Luis Felipe Prada e Silva.

Dietas de terminação de gado de corte possuem níveis elevados de energia, o que representa um grande desafio para manutenção da estabilidade ruminal. Com o uso crescente da silagem de cana-de-açúcar na alimentação de ruminantes, se torna fundamental o entendimento dos efeitos de diferentes fontes energéticas sobre o metabolismo ruminal e desempenho animal. Objetiva-se com este estudo quantificar o efeito da substituição parcial do milho moído fino por milho floculado ou polpa cítrica sobre o ganho de peso, consumo e características de carcaça de tourinhos Nelore em terminação. Pretende-se ainda, quantificar o efeito das diferentes fontes de carboidratos não fibrosos (CNF), em dois níveis de concentrado na dieta, sobre a fermentação ruminal, cinética da degradação e passagem ruminal da fibra; digestibilidade total da MS e amido. Por fim, objetiva-se caracterizar as mudanças na população bacteriana ruminal ocasionadas pelo aumento de concentrado na dieta e pela utilização de fontes diferentes de CNF, determinando a quantidade relativa de bactérias amilolíticas, celulolíticas e fermentadoras de ácido lático. Para medição do desempenho e características de carcaça, serão utilizados 54 tourinhos da raça Nelore com aproximadamente 350 kg. Os tourinhos serão alojados em 18 baias de concreto, em delineamento experimental de blocos ao acaso com seis repetições, e o controle da alimentação será feito por baia, por meio da pesagem do alimento fornecido e das sobras diariamente. Para mensuração da cinética e ecossistema ruminal, seis novilhos Nelore canulados no rúmen serão utilizados em delineamento experimental de quadrado latino 6x6. As rações experimentais do ensaio de desempenho serão compostas por 80% de concentrado na matéria seca, e a silagem de cana-de-açúcar será utilizada como volumoso. Como fontes de carboidratos não fibrosos (CNF) serão utilizados o milho floculado ou a polpa cítrica, em substituição parcial ao milho moído. O desempenho dos animais será avaliado por meio de pesagens periódicas, após jejum de 16h, a fim de estimar o ganho médio diário e a eficiência alimentar. A deposição de gordura e crescimento muscular serão avaliados por meio de ultrassonografia no início e final do experimento. Amostras de sangue serão coletadas para dosagem dos parâmetros sanguíneos: glicose, nitrogênio ureico, proteínas totais e albumina. Nos animais canulados, a massa total do conteúdo ruminal e volume serão determinados por esvaziamento. Amostras serão retiradas de ambas as fases, sólida e líquida, para determinação do tamanho do compartimento ruminal de componentes da digesta. A dieta, sobras e digesta ruminal serão analisados para conteúdo de nutrientes. Fibra em detergente neutro indigestível será estimada como o conteúdo de FDN das amostras após fermentação in situ por 264 horas. A determinação do volume líquido e da taxa de passagem de líquidos pelo rúmen será realizada por polietilenoglicol de peso molecular 4.000. A quantificação relativa das bactérias celulolíticas, amilolíticas e utilizadoras de lactato será realizada por PCR em tempo-real após extração do DNA total.

