Leonardo Resstel Barbosa Moraes.

Resumo em Português	O desenvolvimento deste projeto tem como objetivo investigar o papel do estresse agudo e dos receptores mineralocorticoides e glicocorticoides presentes no córtex pré-frontal ventromedial (CPFvm) no processo de extinção de memória aversiva. Para responder à pergunta de pesquisa, ratos Wistar serão submetidos à cirurgia estereotáxica implantação de cânulas-guia nas regiões pré-límbica (PL) ou infralímbica (IL) do CPFvm. Após 4 dias de recuperação da cirurgia, um grupo de animais será submetido a uma única sessão de estresse por restrição (ER), por um período de 1 h, em tubos de inox ventilados (grupo estressado), enquanto outro grupo de animais permanecerá no Biotério sem estímulo (grupo não estressado), e este será considerado o dia 1 do procedimento de comportamental. Após 24h do procedimento de ER, ambos os grupos serão submetidos a uma segunda cirurgia: para implante de uma sonda rádio-telemétrica na aorta abdominal, a fim de monitorar as suas respostas autonômicas (pressão arterial e frequência cardíaca); ou canulação da aorta abdominal, para inserção de um cateter de polietileno na aorta abdominal, e sua posterior exteriorização no dorso do animal, de modo que possam ser coletadas amostras de sangue do mesmo animal, durante diferentes etapas do procedimento comportamental, para análise dos níveis de corticosterona. No 7º dia, e já após a recuperação dos animais do segundo processo cirúrgico, dar-se-á início ao paradigma de medo condicionado ao contexto (MCC), ao qual ambos os grupos, estressados e não estressados, serão expostos. Primeiramente os animais passarão pela sessão de condicionamento, e transcorridos duas horas serão treinados na tarefa de medo condicionamento ao contexto: 120 min de habituação seguido se 4 estímulos elétricos de 0,85 mA/1s em intervalos randômicos, e 120 min sem estímulos antes de remoção dos animais da caixa. Após 24 h os animais serão expostos ao mesmo aparato, na ausência do estímulo elétrico, durante 20 min para a sessão de extinção da memória condicionada contextual. E 24h após a sessão de extinção, para retenção da memória de extinção (sessão de teste) os animais serão novamente expostos à caixa de condicionamento, durante 5 min, na ausência de estímulo elétrico. Nas sessões de condicionamento, extinção e teste será mensurada a resposta emocional condicionada do animal (REC): Freezing (imobilidade total do animal, exceto os movimentos respiratórios), pressão arterial média, frequência cardíaca, e temperatura cutânea da cauda (esta última medida manualmente com auxílio de uma câmera térmica). Os compostos farmacológicos (antagonista dos receptores mineralocorticoide, RU 23318; ou antagonista dos receptores glicocorticoide, RU 486) e o veículo (solução salina 0.9 %+DMSO 1%, onde serão diluídos os fármacos) serão administrados aos animais através de microinjeção na região PL ou IL do CPFvm, imediatamente após a sessão de extinção. Deste modo, nossa hipótese é que o estresse agudo seja capaz de produzir um déficit na aprendizagem da extinção da memória aversiva associada ao medo condicionado através de alterações na expressão e ativação dos receptores para glicocorticoides no CPFvm, bem como modificações morfológicas nesta estrutura encefálica.

