Roberto Kopke Salinas.

O objetivo deste projeto é recuperar e modernizar a infraestrutura de análises em Ressonância Magnética Nuclear em solução da Central Analítica (CA) do IQ-USP. Para isso propomos atualizar a eletrônica dos instrumentos para prolongar a sua vida útil, e prevenir a interrupção do serviço e das pesquisas devido à indisponibilidade de peças para manutenção. A atualização também é necessária para incorporar novas tecnologias e aumentar a sensibilidade dos instrumentos, assim como o escopo de sua aplicação. As mudanças propostas deverão também aumentar a automação e o desempenho dos instrumentos, o que é essencial no caso de instrumentos multiusuários.

O Centro Analítico de Instrumentação da Universidade de São Paulo ou Central Analítica (CA) é um laboratório multiusuário de apoio às pesquisas realizadas no IQ-USP. A CA é uma seção do IQ-USP, e obedece ao Conselho Técnico Administrativo (CTA) do IQ. Fundada em 1986, a CA administra hoje um conjunto de 37 equipamentos de grande e médio porte. Além de administrar e disponibilizar os instrumentos, a CA também presta serviços de análises aos pesquisadores do IQ, de outras universidades do país e de empresas. A lista de clientes que já utilizaram os serviços da CA conta com 1940 pesquisadores de fora do IQ-USP e 1046 empresas. O impacto da CA no desenvolvimento das pesquisas do IQ pode ser mensurado pelo número de artigos publicados pela pós-graduação nos anos 2017 - 2023. De 2017 até o hoje, o programa de Pós-Graduação em Química resultou em 1535 publicações enquanto o de Bioquímica resultou em 1016 publicações, uma média de 425 publicações por ano. A maior parte dessas publicações se beneficiou de dados obtidos nos instrumentos da CA. A CA possui três plataformas muito importantes: análise elementar (CHN), termogravimetria (TGA) e espectrometria de massas (MS). Estas plataformas possuem altíssima demanda, realizando em geral 400 - 500 solicitações de análise por ano para docentes do IQ, pesquisadores de outras universidades e empresas. É importante notar que cada solicitação de análise pode envolver várias amostras, e cada amostra pode envolver múltiplas corridas. No caso do CHN, por exemplo, foram analisadas aproximadamente 20000 amostras nos últimos dois anos, sendo que diariamente são realizadas até 60 corridas neste instrumento. Embora uma quantidade enorme de pesquisas tenha se beneficiado dessas plataformas no passado recente, hoje os instrumentos de espectrometria de massas, análise elementar e TGA estão quebrados ou apresentam frequentes paradas para manutenção. Essa situação vem prejudicando significativamente o andamento das pesquisas que dependem dessas técnicas. Diante desta situação, esta proposta visa a recuperar e modernizar as três plataformas. Para isso propomos a aquisição de um novo espectrômetro de massas Exploris120, de um novo equipamento de análise elementar FlashSmart-CHN e um novo TGA para a Central Analítica do IQ-USP.

Uma fração significativa do proteoma de vários organismos corresponde a polipeptídeos que não formam uma estrutura tridimensional definida. Um polipeptídeo totalmente desordenado é conhecido como uma proteína intrinsecamente desordenada (IDP), e um segmento de uma proteína que não possui uma estrutura tridimensional estável é chamado de região intrinsecamente desordenada (IDR). É cada vez mais reconhecido que os IDRs não são simplesmente segmentos desordenados passivos que conectam domínios bem dobrados, mas eles próprios exibem funções biológicas, como reconhecimento molecular ou cadeias entrópicas. IDPs e IDRs participam de uma ampla gama de processos celulares relevantes, como vias de transdução de sinal, metabolismo de RNA e empacotamento de DNA. No entanto, a falta de uma estrutura nativa rígida leva a desafios conceituais e metodológicos significativos na caracterização da estrutura ou conjunto estrutural de IDPs e IDRs. Proteínas desordenadas povoam um conjunto diversificado de conformações com excepcional heterogeneidade espaço-temporal e extraordinária flexibilidade conformacional. Por esta razão, a elucidação dos mecanismos funcionais de IDPs e IDRs pressupõe uma descrição completa de sua dinâmica estrutural. Neste contexto, propomos dissecar o relevo de energia potencial de uma série de IDPs e IDRs biologicamente relevantes através de uma abordagem iterativa que combina novos algoritmos computacionais e técnicas experimentais estabelecidas, como espalhamento de raios-X em solução de baixo ângulo (SAXS), dicroísmo circular de radiação síncrotron (SRCD) e espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) multidimensional heteronuclear. A componente computacional desta proposta é baseada em dois métodos (e os códigos-fonte abertos associados) desenvolvidos pelos nossos grupos. O Energy Landscape Visualization Method (ELViM) foi concebido como um método de escalonamento multidimensional para descrever ensembles de enovelamento de proteínas com grande potencial para investigação de mecanismos moleculares. Como o método não depende de coordenadas de reação ou estruturas de referência nativas, é adequado para abordar IDPs e IDRs. Em contraste, o método de Avaliação de Superfície Via Grid Assessment (SuAVE) leva em consideração o efeito da curvatura no cálculo das propriedades estruturais das interfaces químicas, independentemente da composição química, simetria e nível de rugosidade do átomo. A pesquisa proposta contribuirá para melhor descrever o conjunto estrutural de moléculas que não possuem estrutura rígida e que apresentam amplas distribuições conformacionais. Com isso, a equipe de pesquisa trabalhará conjuntamente para decifrar como a plasticidade modula a função biológica de proteínas relevantes do ponto de vista biológico e médico, permitindo inferir o papel da plasticidade (dinâmica) da proteína nos mecanismos que desencadeiam doenças como Parkinson, diabetes Melittus, entre outras. O projeto também contribuirá para a formação de pessoas qualificadas nas áreas de biofísica computacional e biologia estrutural integrada, com ênfase em RMN, SRCD e SAXS.