A elucidação dos mecanismos moleculares pelos quais nutrição, genética e tratamentos hormonais alteram o início da puberdade é de fundamental importância para o desenvolvimento de estratégias que reduzam a idade ao primeiro parto, e consequentemente a taxa de desfrute do rebanho Nelore. Serão investigados os efeitos de implante de progesterona, e do estradiol endógeno, sobre mecanismos moleculares controlando a obtenção da puberdade de novilhas Nelore pré-púberes. Especificamente, as vias moleculares de sinalização da leptina, do estradiol, e do NPY serão estudas no hipotálamo, e a via do IGF-I, do GH e do LH serão estudadas no ovário. Trinta e seis novilhas Nelore não púberes, e com idade entre 13 e 14 meses, serão divididas em quatro grupos experimentais (nove por grupo): implante de P4 sem estradiol (P-E); implante de P4 com estradiol (P+E); sem implante de P4 e sem estradiol (E-); e sem implante de P4 e com estradiol (E+). As novilhas serão mantidas sob pastejo, com fornecimento de sal mineral e água à vontade. Ao término do tratamento hormonal todas as novilhas serão abatidas. O hipotálamo e os demais tecidos, exceto o ovário, serão colhidos e armazenados a -80 ºC. Os ovários serão submetidos ao isolamento das células da granulosa e estas serão armazenadas a -80 ºC. O RNA total será extraído, tratado com DNAse I e submetido à síntese de cDNA para estudo da expressão gênica por PCR em tempo real (qPCR). Um total de 14 genes candidatos serão quantificados por qPCR. Um estudo abrangente da administração de progesterona e do efeito do estrógeno endógeno será também realizado através de hibridização em microarranjos de DNA, de forma a identificar possíveis genes candidatos no hipotálamo. OS resultados obtidos por microarranjos serão validados pela quantificação por qPCR da expressão de 10 genes diferencialmente expressos.

A nutrição possui claro efeito sobre o desenvolvimento reprodutivo de bovinos, sendo a leptina indicada como possível elo entre nutrição e reprodução, sinalizando a condição corporal ao hipotálamo e exercendo efeito permissivo à obtenção da puberdade. Objetiva-se com este trabalho clonar a região codificadora da leptina bovina, produzir a proteína recombinante em levedura Pischia pastoris e avaliar sua atividade biológica. A região codificante da leptina bovina será obtida através da amplificação por PCR de cDNA transcrito a partir de RNA extraído de amostras de tecido adiposo de novilhas Nelore. O gene será clonado em vetor de expressão e este inserido por eletroporação em bactéria Echerichia coli TOP10TM. Após seleção das colônias, os plasmídios serão isolados e seqüenciados para confirmação de que o enxerto está alinhado com a sequência sinalizadora de secreção. Cepas de P. pastoris serão transformadas por eletroporação para secreção de leptina no meio de cultura, sendo a leptina purificada por três fases de cromatografia, dializada e liofilizada. Será realizado, então, um ensaio in vitro em células BAF/3 1442-Cl4 leptina-sensíveis, transfectadas com o receptor de leptina humano, avaliando a proliferação dessa linhagem de células em resposta à presença da leptina produzida.

A Embrapa Gado de Corte é a única instituição nacional e internacional que dispõe da coleção de P. maximum de forma ativa, com disponibilidade de plantas sexuais e conhecimento agregado para realizar o melhoramento genético da espécie (Savidan et al., 1989). Esta instituição é também a única, juntamente com seus parceiros, que já tem experiência no lançamento de cultivares que foram amplamente adotadas nos mercados nacionais e internacionais. O germoplasma de P. maximum foi introduzido no Brasil em 1982 por meio de um convênio entre a Embrapa e o ORSTOM (Institut Français de Recherche Scientifique pour le Développement en Coopération) atualmente IRD (Institut de Recherche pour le Développement). Foram recebidos 426 acessos apomíticos e 417 plantas sexuais. O germoplasma foi coletado em 1967 e 1969 no Centro de Origem no Quênia e Tanzânia, África do Leste (Combes & Pernès, 1970) e é representativo da variabilidade natural da espécie (Savidan et al., 1989. Sousa, 2010). Esta coleção foi totalmente avaliada morfologica e agronomicamente na Embrapa Gado de Corte em Campo Grande, MS (Jank et al., 1997). Foi encontrada variabilidade disponível para o melhoramento para todas características de produção e qualidade e para os 20 descritores morfológicos avaliados (Costa et al., 1989; Jank, 1995; Jank et al., 1994; Jank et al., 1997), como também para os descritores moleculares (Sousa et al., 2009). Variabilidade foi também encontrada para fixação de nitrogênio por bactérias (Miranda, 1988), tolerância a solos de baixa permeabilidade (Gontijo et al., 2004; Laura et al., 2005; Silva et al., 2006), ao crescimento sob luminosidade reduzida (Jank et al., 2005; 2006; Gontijo et al., 2005; Laura et al., 2006; Victor et al., 2006), a tolerância ao alumínio no solo (Almeida et al., 2000; Laura et al., 2006) e eficiência na absorção e uso de fósforo (Bonfleur et al., 2006). Esta proposta é a continuação do projeto do macroprograma 2 ?Obtenção de novas cultivares de Panicum maximum