A necessidade do desenvolvimento de novos alvos terapêuticos para o tratamento de transtornos neuropsiquiátricos é consenso na literatura científica. Endocanabinoides (eCBs) e óxido nítrico (NO) têm sido propostos como dois destes possíveis alvos, e trabalhos do nosso grupo vem mostrando o potencial terapêutico de drogas que atuam sobre estes neurotransmissores atípicos em transtornos de ansiedade, depressão, psicoses, comportamento agressivo, Parkinson e neurodegeneração. O canabidiol (CBD), um fitocanabinoide não psicotomimético que, entre outros efeitos, pode aumentar as concentrações do endocanabinoide anandamida, já está em fase de testes clínicos para o uso em vários desses transtornos. No entanto, muitas questões importantes ainda permanecem abertas, tanto em termos de emprego em alguns transtornos específicos como, principalmente, em relação aos mecanismos envolvidos e se há interação entre eCBs e NO. Os estudos dos últimos anos abriram novas possibilidades, como a participação de mecanismos neuroinflamatórios e a facilitação da neurogênese e autofagia pelo CBD. Este projeto pretende dar continuidade a esta linha de pesquisa, procurando investigar 1. Qual contribuição relativa dos mecanismos da ação anti-inflamatória envolvida nos possíveis efeitos terapêuticas das abordagens farmacológicas descritas (CBD, inibidores da via do NO, modificadores do sistema eCB)?; 2. Quais outros transtornos neuropsiquiátricos que poderiam se beneficiar destas abordagens?; 3. Em casos de comorbidades, como por exemplo, a síndrome metabólica e transtornos ansiedade em que o componente inflamatório está presente, seriam essas novas abordagens terapêuticas relevantes?; 4. Quais outras vias intracelulares seriam responsáveis pelos efeitos destes compostos?; 5. Qual seria a participação específica dos endocanabinoides nas modulação de respostas recompensadoras e aversivas?; 6. Quais mecanismos epigenéticos estariam envolvidos nos efeitos induzidos por esses compostos?

Por quase um século o estudo dos mecanismos neurais e bioquímicos que tangem os diferentes processos da aprendizagem utilizam o condicionamento Pavloviano aversivo, o qual consiste na associação de um estímulo neutro (ex: som ou contexto) com um estímulo não-condicionado (ex: choque nas patas). Recentemente tem se observado um crescente interesse nos mecanismos envolvendo os processos de reconsolidação e extinção da memória aversiva, uma vez que terapias para o tratamento de desordens de ansiedade se baseiam nesses processos. Sólidas evidências demonstram que a porção ventral do córtex pré-frontal medial (vCPFM) está envolvida na modulação dos processos que envolvem a aprendizagem e a memória, principalmente nos processos de expressão e extinção da resposta emocional condicionada (REC). Aparentemente existe uma interação entre o glutamato, o óxido nítrico (NO) e os endocanabionóides no vCPFM. Essa interação parece ser importante para a expressão e extinção da REC em vários modelos, entretanto, o estudo dessa interação nas porções pré-límbica (PL) e infra-límbica (IL) do vCPFM nos processos de reconsolidação e extinção da memória contextual aversiva ainda não foram estudados. Para isso serão utilizados ratos Wistar que foram previamente submetidos ao implante de uma sonda de rádio-telemetria para registro da atividade autonômica e cânulas guias nas porções PL ou IL do vCPFM para administração de drogas. Será utilizado um protocolo de condicionamento ao contexto, seguido se sessões de reconsolidação ou extinção da memória aversiva. A administração de drogas que interferem na ação dos endocanabinóides ou na via glutamato-NO serão feitas antes das sessões de reconsolidação ou extinção. Finalmente, no dia do teste serão avaliados os efeitos da manipulação farmacológica sobre os processos de reconsolidação e extinção da memória contextual aversiva.

