Enilza Maria Espreafico.

O melanoma é uma das neoplasias mais agressivas e resistentes a terapias. Apesar dos avanços obtidos pelo desenvolvimento de terapias alvo, como inibidores de BRAF e de MEK, e imunoterapias, como anti-CTLA4 e anti-PD1, que resultaram no aumento da sobrevida de pacientes com melanoma maligno, cerca de 50 destes desenvolvem resistência aos tratamentos. A plasticidade fenotípica característica do melanoma, que recapitula mudanças fenotípicas que ocorrem durante a diferenciação de melanócitos a partir de células tronco da crista neural, contribui significativamente com a heterogeneidade tumoral e está correlacionada com pior sobrevida do paciente. A reativação de vias do desenvolvimento embrionário contribui com a adaptação a ambientes hostis, facilitando a progressão do melanoma, a disseminação metastática e a resistência terapêutica. Células de melanoma com programas transcricionais distintos foram descritas tanto em culturas celulares quanto em amostras de melanoma, inclusive em um mesmo tumor. As condições do microambiente tumoral, assim como as terapias, são capazes de modificar o estado fenotípico das células de melanoma, resultando na emergência de diferentes subpopulações celulares, incluindo células tolerantes ao tratamento e células dormentes. Análises de amostras de melanoma primário e metastático do mesmo paciente foram incapazes de identificar mutações causadoras (driver) de metástase, apontando o papel de mecanismos epigenéticos no controle da mudança de fenótipos. Mudanças importantes na estrutura da cromatina associadas a alterações epigenéticas, como metilação do DNA e modificações de histonas, e regulação por RNAs não codificantes, permitem mudanças rápidas e reversíveis na expressão gênica e são observadas na mudança de fenótipos do melanoma. Entre estes mecanismos, os RNAs longos não codificantes (lncRNAs) têm mostrado um papel central em circuitos epigenéticos que controlam processos biológicos complexos, como programas de desenvolvimento. Seus diversos mecanismos de ação incluem o direcionamento de enzimas modificadoras da cromatina a promotores específicos, formação de plataformas para recrutamento de complexos ribonucleoprotéicos, remoção de proteínas de sítios transcricionais, sequestro de miRNAs, ação como precursores de miRNAs, bloqueio de enhancers para a formação de alças de cromatina e impedimento da tradução de mRNAs, tornando os lncRNAs candidatos a reguladores efetivos da mudança dinâmica de estados transcricionais, sendo portanto alvos terapêuticos atrativos. Apesar do número crescente de estudos revelando estados transcricionais que definem subpopulações de células de melanoma de diferentes fenótipos, o conhecimento acerca das bases moleculares desta plasticidade ainda é escasso. A identificação de vulnerabilidades de células de melanoma de diferentes estados fenotípicos e, em especial, de reguladores da plasticidade fenotípica pode propiciar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas capazes de evitar o aparecimento de subpopulações resistentes. Uma vez que estados de desenvolvimento estão associados a resposta a terapias, uma estratégia possível, suportada por nossos resultados preliminares, seria alvejar lncRNAs que controlam estados celulares, sensibilizando células de melanoma a terapias como terapias alvo e imunoterapias. A presente proposta visa, através de uma abordagem multidisciplinar e colaborativa empregando metodologias para análise molecular e celular no estado da arte, preencher lacunas importantes no conhecimento acerca do papel de lncRNAs na plasticidade fenotípica, reprogramação metabólica, resistência terapêutica e disseminação metastática que possam contribuir com o desenvolvimento de novas e mais efetivas estratégias terapêuticas para o tratamento do melanoma e redução da mortalidade associada à doença.

