Luis Felipe Santos Mendes.

Approximately 30 of all human-encoded proteins are sorted and transported through the Endoplasmic Reticulum and Golgi complex. Despite the constant exchange of components within these organelles, their structures remain stable and elastic. However, the process through which these compartments are constructed and spatially organized to regulate protein secretion remains unclear. Additionally, the molecular mechanisms that determine how certain secretory cargo is packed, stored, and released have yet to be fully understood. Recently, the formation of biomolecular condensates and functional amyloids has emerged as a common strategy for cells to organize their internal space. The condensation of intracellular biomolecules into "solid"-like and "liquid"-like phases has significant implications beyond its dysregulation in neurodegenerative disorders. Protein self-association serves various roles in vivo, including forming liquid-like phases in biomolecular condensates, such as the nucleolus and P-granules, and the amyloid-like formation of biofilms and hyphae. However, studying functional condensates remains in its early stages and necessitates further research. The main goal of this proposal is to create a new research group in the state of São Paulo focused on intrinsically disordered proteins (IDPs) and protein condensates. Establishing this research line will contribute to expanding knowledge in this area and fostering regional scientific development. Specifically, in this project, we aim to investigate the (un)structural biology of protein/peptide self-association to assess the impact of "liquid" and "solid" protein condensates on two parallel hypotheses related to the secretory pathway. The first hypothesis posits that liquid crystal-like phases formed by Golgi-matrix proteins could organize membrane compartments, resulting in the Golgi functioning as a "liquid-crystal" with a phase-separated internal organization. The second hypothesis suggests that the storage and release of stress-associated neuropeptides using Golgi-derived secretory granules may involve the dynamic assembly and disassembly of functional amyloids without requiring specialized cellular machinery. As a result, their aggregation in secretory granules and subsequent release into the extracellular space would rely solely on the varying physical chemistry properties experienced throughout the secretory pathway. Our findings can potentially impact and reshape one of the most extensively studied cell biology processesthe classical eukaryotic exocytic pathwayand broaden our understanding of the overall significance of protein condensates.

As células eucarióticas possuem um complexo e altamente regulado sistema de secreção capaz de lidar com até 30% de seu proteoma. Uma subfamília das proteínas da matriz Golgi conhecidas como Golgi Reassembly and Stacking Proteins (GRASP), que são atores essenciais na via não convencional de secreção induzida por estresse (UPS), também se mostrou fundamental para a dinâmica do Golgi durante a mitose/apoptose e a formação das fitas do Golgi. As GRASPs possuem uma tendência in vitro de formar uma fase condensada com um carácter sólido em condições de estresse, conhecido como estado amiloide. A tendência de formação de amiloides funcionais também é observada in vivo em condições que desencadeiam a UPS e a resposta ao choque térmico (HSR). Portanto, a plasticidade estrutural das GRASPs e a sua capacidade de formar arranjos complexos parece ser uma nova peça de informação que precisa de ser contabilizada ao descrever os seus muitos papéis celulares. A formação do condensado precisa de ser totalmente reversível para que as células regressem às suas condições nativas depois de as condições de estresse forem removidas. No entanto, o mecanismo de dissociação das fibras funcionais de GRASP permanece desconhecido. Uma vez que as proteínas em condições fisiológicas estão próximas dos limites de supersaturação nas suas concentrações celulares típicas, os condensados de GRASP podem também desempenhar um papel importante na organização do Golgi em condições nativas, uma hipótese ainda inexplorada. Esta proposta pretende explorar a dinâmica da agregação/desagregação de GRASP sob condições relevantes de estresse celular e as suas variações morfológicas utilizando técnicas de alta resolução (Cryo-EM e RMN). A associação dos condensados funcionais de GRASP com as membranas será também explorada para mapear o envolvimento de GRASPs tanto em condições de estresse celular quanto em condições normais.