Nos últimos 15 anos nosso grupo tem contribuído para a elucidação do papel do óxido nítrico (NO) e endocanabinóides (eCBs) em funções e disfunções do sistema nervoso central. Mostramos que a manipulação destes neurotransmissores atípicos modifica respostas comportamentais e autonômicas em modelos animais de ansiedade, depressão, psicoses e transtornos motores. Além disso, também verificamos que um fitocanabinóide, o canabidiol (CBD), que entre outros efeitos pode modificar a neurotransmissão mediada por eCBs, também é capaz de alterar estas respostas tanto em animais de laboratório como em humanos. O objetivo primário do presente projeto, além de dar continuidade a esta linha de pesquisa, abordando questões ainda não respondidas sobre os efeitos comportamentais de canabinóides e NO (por exemplo, locais de ação e efeitos ainda não explorados, presença de possíveis efeitos antiagressivos e antiparkinsonianos do CBD, etc.), é procurar elucidar mecanismos celulares (alterações neuroplásticas e imunológicas) e moleculares (vias de sinalização) responsáveis por estes efeitos. Para isso empregaremos uma abordagem ampla, integrando técnicas comportamentais e de registro autonômico com medidas de expressão gênica, atividade neuronial em grupos específicos, alterações epigenéticas e silenciamento gênico. Como resultado, além de ampliar nosso conhecimento sobre estes sistemas (NO e eCBs) e os mecanismos de ação do CBD, iremos incorporar abordagens metodológicas novas e importantes ao grupo bem como possibilitar a formação de recursos humanos nas áreas de Neurociência e Farmacologia.

O núcleo leito da estria terminal (NLET) parece estar criticamente envolvido na expressão de respostas relacionadas à ansiedade. O NLET é um dos principais alvos de inervação noradrenérgica no sistema nervoso central e algumas evidências sugerem uma ativação desta neurotransmissão em situações aversivas. Estudos prévios do nosso laboratório mostram a participação da neurotransmissão noradrenérgica do NLET na modulação da resposta emocional condicionada (REC), através da ativação dos receptores ±1 e ²1-adrenérgicos. Além disso, estudos anteriores mostram que a ativação de receptores ²1-adrenérgicos aumenta a liberação de glutamato dependente de receptores CRF1 no NLET. De fato, há evidências para o envolvimento do NLET nas respostas de estresse mediadas pelo CRF e que os efeitos ansiogênicos do CRF no NLET são mediadas por receptores CRF1. Logo, a modulação da REC pelo sistema noradrenérgico poderia envolver a participação de outros neurotransmissores, entretanto, esta possibilidade não foi testada no NLET para o medo condicionado ao contexto (MCC). Assim sendo, acreditamos que o sistema noradrenérgico interage com outros mediadores presentes no NLET na modulação da resposta emocional condicionada contextual. Para testar essa hipótese, realizaremos a manipulação farmacológica de receptores CRF1, receptores glutamatérgicos e do sistema nitrérgico.

O hipocampo dorsal (HD) é uma estrutura do sistema límbico que está envolvida em processos emocionais, de memória e aprendizado. Além disso, essa estrutura também exerce influência sobre a atividade autonômica.
Durante situações aversivas pode se observar tanto respostas autonômicas (aumento da pressão arterial, freqüência cardíaca e alterações da temperatura) quanto comportamentais. O HD está envolvido com diversas alterações associadas a reações defensivas e apresenta conexões com diversas estruturas que modulam essas respostas, fazendo parte de uma via responsável por modular as respostas associadas a situações aversivas. 
Em particular o HD esta envolvido com a modulação das respostas autonômicas observadas durante o medo condicionado ao contexto (MCC). Além disso, durante a exposição de ratos ao modelo do estresse por restrição (ER) ocorre um aumento da atividade dos neurônios do HD. Finalmente, é possível observar uma elevação nos níveis de glutamato no HD durante o MCC e durante ER.
A ativação de receptores glutamatérgicos do tipo NMDA aumenta a atividade da isoforma neuronial da síntese de óxido nítrico (nNOS). Além disso, essa interação, NMDA/ óxido nítrico (NO), no HD parece ser importante nas reações defensivas. Finalmente, tem sido descrito que o sistema endocanabinoide presente no HD tem envolvimento com a modulação de respostas defensivas através de receptores CB1 e pode modular a liberação local de glutamato.
Considerando que a ativação de receptores NMDA pelo glutamato é a principal via de ativação da nNOS, e conseqüente produção de NO, e que a ativação de receptores CB1 modula a liberação de glutamato no SNC, o presente projeto tem como objetivo testar a hipótese de que o sistema glutamatérgico presente no HD, atuando via receptores NMDA, e dependente da formação de NO, e sofrendo modulação de receptores CB1, modularia as respostas comportamentais e autonômicas geradas pelo MCC e o ER. Para tanto, investigaremos os efeitos da administração no H