RNAs longos não codificantes (lncRNAs) constituem uma grande e diversificada classe de RNAs funcionais. Identificamos o lncRNA RMEL3 como um transcrito enriquecido em melanoma, particularmente naqueles portadores da mutação BRAFV600E e com fenótipo marcantemente invasivo. Os dados indicam que o RMEL3 funciona como um regulador positivo das vias de MAPK e PI3K e negativo de proteínas inibitórias do ciclo celular, estimulando o crescimento do melanoma e protegendo células não transformadas da parada de proliferação e da morte celular causadas por privação de fatores de crescimento e mitógenos. Com o objetivo de caracterizar seu mecanismo de ação, analisamos a interação do transcrito endógeno com proteínas. Dentre as candidatas identificadas, estão proteínas envolvidas diretamente na via MAPK (ARAF, FAM83D) e na via supressora de tumor de Hippo (STK3/Mst2), entre outras, envolvidas no reparo do DNA, regulação transcricional, apoptose, citoesqueleto, tradução de mRNA e metabolismo energético. Combinações de dados de ChIP-seq e RNAseq de uma grande variedade de tecidos revelam numerosos elementos regulatórios próximos e ao longo do gene e sugerem uma alta complexidade de isoformas de transcritos. Análise desses dados consolida a noção de que a isoforma canônica (RMEL3_201) é altamente restrita a melanoma, mas a isoforma alternativa RMEL3_202 e, possivelmente, variadas outras isoformas minoritárias sejam expressas em diversos tecidos, tais como, gônadas, células embrionárias, endoteliais, adiposas e neurais. As duas isoformas anotadas e uma circular (hsa_circ_0142225) são expressas em melanoma e respondem de modo diverso ao tratamento com um inibidor de BRAFV600E. Portanto, dando continuidade a estudos prévios do nosso laboratório, propomos os seguintes objetivos para este projeto: i) identificar e caracterizar funcionalmente os transcritos completos do gene RMEL3 expressos em diferentes contextos fisiológicos, patológicos e farmacológicos e investigar os mecanismos repressivos e ativadores responsáveis pelo padrão específico de expressão de cada isoforma; ii) validar as interações do transcrito RMEL3 com as proteínas candidatas identificadas previamente e analisar seu impacto nas vias de sinalização de MAPK, PI3K e Hippo em melanoma; iii) interferir na expressão de isoformas do gene RMEL3 e realizar análises fenotípicas e de complementação funcional, in vitro e in vivo. Com este estudo, buscamos contribuir para uma anotação acurada do gene RMEL3 e elucidação dos mecanismos pelos quais as principais isoformas de transcritos exercem suas atividades funcionais.

Os genes RMELs, primeiramente descritos pelo nosso grupo em 2010, são potenciais lncRNAs com expressão restrita a melanoma. Alta expressão dos RMELs 2, 3 e 4 (HCCAT5) se associa à BRAFV600E, a principal mutação condutora de tumorigênese em melanoma. Pesquisas em andamento em nosso laboratório indicam que o gene RMEL3 é um alvo das vias de MAPK e PI3K e o transcrito, por sua vez, parece fazer parte de um circuito de retroalimentação positiva dessas vias. Abordagens usando silenciamento e superexpressão indicaram que os quatro lncRNAs, objetos desse estudo, de maneiras e intensidades diferentes, promovem sobrevivência e proliferação de células de melanoma. Análises integradas de genômica e proteômica mostram que o silenciamento dos RMELs em células de melanoma afeta vias centrais relacionadas a proliferação/sobrevivência e resistência terapêutica aos inibidores de BRAF/MEK e imunoterapia. RMEL2 (OVAAL) é superexpresso em um menor número de casos de melanoma e linhagens celulares do que os outros RMELs e, embora o silenciamento de RMEL2 não afete a proliferação em condições normais de adesão, leva a uma redução significativa na capacidade de crescimento independente de ancoragem e mostra indícios de uma relação com resistência do melanoma ao tratamento com terapias alvo-dirigidas (BRAFi/MEKi). O RMEL1 apresenta correlação positiva de expressão com MITF e o programa de diferenciação melanocítica e o RMEL4 parece correlacionar-se com uma assinatura molecular de tumores não responsivos à imunoterapia, sendo que seu silenciamento inverte a assinatura em direção à responsiva. Encorajados por esses resultados, propomos aqui caracterizar esses lncRNAs quanto à estrutura, isoformas, interações moleculares, localização subcelular, capacidade de codificar polipeptídeos e bifuncionalidade. Interações com microRNAs e proteínas serão investigadas através de ensaios usando Luciferase como repórter e pulldown, respectivamente. Estudos funcionais utilizando metodologias de superexpressão e silenciamento (ou knockout por CRISPr) serão conduzidos in vitro e em modelo de tumorigênese em camundongos, visando explorar as funções desses lncRNAs e aplicabilidade em diferentes contextos biológicos e combinações de terapias alvo-dirigidas ou imunoterapia.

