de células tumorais de mama em diferentes situações de estresse e observamos o aumento da expressão de genes envolvidos na angiogênese quando as células tumorais são cultivadas em pH ácido. Além disso, observamos que células tumorais resistentes ao pH ácido, produzem mais vesículas extracelulares do que as células controle. Essas vesículas podem levar informações específicas para células do microambiente tumoral, incluindo as células endoteliais. Temos o intuito de investigar se a diminuição no pH em culturas de células tumorais poderia induzir a formação de novos vasos por células vizinhas (endoteliais). Essa informação vai contribuir para o entendimento da angiogênese em tumores, o que pode aumentar as chances de conseguirmos novas terapias para barrar a progressão dos tumores de mama.

O câncer de mama representa o 2º câncer mais letal em todo o mundo, sendo a malignidade mais frequente e mortal na população do sexo feminino. O câncer de mama é reconhecido por ser altamente heterogêneo e estudos recentes indicam que o pior prognóstico de determinados subtipos de câncer de mama pode estar relacionado à maior proporção de células com fenótipo tronco nestes casos. As células-tronco tumorais (CTTs) são capazes de autorrenovação e diferenciação celular, além de apresentarem elevada quimiorresistência, estando frequentemente associadas ao processo de recidiva tumoral. As condições presentes no microambiente tumoral incluem acidose, hipóxia, limitação de nutrientes e falta de substrato. Em contrapartida, o modelo in vitro convencionalmente utilizado no estudo do câncer não reproduz fielmente o microambiente tumoral, pois apresenta pH neutro, normóxico, com meios nutritivos e substratos bidimensionais plásticos tratados para facilitar a adesão celular. No intuito de melhor compreendermos o papel do microambiente no comportamento das células tumorais, realizaremos ensaios em que as células tumorais serão expostas a condições de estresse próximas às observadas in vivo, resultando em morte das células não adaptadas. Avaliaremos o fenótipo tronco das células resistentes através da expressão gênica, expressão proteica, liberação de vesículas, habilidade de formar colônias no ágar, migrar e invadir barreiras in vitro além da capacidade tumorigênica e metastática dessas linhagens in vivo. A geração dessas linhagens resistentes e possivelmente enriquecidas com células tronco tumorais irá auxiliar no maior entendimento da doença e servir de modelo para o desenvolvimento de medicamentos capazes de combater os tumores mais agressivos.

O fibrossarcoma é um tipo de câncer agressivo e se caracteriza pela presença de fibroblastos malignos imaturos com divisão celular sem controle que formam tumores sólidos. O fibrossarcoma tem um comportamento clínico com elevadas taxas de recorrência local e baixa incidência de metástase. A progressão do câncer não depende apenas de novas habilidades adquiridas pela neoplasia, mas também da interação com seu microambiente. A matriz extracelular é importante para o desenvolvimento do câncer, pois ela interage com as células através de receptores de superfície celular que reconhecem fatores de crescimento, ativando vias de sinalização. Esta matriz possui proteínas, proteoglicanos, glicosaminoglicanos que funcionam como um reservatório de fatores de crescimento. Esses fatores de crescimento podem ser liberados da matriz no momento em que seus componentes são remodelados pelas proteases da matriz. Entre estas proteases temos a ADAMTS-1, o primeiro membro descrito da família ADAMTS (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs), que se caracteriza pela presença de domínio metaloproteinase, domínio desintegrina e trombonspondina. A interação entre os fatores de crescimento e os domínios trombonspondinas desta protease tornaria ADAMTS-1 candidata a modular o microambiente tumoral. O objetivo deste estudo é avaliar o papel da protease ADAMTS-1 no microambiente tumoral. Pretendemos analisar se esta protease é capaz de interferir nos efeitos dos fatores de crescimento; tanto na invasão local como na sistêmica de células do fibrossarcoma. Inicialmente, através de experimentos in vitro analisaremos as interações entre os fatores de crescimento e ADAMTS-1 como o uso do sistema de ressonância plasmônica. Com ensaios funcionais utilizando cultura de células vamos estudar os efeitos dessa possível interação na viabilidade de células tumorais. Além disso, avaliaremos se a presença de ADAMTS-1 interfere em diferentes vias de sinalização ativadas pelos fatores de crescimento. Utilizaremos embriões de zebrafish (Danio rerio) como modelo in vivo. As células tumorais serão evidenciadas com moléculas contendo GFP ou corantes fluorescentes. Após a modulação da expressão de ADAMTS-1 nas células tumorais, serão injetadas nos embriões. Será realizada a técnica de time-lapse para observar a dinâmica de interação da célula tumoral com estroma. Através de imunofluorescência observaremos o comportamento das células tumorais em relação aos vasos sanguíneos. Acreditamos assim, que nossos dados fornecerão informações sobre esse tumor que poderão auxiliar no sucesso do tratamento dessa neoplasia na clínica.

