Julio Cesar Borges.

ACORDO DE COOPERAÇÃO INTERNACIONAL - USP/TORONTO - CANADÁ
The goal of this project is to facilitate a collaborative effort by two groups, one (WAH) at the University of Toronto and the other (JCB) at USP aimed at the structural and functional characterization of the R2TP complex and determining the basis of its interaction with Hsp90 molecular chaperone. The R2TP-Hsp90 complex plays critical roles in the assembly of essential multiprotein complexes. The complex consists of the highly conserved Rvb1 and Rvb2 helicases and of the Hsp90 cofactors, Tah1 and Pih1. Although studies of the R2TP-Hsp90 complex in different biological processes have advanced our understanding of the cellular roles of the complex, much remains to be learned about the molecular basis of its activity. R2TP-Hsp90 complex was found to be required for the proper maturation of box C/D small nucleolar ribonucleoprotein particles (snoRNPs). Subsequently, R2TP-Hsp90 was identified as assembly factor for phosphatidylinositol-3 kinase-related protein kinase (PIKK) signalling complexes, telomerase reverse transcriptase (TERT) complex, and RNA polymerase II (RNAP II). Furthermore, many studies have revealed that a large range of carcinomas exhibit increased expression of Rvb1 and Rvb2 proteins such as hepatocellular, colorectal, lung, renal, breast, and leukemia. Importantly, it has been demonstrated that decreasing the expression of Rvb1 or Rvb2 results in reduced tumor cell growth and increased apoptosis in vitro and in xenograft experiments in mice. Indeed, several groups and companies, including our groups, are interested in identifying inhibitors for Rvb1 and Rvb2 for use as potential anticancers. The PI in Canada identified the R2TP-Hsp90 complex, while the PI in Brazil has experience in the conformational characterization of Hsps. Thus, the relationship between the PIs developed out of the natural convergence of their independent research programs and the proposed collaborative studies will directly benefit the research program and the research capacity of both groups.

a Hsp70 mitocondrial (mtHsp70) está envolvida com a importação de proteínas mitocondriais produzidas no citoplasma e com o posterior enovelamento destas proteínas importadas. Portanto, a mtHsp70 é essencial para a biogênese mitocondrial. Em mamíferos, a mtHsp70 recebe o nome de mortalina devido ao seu envolvimento em processos de apoptose e senescência. Existe um grande interesse no estudo da mortalina uma vez que ela está superexpressa em células tumorais, sendo alvo para inibição farmacológica, além de participar da manutenção de várias doenças causadas pelo envelhecimento, como mal de Parkinson e Alzheimer. Por estes motivos o estudo das características funcionais e estruturais das mtHsp70, além da interação com outras chaperonas moleculares, pode ser uma alternativa para o melhor entendimento de seu envolvimento nessas doenças e também para uma melhor compreensão da maquinaria bioquímica onde esta proteína esta inserida. Apesar de ser conhecida há bastante tempo, a mortalina humana não pode ser obtida por técnicas de expressão heteróloga devido a um processo de autoagregação que resulta na sua produção heteróloga de forma insolúvel e/ou agregada. Recentemente, foi descrita uma nova co-chaperona das mtHsp70 que atua auxiliando o seu enovelamento correto. Esta proteína mitocondrial é denominada de Hep1 (Hsp70-escort protein 1) e permite a obtenção das mtHsp70 de forma solúvel. Um dos objetivos deste projeto está a coexpressão da mortalina e Hep1 humana (hHep1) de forma a permitir a produção da mortalina solúvel, bem como a caracterização estrutural da mortalina e seu complexo com a hHep1. Também são objetivos deste projeto a caracterização da ortóloga Hep1 de Leishmania braziliensis</i> (LbHep1) que mostrou atividade em manter a mortalina humana e de mtHsp70 de L. braziliensis</i> (LbmtHsp70) nas suas formas solúveis. A partir deste estudo, é esperado (1) compreender o mecanismo funcional da Hep1 na interação com a mortalina e inferir outras possíveis funções para esta proteína. Com a obtenção da mortalina de forma solúvel, também é esperado (2) obter informações funcionais e estruturais desta proteína que permitam compará-la à Hsp70 citoplasmática de humanos. Também é esperado (3) caracterizar a interação da mortalina com os seus fatores de troca de nucleotídeos de origem mitocondrial, as hGrpE#1 e hGrpe#2. Na vertente em protozoários, (4) objetiva-se estudar em mais detalhes o mecanismo de interação da LbHep1 com a LbmtHsp70, assim como (5) o funcionamento da LbmtHsp70 comparando-a à mortalina humana.