Forragens formam a base da nutrição de ruminantes, e a digestibilidade da parede celular é o principal fator limitante de seu valor nutritivo. Sendo assim, a digestibilidade da parede celular deveria ser o alvo de programas de melhoramento genético visando à melhoria da qualidade de forragens tropicais. Dentre as forragens, a silagem de milho é amplamente utilizada pelos fazendeiros, principalmente em sistemas de produção que exploram o máximo do potencial genético dos animais. A identificação de um parâmetro de avaliação da qualidade da fibra que efetivamente tenha impacto sobre o desempenho animal é de grande importância para programas de melhoramento genético de híbridos de milho para silagem, e para seleção de híbridos por parte dos pecuaristas. Objetiva-se com este estudo avaliar o efeito do consumo de silagens de milho de alta ou baixa digestibilidade da fibra da haste, por novilhas em crescimento, sobre os seguintes parâmetros: 1) consumo de matéria seca; 2) ganho de peso e variação da condição corporal, 3) idade e peso vivo à puberdade, 4) taxa de digestão e passagem ruminal da fibra; 5) parâmetros de fermentação ruminal e 6) quantificação de bactérias ruminais celulolíticas, amilolíticas e utilizadora de lactato. Serão utilizadas quarenta e oito novilhas da raça Nelore com aproximadamente 250 kg. As novilhas serão confinadas em grupos de 3 novilhas por baia, e o controle da alimentação será feito por baia. As rações experimentais serão compostas de 20% ou 60% de concentrado na matéria seca e, como volumoso serão utilizadas as duas silagens de milho, com alta ou baixa digestibilidade da haste, perfazendo quatro dietas experimentais. Dezesseis novilhas serão fistuladas cirurgicamente para colocação de cânulas ruminais, e utilizadas para determinação da cinética ruminal da fibra: taxa de passagem e taxa de digestibilidade da fibra em detergente neutro. O delineamento estatístico será o de blocos casualizados com 8 repetições (desempenho) ou 4 repetições (cinét

Várias estratégias vêm sendo desenvolvidas para otimizar a composição da parede celular de plantas para melhorar o seu uso agro-industrial. Com relação ao uso de forragens na alimentação animal, a lignificação da parede celular que ocorre com o avanço da maturidade é o grande limitante à produtividade da pecuária. Apesar da importância das pastagens para a produção de ruminantes no Brasil, não existe nenhum estudo publicado envolvendo a alteração da síntese de lignina em forrageiras tropicais. Várias plantas de clima temperado, como tabaco, arabidopsis, alfafa e milho já sofreram alterações na expressão de enzimas envolvidas com a síntese de precursores da lignina (monolignóis) que resultou em menores teores de lignina e maior digestibilidade ruminal. Recentemente, os genes caféico O-metiltransferase (COMT), fenilalanina amônio liase (PAL) e cinamato 4-hidroxilase (C4H) foram identificados como correlacionados com a queda da digestibilidade da parede celular do colmo de P. maximum. Nossos objetivos com este projeto são sequenciar o quadro aberto de leitura dos genes COMT, PAL e C4H nas gramíneas P. maximum e B. brizantha; identificar isoformas destes genes e quantificar a expressão das mesmas durante o desenvolvimento das gramíneas; gerar conhecimento para experimento futuro de engenharia genética visando a redução da expressão dos genes responsáveis pela síntese da lignina em gramíneas. Para tanto, as gramíneas serão colhidas com 30, 60 ou 90 dias de crescimento e o RNA total será utilizado em reações de amplificação rápida de terminais livres de cDNA (RACE) utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores específicos definidos com base em seqüências de P. maximum já disponíveis em bancos de dados. Após a amplificação, o produto de nested-PCR será inserido em células competentes e seqüenciado. A existência de isoformas dos genes será verificada através da visualização de bandas de tamanhos diferentes e também por hibridização do RNA com sondas específicas (northern blot