O CEPID B3 é uma rede com pólos de pesquisa sediados em São Paulo (IQ-USP, ICB-USP), Campinas (IB-UNICAMP, IAC), Ribeirão Preto (FCFRP-USP, FMRP-USP) e Rio Claro (UNESP) que colaborará na realização de pesquisas básicas de ponta sobre os mecanismos moleculares de importância primordial para a reprodução bacteriana, o comportamento multicelular, a competição, a colonização e as interações de bactérias com seus hospedeiros eucarióticos e bacteriófagos. Os conhecimentos adquiridos serão utilizados na busca e desenvolvimento de novos inibidores químicos e biológicos do crescimento bacteriano.

Trocadores de Na+/Ca2+ (NCX) são proteínas da membrana plasmática que utilizam o gradiente eletroquímico do Na+ para remover Ca2+ do citosol. Eles são essenciais para a manutenção da homeostase de Ca2+ intracelular em diferentes tipos de células, particularmente em células excitáveis. CALX, o trocador de Na+/Ca2+ de Drosophila melanogaster, é encontrado em células sensoriais. Além de transportar Na+ e Ca2+, os trocadores NCX são regulados por estes íons. A regulação alostérica do CALX por Ca2+ é singular, uma vez que este trocador é inibido ao invés de ser ativado pela ligação de Ca2+ ao domínio sensor intracelular. O objetivo desta proposta é investigar a estrutura do CALX, e o mecanismo de regulação alostérica deste trocador. Como se trata de uma proteína de membrana, que combina domínios globulares com segmentos intrinsecamente desordenados, a abordagem utilizada será o estudo de fragmentos do trocador produzidos de forma recombinante. Nós vamos utilizar espectroscopia de RMN em solução como técnica principal. Os objetivos específicos são: i) estudar a estrutura e a funcionalidade do NCX da archaea Methanococcus janaschii (NCX-Mj) isolado na presença de detergentes; ii) investigar em detalhes atômicos o mecanismo de regulação alostérica do CALX por Ca2+ intracelular. Para atingir o último objetivo vamos estudar fragmentos do CALX por uma combinação de medidas de RMN em solução e calorimetria (ITC). Além disso vamos investigar a funcionalidade do CALX in célula utilizando medidas de imageamento de Ca2+.

O instrumento de RMN de 300 MHz da Bruker pertencente ao Centro Analítico de Instrumentação da USP (CAIUSP) apresentou um curto-circuito e a consequente a queima de diversas peças de hardware relacionadas à aquisição de dados e confecção de pulsos de radiofrequência. Seu conserto envolve a troca de quatro placas eletrônicas, e foi avaliado em aproximadamente R$ 200.000,00 conforme laudo e orçamento anexos. Este instrumento tem sido essencial para o desenvolvimento de pesquisas relacionadas ao estudo estrutural de moléculas pequenas de origem natural ou sintética, ao estudo de materiais poliméricos, sistemas modelo de membrana, entre outros, beneficiando diversos projetos de pesquisa apoiados pela FAPESP, alguns dos quais estão elencados nesta proposta. Além de atender às necessidades da pesquisa acadêmica em todo o território nacional, o instrumento realiza anualmente muitas análises para a indústria. A fim de que o CAIUSP possa continuar a disponibilizar este instrumento para a comunidade científica nacional, e para a indústria, é essencial que ele seja reparado. Isso é ainda mais importante, considerando-se as condições instáveis dos outros equipamentos de RMN do mesmo porte que apresentam idade avançada na faixa de 30 anos