A interação proteína-ligante ou proteína-proteína é um dos principais eventos para a regulação e para a atividade proteica, sendo responsável pela inibição ou ativação enzimática; por mudanças conformacionais nas proteínas para a sinalização celular; transporte e armazenamento de substâncias; etc. Poucas técnicas experimentais permitem estudar estes tipos de interações em solução fornecendo um amplo espectro de informações termodinâmicas como a calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Esta técnica usa o calor, uma sonda universal, para derivar informações como estequiometria da interação, entalpia da interação, constante de afinidade (e variação da energia livre) e entropia da interação. Além destas informações, experimentos de ITC em diferentes temperaturas permitem obter a variação da capacidade calorífica da interação. Estas informações em conjunto fornecem uma ?assinatura termodinâmica? da interação que pode auxiliar na compreensão do mecanismo de interação envolvido em nível molecular, principalmente com o auxílio de informações estruturais obtidas por outras técnicas. O entendimento molecular de uma interação proteína-ligante ou proteína-proteína pode auxiliar na compreensão do mecanismo de regulação proteica e também pode contribuir para o desenho racional de novos fármacos. A ITC também permite monitorar o fluxo de uma reação enzimática produzindo informações como constante de Michaelis-Menten, constante de catálise e constante de inibição quando realizada na presença de inibidores. Desta forma, o objetivo deste projeto é aplicar a ITC para obter informações termodinâmicas da interação proteína-ligante ou proteína-proteína para correlacionar estas informações com dados estruturais em baixa e alta resolução de várias proteínas em estudo no grupo de BMB/IQSC/USP. As pesquisas no grupo BMB abrangem 4 linhas principais envolvendo chaperonas moleculares das famílias Hsp90 e Hsp70 (e suas co-chaperonas) de humano e de protozoários e também de uma enzima metabol

A chaperona Hsp90 (heat shock protein 90 kDa) é encontrada em todos os organismos e em todos os compartimentos celulares, sendo que as duas formas encontradas no citossol de eucariotos interagem com pelo menos 10% de todas as proteínas produzidas pela célula. A Hsp90 tem papel fundamental na maturação destas proteínas, o que a torna uma proteína importante para diversos processos celulares tais quais sinalização, proteostase, epigenética, manutenção do telômero, imunidade inata e outros. Obviamente, alterações neste ?nó altamente conectado?, como pode-se rotular a Hsp90, leva a perturbações no funcionamento celular acarretando em drásticas consequências para o organismo. Por exemplo, a Hsp90 parece ter papel central na patologia de diversos tipos de câncer pois muitas das quinases que são clientes desta chaperona estão envolvidas com o desenvolvimento desta doença e inclusive inibidores específicos da Hsp90 já vêem sendo investigados em testes clínicos. Nenhuma Hsp90 citossólica humana teve sua estrutura tridimensional completa determinada e os mecanismos pelos quais as funções desta chaperona são moduladas também não são ainda inteiramente conhecidos, mesmo que se saiba que proteínas co-chaperonas e modificações pós-traducionais parecem exercer papel fundamental nestes processos. Pelo óbvio potencial terapêutico que tanto a Hsp90 humana quanto a Hsp90 de outros organismos possuem, torna-se imprescindível desvendar os mecanismos pelos quais a estrutura desta chaperona é estabilizada e como ocorre a modulação da maturação de suas proteínas clientes. Estes objetivos comuns aglutinaram pesquisadores envolvidos com o estudo da relação entre estrutura e função de proteínas, particularmente de chaperonas humanas, de plantas e de protozoários, em torno dos seguintes propósitos: 1) Determinar os aspectos conformacionais da Hsp90, de seus domínios isolados e de algumas de suas co-chaperonas. 2) Caracterizar a atividade ATPásica dos vários tipos de Hsp90 disponíveis. 3) Inves

Projeto Especial - Projeto 1 - Pró-Reitoria de Pesquisa USP

As chaperones moleculares são proteínas que auxiliam o enovelamento de proteínas e previnem a sua agregação, entre outras importantes funções intracelulares. Entre as várias famílias de chaperones, as Hsp70 funcionam como um pivô recebendo e distribuindo substratos de/para outras chaperones moleculares, como as Hsp90. Este sistema multi-chaperone está envolvido na transdução do sinal intracelular, na estabilização de receptores hormonais corticóides e de proteínas quinases. As Hsp90 e Hsp70 são essenciais para a viabilidade celular, pois sua inativação leva à supressão do crescimento de organismos, inclusive de parasitas do filo apicomplexa. Inibidores das Hsp90 (geldanamicina e radicicol) inibem o crescimento de Plasmodium falciparum</i>, Leishmania donovani</i> e Trypanosoma cruzi</i>. O objetivo deste projeto é obter proteínas dos sistemas chaperones Hsp70 e Hsp90 de Plasmodium falciparum</i> e Leishmania braziliensis</i>, parasitas da malária e leishmaniose, respectivamente, e caracterizar a relação estrutura-função destes sistemas. A intenção é determinar os fatores estruturais, termodinâmicos e funcionais, assim como as mudanças conformacionais induzidas por ligantes, que são importantes para o ciclo funcional destes sistemas chaperones. O efeito dos inibidores das Hsp90 na sua estrutura e na sua função também será caracterizado a fim de determinar as bases moleculares da inibição e a viabilidade de seu emprego contra parasitoses.

Projeto Especial 1 - Pró-Reitoria de Pesquisa

Determinar a relação estrutura-função de proteínas por técnicas de baixa resolução, como dicroísmo circular, fluorescência, ultracentrifugação analítica, calorimetria e espalhamento de raios X a baixos ângulos.

O projeto objetivou aplicar técnicas de biologia molecular para clonar cDNAs, expressar e purificar proteínas que formam o sistema chaperone molecular Hsp70 de origem humana. A intenção foi caracterizar a relação estrutura-função deste sistema utilizando técnicas bioquímicas, espectroscópicas, termodinâmicas e estruturais.

Some newly synthesized proteins require the assistance of molecular chaperones for their folding. Chaperones are also involved in the dissolution of protein aggregates. Hence, the study of molecular chaperones has biotechnology and medical importance. We intend to search the SUCEST data bank in order to identify and annotate the genes of stress related proteins, mainly chaperones and Hsps.