Toda e qualquer célula viva evoluiu de forma a possuir um eficiente sistema de secreção de biomoléculas que vise atender as suas necessidades biológicas basais e o modo como essa interage com os sistemas externos. Neste sentido, células eucariotas diferem enormemente das procariotas, possuindo um extenso sistema de biomembranas na parte intracelular onde diferentes compartimentalizações com funções específicas estão presentes e que necessitam de constantes trocas de moléculas entre si. Proteínas destinadas aos meio extracelular ou à membrana plasmática são inicialmente sintetizadas no reticulo endoplasmático (RE) e então direcionadas para o complexo de Golgi, onde são empacotadas e transportadas ao seu destino final. Embora seja um alvo de intensos estudos desde a sua descoberta, essa via (clássica) de secreção ainda possui diversos pontos que carecem de elucidação, em especial como as proteínas são selecionadas no RE e transportadas para o Golgi e como esta última organela consegue eficientemente capturar e reter uma dada carga de transporte. Uma família de proteínas de membrana, conhecida como p24, é sugerida como peça essencial nesse processo de captura de proteínas no RE e seu direcionamento para o Golgi, além de um envolvimento no processo de sequestro pelo Golgi de vesículas secretórias vindas do RE, onde atuaria em conjunto com uma outra proteína conhecida como Golgi Reassembly and Stacking Protein (GRASP). No presente projeto, pretendemos obter informações chaves sobre o mecanismo de atuação das p24 em humanos, seu possível processo de retenção no Golgi e o seu envolvimento na expressão membranar de receptores proteicos com atuação em respostas pró-inflamatórias.

Projeto certificado pelo(a) coordenador(a) Antonio Jose da Costa Filho em 08/06/2016.

Descrição: Extending our recent new crystallographic structural models, ESR DEER and MD for PepTSo, a peptide transporter, (Fowler et al., (2015) Structure), we now aim to define mechanistically, the reaction coordinates for two membrane-embedded peptide transporters from the bacteria Shewanella oniedensis (PepTSo) and from Streptococcus thermophilus (PepTSt), with homology to human transporters (~45% and 35% respectively). In an ambitious 4-year programme of crystallography, spectroscopy and functional assays, underpinned with MD and simulation, the conformational changes and equilibria associated with discernable intermediates in the transporter pathway(s), as well as the lipid modulation of the various forms for these transporters, will be resolved. The influence of the proton motive force (pmf) in sealed systems, and the nature of the ligand binding environment, will also be examined, giving new information about direct electrogenic coupling to conformational excursions that drives function in this important drug facilitator. To do this we will: - direct the design of spectroscopic studies of membrane-embedded peptide transporters guided by currently available, as well as new, crystal structure and MD generated models; - use the spectroscopic and functional information under an applied pmf, to determine conformational and dynamic details of membrane-embedded transporters; with a final goal of describing the molecular mechanism of action, lipid dependence and conformations of reaction intermediate states and the kinetics of equilibria between them, of peptide (of relevance to homologues) transporters. For membrane embedded peptide transporters, this is novel.

Projeto certificado pelo(a) coordenador(a) Antonio Jose da Costa Filho

A incidência de infecções fúngicas de alta letalidade tem aumentado sobremaneira nos últimos anos, tornando-as um sério problema de saúde pública, principalmente quando envolve pacientes imunocomprometidos. A falta de tratamentos específicos com alta eficiência e baixos efeitos colaterais agrava a situação e faz da busca pelo entendimento dos mecanismos de ação de fungos um tópico de grande interesse. O fungo Cryptococcus neoformans é uma das espécies mais comuns no Brasil e aparenta ser a única espécie patogênica do gênero Cryptococcus. A virulência desse patógeno está relacionada à capsula externa formada por diversas biomoléculas produzidas no espaço intracelular e que aparentemente atingem o espaço extracelular através de mecanismos não convencionais de secreção. Apesar de ainda pouco entendidos, uma característica comum a esses mecanismos é dependência da proteína chamada Golgi Re- Assembly and Stacking Proteins (GRASPs). GRASPs têm sido implicadas em uma série de funções tanto em mecanismos de secreção não-convencional quanto de estruturação e organização do aparato de Golgi. Entretanto, seu exato papel em cada situação ainda carece de resultados estruturais e funcionais em nível molecular. É neste contexto que este trabalho se insere: produzir dados que possibilitem a correlação estrutura-função na GRASP de C. neoformans (CnGRASP). Para isso, utilizaremos uma série de técnicas experimentais em Biofísica Molecular que vão desde a determinação da estrutura CnGRASP por difração de raios X (até o atual momento apenas o domínio GRASP do ortólogo humano GRASP55 foi elucidado) até o estudo da sua interação com ligantes naturais, como o GXM, e com modelos de membrana biológica através de espectroscopias como a ressonância magnética eletrônica (RME).