Miosina-Va e DLCs como alvos para terapia anti-tumoral mediada por shRNA e peptídeos apoptogênicos.

Auxílio Pró-equipamento CAPES - "Aquisição de equipamentos para suprimento de infra-estrutura básica de pesquisa" - Vigência: 2008. Processo: Aux. proequipamentos 1736/2007. Coordenadora do Auxílio. Total concedido: R$ 43.919,00.

O câncer é uma doença que resulta do acúmulo de alterações genéticas ou epigenéticas somáticas, que culminam na proliferação descontrolada de um clone celular de um tecido previamente sadio, que adquire a capacidade de disseminar-se no organismo levando a danos frequentemente fatais. Constitui-se na segunda maior causa de morte por doença no Brasil (em torno de 12% ao ano), perdendo apenas para as doenças cardio-vasculares. Os tratamentos inespecíficos, tais como a radioterapia e quimioterapia, que se aplicam ainda à maioria dos tipos de câncer não condizem com o conhecimento acumulado sobre os processos moleculares e o genoma humano recém desvelado. Portanto, há grande expectativa de que investimentos direcionados à pesquisa nessa área venham a revolucionar o tratamento do câncer no decorrer dos próximos 10 a 20 anos. Com o investimento proposto aqui temos como meta a identificação e teste de novos alvos moleculares para a terapia e diagnose do câncer com especial ênfase em melanoma, mas estendendo a aplicação das ferramentas geradas por nós para estudo de dois outros grupos de câncer: o carcinoma de mama e os carcinomas epidermóide bucal e de glândula salivar. O projeto proposto está embasado em resultados da pesquisa em desenvolvimento em nosso laboratório: i) A demonstração de que um fragmento da miosina-Va atua como forte indutor de apoptose em linhagem de melanoma metastática; ii) A geração de Bibliotecas Subtrativas e Microarrays de cDNA ORESTES que nos permitiram identificar múltiplos genes com expressão marcantemente diferencial entre linhagens de melanoma de diferentes estágios da progressão tumoral; iii) O teste de compostos liberadores de Óxido Nítrico (NO) sobre linhagens de melanoma vêm indicando que seu efeito tende a ser de estimulador da sobrevivência ou proliferação celular em linhagem metastática e indutor de apoptose em linhagem não metastática. Propomos nesse projeto darmos continuidade aos estudos em progresso buscando o desenvolvimento de nov

São reconhecidos atualmente três subtipos de Síndrome de Griscelli (SG), causados por mutações nos genes MYO5a (SG-1), RAB27a (SG-2) e MLPH (SG-3), respectivamente. Enquanto a SG3 restringe-se à hipopigmentação da pele e pêlos, a SG-1 está associada a desordens neurológicas primárias graves e a SG-2 a defeitos imunológicos com ativação linfocitária e macrofágica descontrolada, levando à morte na infância. O presente projeto tem como objetivos identificar as mutações em pacientes brasileiros; realizar estudos de expressão gênica em escala genômica e a caracterização funcional das mutações em linfócitos T citotóxicos ou outros tipos celulares obtidos dos pacientes, buscando compreender melhor as funções das proteínas MVa/Rab27a. Temos ainda o objetivo de estabelecer condições para restauração da função citotóxica pela introdução do gene RAB27a ou mesmo da proteína purificada em linfócitos mutantes, em continuidade a estudos prévios de nosso laboratório. O modelo animal de camundongos mutantes será utilizado para complementar os estudos propostos.

CNPq-Edital Universal 019/2004. Caracterização de novos genes e do peptídeo pró-apoptótico MVaf em melanoma - em busca de alvo terapêutico.

Efeitos do complexo nitrosilo de rutênio (trans-[RuC1[15]aneN4]NO)2+ sobre mecanismos de vasodilatação ativados pela liberação de óxido nítrico.