Forragens formam a base da nutrição de ruminantes, e a digestibilidade da parede celular é o principal fator limitante de seu valor nutritivo. A identificação de um parâmetro de avaliação da qualidade da fibra que efetivamente tenha impacto sobre o desempenho animal é de grande importância para os programas de melhoramento genético de cana de açúcar. Objetiva-se com este estudo avaliar o efeito do consumo de silagens de cana-de-açúcar feitas com genótipos de alta ou baixa digestibilidade da FDN do colmo, por novilhos em crescimento, sobre os seguintes parâmetros: 1) consumo de matéria seca; 2) ganho de peso e variação da condição corporal, 3) taxa de digestão e passagem ruminal da FDN; 4) parâmetros de fermentação ruminal e 5) quantificação de bactérias ruminais celulolíticas e amilolíticas. Serão utilizados quarenta e oito novilhos da raça Nelore com aproximadamente 350 kg, sendo que vinte novilhos serão fistulados para colocação de cânulas ruminais. As dietas experimentais serão compostas por 50% ou 70% de concentrado na matéria seca e, como volumoso serão utilizados dois genótipos de cana de açúcar, com alta ou baixa digestibilidade da FDN do colmo, perfazendo quatro dietas experimentais. O delineamento estatístico será o de blocos casualizados com 12 repetições (desempenho) ou 5 repetições (cinética e metabolismo ruminal). A massa total do conteúdo ruminal e volume serão determinados. Amostras serão retiradas de ambas as fases, sólida e líquida, para determinação do tamanho do compartimento ruminal de componentes da digesta. A dieta, sobras e digesta ruminal serão analisados para conteúdo de nutrientes. Serão realizados os cálculos de taxa de passagem do FDN pelo rúmen (kp), taxa de digestão ruminal de FDN (kd) e finalmente, a digestibilidade ruminal aparente do FDN. A determinação do volume líquido e da taxa de passagem de líquidos pelo rúmen será realizada por polietilenoglicol de peso molecular 4.000.

A raça Nelore (Bos taurus indicus) compõe a base da pecuária de corte brasileira. O Nelore é bem adaptado às condições tropicais, mas apresenta lenta maturação sexual, o que limita a taxa de desfrute do rebanho. O mecanismo fisiológico regulando a obtenção da puberdade não é bem entendido, porém diversas linhas de pesquisa apontam a leptina como principal limitante da maturidade sexual em novilhas mal alimentadas. Recentemente foi demonstrado por nosso laboratório que novilhas precoces apresentam maior expressão de leptina pelo tecido adiposo e menor expressão de genes hipotalâmicos que codificam receptores ao neuropeptídeo-Y. O objetivo com este trabalho é identificar genes hipotalâmicos cuja expressão é alterada tanto pela leptina quanto pela maior densidade energética na dieta, visando à elucidação do mecanismo de controle da puberdade. Trinta e duas novilhas zebuínas não púberes, e com idade entre 18 e 20 meses, serão divididas em quatro grupos experimentais: baixa energia (BAIXO), alta energia (ALTO), baixa energia com administração de leptina recombinante bovina (BAIXO+LEP), e alta energia com administração de leptina recombinante bovina (ALTO+LEP). Após 40 dias de tratamento experimental, vinte e quatro novilhas serão selecionadas, abatidas e o hipotálamo será coletado. O estado de maturidade sexual das novilhas será monitorado por ultra-sonografia e pela concentração plasmática de progesterona. A proposta atual se limita à extração do hipotálamo e estudo da expressão gênica, uma vez que o confinamento das novilhas, a administração da leptina e a determinação da puberdade serão realizados em projeto já financiado (FAPESP 2006/03016-1). O efeito da nutrição e da administração da leptina sobre o perfil da expressão de genes hipotalâmicos será determinado utilizando-se microarranjos de DNA desenvolvidos por um consórcio de universidades norte americanas, contendo 16.846 oligonucleotídeos para estudos em bovinos (http://www.bovineoligo.org/). Os resultados de exp