O objetivo desta proposta é aproveitar a visita do Dr. Adrien Favier ao "4th French-Brazilian Symposium on Biosciences", que sera realizado entre 6 e 7 de novembro de 2018 no Rio de Janeiro, para traze-lo para visitar a Universidade de São Paulo. Adrien é engenheiro de pesquisa especialista em Ressonância Magnética Nuclear (RMN) do CNRS (Centre Nacional de la Recherche Scientifique), associado ao grupo de RMN do Institut de Biologie Structurale (IBS) em Grenoble. Com doutorado em física pela Universidade Joseph Fourier, e pós-doutorado em RMN de proteínas pelo Departamento de RMN da Universidade de Utrecht, Adrien é especialista no desenvolvimento de métodos de RMN multidimensional aplicados ao estudo estrutural de proteínas em solução. Adrien participou do desenvolvimento de métodos BEST-TROSY, cujo objetivo é acelerar e aumentar a sensibilidade de detecção de experimentos multidimensionais aplicados ao estudo estrutural de proteínas (Favier e Brutscher (2011) JBNMR 49:9-15). Adrien desenvolveu um pacote computacional para a implementação semi-automática das sequências de pulsos utilizadas no IBS em outros instrumentos (NMRlib - http://www.ibs.fr/research/scientific-output/software/pulse-sequence-tools). Este pacote conta com mais de 200 usuários em mais de 100 laboratorios acadêmicos em diferentes países, particularmente na Europa e Estados Unidos. Durante sua visita ao Instituto de Química, Adrien deverá proferir uma palestra sobre BEST-TROSY para alunos e pesquisadores interessados em RMN de proteínas, e implementar estas técnicas em nosso instrumento. Este último objetivo é importante pois entre os nossos alvos de estudo encontram-se proteínas de elevado peso molecular (> 30 kDa), que são difíceis de serem estudadas pelos métodos tradicionais

O objetivo deste projeto de pesquisa é dar continuidade a estudos estruturais e mecanísticos acerca do trocador de Na+/Ca2+ (NCX) utilizando para isso Ressonância Magnética Nuclear (RMN) em solução. O NCX é um dos principais mecanismos de extrusão de Ca2+ intracelular em células cardíacas. Além de transportar Na+ e Ca2+, o NCX também é regulado por estes íons. O NCX é uma proteína grande, com cerca de 950 amino ácidos que formam um grande domínio transmembranar, domínios citosólicos e regiões desordenadas. Este caráter multifacetado faz com que a caracterização estrutural do NCX seja uma tarefa difícil. Além disso, o mecanismo de regulação alostérica por Ca2+ e Na+ permanece desconhecido. Com base em estudos de RMN dos domínios solúveis do NCX de Drosophila melanogaster, CALX, propusemos um modelo para o mecanismo de regulação alosterica do NCX e do CALX (Abiko et al., 2016). Esta proposta pretende dar continuidade a estes estudos, testar diferentes aspectos deste modelo, e iniciar a caracterização estrutural das porções transmembranares. Além disso, pretende-se estudar a proteína do envelope do vírus Zika. Esta proteína desempenha papel essencial no mecanismo de reconhecimento das células infectadas e no processo de fusão de membranas, permitindo a entrada do vírus na célula. Espera-se que estes estudos contribuam para a compreensão da biologia e da patogenicidade deste vírus, e desta forma contribuam também para o desenvolvimento de drogas antivirais no futuro.