Tenho estudado o papel da matriz extra celular e de proteases em biologia tumoral (Franca et al. 2001; Freitas & Jaeger 2002; Freitas et al. 2004; Pinheiro et al. 2004; Freitas et al. 2007; Morais Freitas et al. 2007; Freitas et al. 2008; Gama-de-Souza et al. 2008; Jaeger et al. 2008; Nascimento et al. 2010). Dados obtidos durante meu Pós-Doutorado mostraram que a diminuição de ADAMTS-1, através de nocaute funcional com RNAi, aumenta a migração e invasão em células tumorais de mama com alto grau de malignidade (MDA-MB-231). No projeto proposto, será dada continuidade aos resultados obtidos durante meu Pós-Doutorado, com a ampliação dos questionamentos sobre a molécula de ADAMTS-1. Tentaremos compreender o papel dessa molécula no comportamento de tumores de mama humanos, estabelecendo relação entre a presença de ADAMTS-1, o tipo histológico do tumor e sua graduação histológica. Adicionalmente, a expressão de ADAMTS-1 será correlacionada a curvas de sobrevida de pacientes. Além do estudo in vivo, utilizaremos sistemas in vitro para estudar mecanismos moleculares regulatórios de ADAMTS-1. O modelo in vitro utilizando linhagens celulares com diferentes graus de malignidade irá responder se os níveis de ADAMTS-1 (mRNA e proteína) são alterados na presença de fatores de crescimento e hormônios importantes em neoplasias de mama. Esse modelo também responderá se ADAMTS-1 influencia os receptores desses fatores de crescimento e hormônios, bem como se existe alteração na sinalização envolvendo esses receptores. Finalizando, investigaremos se essa protease modula o micro-ambiente tumoral. Para tanto, analisaremos o efeito de ADAMTS-1 nas seguintes situações experimentais: 1) co-culturas celulares, 2) presença dessa molécula na matriz extracelular extraída de tumores mamários, e 3) células neoplásicas com ADAMTS-1 silenciada serão submetidas a xeno-enxertos em animais atímicos.

Nesse projeto analisaremos o papel dos genes DDEF2 e ADAMTS-1 em células tumorais de mama com alto potencial de invasão. DDEF2 codifica DDEF2, proteína ativadora de GTPases, ligante de paxilina e que está intimamente relacionada a migração e invasão celular. ADAMTS-1 codifica proteína de mesmo nome, que possui domínios de metaloprotease, desintegrina e trombospondina. Essa proteína está relacionada a diversas atividades incluindo proteólise, adesão e sinalização celulares. Em primeiro lugar, analisaremos se há mudança na expressão desses genes em células cultivadas em monocamada ou em ambiente tridimensional, isso será feito através de PCR quantitativo e/ou ?immnunoblot?. Em seguida, estudaremos os efeitos das proteínas DDEF2 e ADAMTS-1 na migração, invasão e formação de invadopódios através do silenciamento dessas proteínas por RNA de interferência (siRNA). Para estudarmos o efeito das proteínas na atividade migratória utilizaremos ensaio de ?ferida? em monocamada e ensaio de vídeo-microscopia em ?time-lapse?. Para o estudo do comportamento invasivo das linhagens celulares, faremos uso de câmaras de invasão (Boyden), coberta por membrana basal reconstituída (Matrigel). Para finalizar, utilizaremos substratos fluorescentes a fim de analisar a atividade de protease e/ou a formação de invadopódios em células que foram transfectadas ou não com siRNA para as proteínas DDEF2 ou ADAMTS-1.

O cultivo celular em ambiente tridimensional utilizando membrana basal reconstituída permite que as células se organizem gerando estruturas semelhantes àquelas presentes in vivo. Essa semelhança é importante quando precisamos de modelo experimental mais complexo que o cultivo celular realizado em monocamada e, ao mesmo tempo, com uma quantidade menor de variáveis quando comparado aos modelos in vivo. Células derivadas de tumores de mama humano quando crescidas em ambiente tridimensional de Matrigel formam estruturas semelhantes aos tumores in vivo. Essas estruturas podem ser tratadas por agentes farmacológicos, tornando-se bons modelos para teste de novas substâncias. Entre essas substâncias destacamos as oriundas de organismos marinhos, que são fontes de numerosos compostos químicos. Entre esses compostos existem substâncias bioativas com potencialidade de aproveitamento pela indústria farmacêutica. O Laboratório de Biologia da Célula Tumoral investiga a atividade anti-tumorigênica de compostos bioativos purificados a partir de extratos derivadas da esponja marinha Geodia corticostylifera. A partir dessa esponja foram purificados depsipeptídeos cíclicos geodiamolídeos, que serão testados em células derivadas de tumores de mama humanos, cultivadas em ambiente tridimensional de Matrigel. Através de métodos morfológicos, bioquímicos e de biologia molecular, avaliaremos os efeitos dessas substâncias quanto à proliferação, desorganização do citoesqueleto e indução de apoptose. Auxílio à Pesquisa Primeiros Projetos (FAPESP 2006/59866-3).