A pecuária de corte no Brasil é baseada no uso de pastagens, porém dispõe de poucas forrageiras de alta produção, com boa distribuição de forragem ao longo do ano, e adaptadas às diversas condições ecológicas do país. Na busca por novas forrageiras, a Embrapa Gado de Corte importou a coleção internacional de Panicum maximum representativa da variabilidade natural da espécie e que inclui acessos apomíticos e plantas sexuais que permitem o melhoramento genético. Este projeto visa desenvolver por meio do melhoramento genético e seleção, genótipos de P. maximum que atendam às diversas demandas das cadeias produtivas de carne bovina e ovina. O projeto é composto por cinco planos de ação, sendo um de gerência. No segundo, são reunidas as atividades de pré-melhoramento que incluem caracterização citogenética, morfológica e molecular (via marcadores microsatélites) e prospecção de genes responsáveis pela lignificação. As atividades de melhoramento (criação de combinações genotípicas superiores) estão no plano 3 e incluem a seleção de genitores femininos, criação de híbridos, e desenvolvimento de progênies da cv. Tanzânia. No plano 4 estão as atividades de avaliação genotípica e incluem a seleção de genótipos quanto a resistência a estresses bióticos e abióticos, ensaio de adubação e uma rede de avaliação de híbridos em quatro locais. No plano 5 estão os ensaios sob pastejo bovino e ovino. Por este projeto, espera-se a indicação de lançamento comercial de dois genótipos, e assim contribuir com a diversificação das pastagens e aumento da produtividade animal em áreas tropicais do Brasil.

A raça Nelore (Bos indicus) é bem adaptada às condições tropicais, mas apresenta lenta maturação sexual, o que limita a taxa de desfrute do rebanho. O mecanismo fisiológico regulando a obtenção da puberdade não é bem entendido, porém diversas linhas de pesquisa apontam a leptina como principal limitante da maturidade sexual em novilhas mal alimentadas. O presente trabalho tem como objetivo testar a hipótese de que a elevação da concentração plasmática da leptina pela aplicação de leptina exógena, ou pelo aumento no consumo diário de energia, é capaz de induzir o início da puberdade em fêmeas Nelores. Trinta e duas novilhas zebuínas não púberes, e com idade entre 18 e 20 meses, serão divididas em quatro grupos experimentais: baixa energia (BAIXO), alta energia (ALTO), baixa energia com administração de leptina recombinante ovina (BAIXO+LEP) e alta energia com administração de leptina recombinante ovina (ALTO+LEP). As novilhas serão confinadas em piquetes até a confirmação da primeira ovulação. As novilhas receberão injeções subcutâneas de leptina recombinante ovina, ou de solução salina, durante 40 dias. O estado de maturidade sexual das novilhas será monitorado por ultra-sonografia e pela concentração plasmática de progesterona. Amostras de plasma serão coletadas durante o experimento para determinação da concentração plasmática de progesterona e de leptina. Espera-se que a injeção crônica com leptina sinalize ao hipotálamo das novilhas subalimentadas que existe um suprimento adequado de energia, promovendo o avanço da puberdade. A elucidação do mecanismo regulando a precocidade sexual de fêmeas zebuínas é imprescindível para o desenvolvimento de um protocolo terapêutico de indução da puberdade, ou em programas de seleção genética mais eficazes visando a obtenção de linhagens de bovinos zebuínos mais precoces na obtenção da maturidade sexual.