O objetivo deste projeto de pesquisa é dar continuidade a estudos estruturais e mecanísticos acerca do trocador de Na+/Ca2+ (NCX) utilizando para isso Ressonância Magnética Nuclear (RMN) em solução. O NCX é um dos principais mecanismos de extrusão de Ca2+ intracelular em células cardíacas. Além de transportar Na+ e Ca2+, o NCX também é regulado por estes íons. O NCX é uma proteína grande, com cerca de 950 amino ácidos que formam um grande domínio transmembranar, domínios citosólicos e regiões desordenadas. Este caráter multifacetado faz com que a caracterização estrutural do NCX seja uma tarefa difícil. Com base em estudos de RMN dos domínios solúveis do NCX de Drosophila melanogaster, CALX, propusemos um modelo para o mecanismo de regulação alosterica do NCX e do CALX (Abiko et al. (2016) Proteins. doi:10.1002/prot.25003). Esta proposta pretende dar continuidade a estes estudos, e iniciar a caracterização estrutural das porções transmembranares necessária para testar diferentes aspectos do modelo. Além disso, pretende-se estudar proteínas do vírus da Zika que desempenham papel essencial nos mecanismos de entrada e replicação do vírus nas células. As proteínas de interesse são a glicoproteína do envelope (E), a proteína NS1 que interage com o sistema imune, e NS2B-NS3pro, a protease do vírus. Se houver tempo, pretende-se utilizar técnicas de transferência de saturação (STD) para testar diferentes ligantes que possam funcionar como inibidores de entrada do vírus ou replicação. Espera-se que estes estudos contribuam para uma maior compreensão da biologia e patogenicidade deste vírus, e para o desenvolvimento de drogas antivirais de amplo espectro no futuro.

Trocadores de Na+/Ca2+ (NCX) utilizam o gradiente eletroquímico do Na+ para promover o transporte de Ca2+ para fora da célula. Além de transportar Na+ e Ca2+, os NCX também são regulados por estes íons. Assim, a ligação de Ca2+ aos domínios citoplasmáticos CBD1 (calcium-binding domain 1) e CBD2 (calcium-binding domain 2) ativa o transporte através da membrana. O trocador de Drosophila melanogaster, CALX, possui comportamento anômalo pois é inibido pela ligação de Ca2+ em CBD1; no CALX, o domínio CBD2 não liga Ca2+. O objetivo desta proposta de pesquisa é investigar do ponto de vista estrutural o mecanismo pelo qual a ligação de Ca2+ em CBD1 inibe a atividade do CALX. Para isto, pretende-se utilizar Ressonância Magnética Nuclear (RMN) em solução para estudar a estrutura e a dinâmica de construções contendo os dois domínios, CBD1 e CBD2, na ausência e presença de Ca2+. Até este momento não há informações estruturais detalhadas ou de dinâmica sobre os domínios transmembranares de um trocador de Na+/Ca2+ eucariótico. Pretende-se desenvolver um protocolo para expressão e purificação de construções que correspondem aos dois domínios transmembranares do CALX e às regiões XIP e r-loop. Espera-se obter amostras enriquecidas com 15N e adquirir espectros de correlação 1H-15N para avaliar a adequação das construções para estudos de RMN em solução.

Neste projeto pretendemos empregar métodos de Biologia Estrutural (cristalografia, RMN, SAXS, simulações moleculares), produzir e caracterizar nocautes gênicos, estudar a enzimologia e a expressão gênica de sistemas relacionados ao metabolismo do segundo mensageiro c-di-GMP, e ao Sistema de Secreção do Tipo IV de Xanthomonas citri. Este projeto temático é de autoria do Prof. Shaker Chuck Farah (IQ-USP). Eu participo do projeto oficialmente com Pesquisador Principal, sendo responsável, principalmente, pelos estudos de RMN.

O Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) possui a missão de agregar profissionais das áreas da física, química, biologia, imunologia, medicina, odontologia e matemática em torno de problemas que requeiram abordagem multidisciplinar. As atividades de pesquisa centram-se em torno de cristais líquidos, colóides magnéticos, e fluídos de interesse biológico, em particular lipoproteínas. 
A minha participação neste projeto é como membro colaborador. Eu contribuo trazendo experiência em espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Técnicas de RMN são especialmente poderosas para a caracterização da interação entre proteínas e membranas biológicas do ponto de vista conformacional e de dinâmica.

Este projeto de Jovem Pesquisador da FAPESP envolve o uso de técnicas modernas de RMN aplicadas à solução de estruturas de macromoléculas biológicas e ao estudo de interações entre elas. Também envolve o uso de estratégias computacionais, em especial docking e dinâmica molecular, como ferramentas complementares aos estudos experimentais. Entre os sistemas em interesse estão proteínas relacionadas à patogenicidade de Xanthomonas citri e a tropomiosina de músculo esquelético. Com relação a Xanthomonas a idéia é compreender ao nível molecular e atômico como funcionam os processos que podem levar à patogenicidade. A escassez de grupos no país empregando RMN para estudar a estrutura de biomoléculas em solução justifica o apoio à criação deste Centro Emergente em RMN de Biomoléculas.