Plantas forrageiras formam a base da nutrição de animais ruminantes, sendo a digestibilidade da parede celular o fator limitante de seu valor nutritivo. Assim, a digestibilidade da parede celular deveria ser o alvo de programas de melhoramento de plantas forrageiras. Entre as plantas anuais, a silagem de milho é o alimento mais utilizado na alimentação de gado de leite e de corte. Existe grande variação genética na digestibilidade da porção fibrosa de plantas de milho, sendo que a digestibilidade in vivo da fibra em detergente neutro pode variar de 32 a 60%. A lignificação da parede celular tem sido apontada como o principal impedimento à fermentação microbiana de fibras pelo rúmen. Vários estudos detectaram correlações negativas entre teor de lignina e digestibilidade da parede celular da porção fibrosa da planta de milho. Entretanto, outras características, como composição da lignina e associação da lignina com a parede celular também influenciam a digestibilidade da fibra. Em geral, a produção de matéria seca e o teor de amido da planta de milho aumentam até atingir a maturidade fisiológica. Ao mesmo tempo, o teor de açúcares da porção fibrosa diminui e a lignificação aumenta com a maturação. Estes processos antagônicos levam a uma mudança permanente na composição dos carboidratos na matéria seca total. A dinâmica destas mudanças diferem entre os genótipos do milho. Sendo assim, o momento de colheita exerce grande influência no valor nutritivo de diferentes variedades de milho. Uma avaliação separada da contribuição da porção fibrosa e dos grãos de milho para a digestibilidade total da planta é necessária para solucionar o problema de interações confundidas com maturidade e ponto de colheita; que prejudicam a precisão de experimentos de melhoramento genético. O objetivo deste trabalho é a identificação e clonagem de genes candidatos que afetam a qualidade da forragem de plantas de milho, através de técnicas de hibridização subtrativa e análise da expressão.

Várias estratégias vêm sendo desenvolvidas para otimizar a composição da parede celular de plantas para melhorar o seu uso agro-industrial. Com relação ao uso de forragens na alimentação animal, a lignificação da parede celular que ocorre com o avanço da maturidade é o grande limitante à produtividade. Devido a importância das pastagens para a produção de ruminantes no Brasil, a pecuária nacional se beneficiaria enormemente de um aumento na digestibilidade da parede celular de forragens tropicais. No entanto, não existe nenhum estudo publicado envolvendo a alteração da síntese de lignina em forrageiras tropicais. Várias plantas de clima temperado, como tabaco, arabidopsis, alfafa e milho já sofreram alterações na expressão de enzimas envolvidas com a síntese de precursores da lignina (monolignóis) que resultou em menores teores de lignina e maior digestibilidade ruminal. O objetivo deste trabalho é gerar uma base de informação visando o entendimento dos genes envolvidos com a síntese de lignina e com a ligação da lignina com os carboidratos da parede celular, reduzindo sua digestibilidade. Especificamente, objetivamos clonar e seqüenciar as principais enzimas envolvidas com a via metabólica da síntese da lignina em três espécies de forrageiras tropicais: Brachiaria brizantha, Panicum maximum e Cynodon dactylon. Além disso, objetivamos caracterizar a expressão gênicas destas enzimas durante o desenvolvimento da planta. A correlação entre a expressão gênica, lignificação, composição da lignina e digestibilidade ruminal permitirá identificar os pontos da via de lignificação com maior potencial de impacto à digestibilidade ruminal, que possam servir como alvo de estudos futuros visando a manipulação do processo de lignificação em forrageiras tropicais.

Estudar a expressão da leptina no tecido adiposo de novilhas Nelore em crescimento

Resumo

Resumo

Resumo

Resumo

Resumo

Resumo

Resumo