O funcionamento anormal do CPFM tem sido associado a diversas psicopatologias incluindo o transtorno de estresse pós-traumático e transtornos de ansiedade. Além disso, o CPFM modula respostas aversivas em ratos submetidos a modelos animais sensíveis a drogas ansiolíticas. A porção ventral do CPFM (vCPFM) é responsável pela influência do CPFM sobre a atividade autonômica e comportamental observadas durante reações de defesa. Estudo explorando o bloqueio não seletivo da neurotransmissão no vCPFM resultou em respostas do tipo ansiolíticas quando testado no modelo do lamber punido de Vogel (LPV), um dos modelos de ansiedade mais utilizados. No entanto, nenhum estudo até o momento investigou quais neurotransmissores no vCPFM podem estar envolvidos com essas respostas neste modelo.
Dentre os neurotransmissores presentes no vCPFM o glutamato é descrito como tendo uma função importante tanto em respostas autonômicas como comportamentais associadas com situações aversivas. Além disso, essa função do sistema glutamatérgico esta diretamente relacionada com o sistema nitrérgico via ativação da isoforma neuronial da enzima que sintetiza o óxido nítrico (nNOS). Finalmente, tem sido descrito que o sistema endocanabinoide presente no vCPFM tem envolvimento com a modulação de respostas defensivas através de receptores CB1 e pode modular a liberação local de glutamato. 
Considerando que a ativação de receptores NMDA pelo glutamato é a principal via de ativação da nNOS e conseqüente produção de NO, e que a ativação de receptores CB1 modula a liberação de glutamato, o presente projeto tem como objetivo testar a hipótese de que o sistema glutamatérgico presente no vCPFM, atuando via receptores NMDA, e dependente da formação de NO, modularia as respostas comportamentais e autonômicas geradas pelo modelo do LPV. Além disso, testar se a manipulação do sistema endocanabinoide no vCPFM poderia mimetizar os efeitos observados com o NO. Para tanto, investigaremos os efeitos da administração

The medial prefrontal cortex (MPFC) is a limbic structure involved with both autonomic and behavior responses associated with defensive reactions. The MPFC is particularly involved with anxiety-behavior in rats. It is the ventral portion of MPFC (vMPFC) which is responsible by its influence on the aversive responses modulation. Data using local neurotransmission unselective inhibition of vMPFC showed anxiolytic-like effect in the Vogel conflict test. However, there are no results about which vMPFC- neurotransmitters are involved with this aversive behavior evoked by Vogel model.
Among the neurotransmitters present in the vMPFC, glutamate has been described to have an important role on autonomic and behavior modulation during defensive reactions. Moreover, this modulation by glutamate is associated to nitric oxide (NO) through nitric oxide syntheses activation. Finally, the endocannabinoid system present in the vMPFC has been described to be involved with modulation of anxiety-behavior, possible by glutamate release modulation through pre-synaptic CB1 activation.
Therefore, in the present work the hypothesis to be tested is that interaction between glutamatergic and nitrergic system in vMPFC could be modulating the aversive response observed during Vogel conflict test. Moreover, CB1 receptors present in this cortical area would be modulate this aversive response too. Thus, rats will have microinjected into the vCPFM glutamatergic antagonist, NO synthesis inhibitor and NO scavenger and drugs which interfere with endocannabinoid system and tested in the Vogel conflict test.

A exposição de animais a situações de perigo faz com que seu organismo apresentem reações de defesa a fim de favorecer sua sobrevivência através . Essas reações envolvem alterações autonômicas e comportamentais e visam adaptar o organismo às novas demandas ambientais. Várias estruturas do sistema nervoso central têm sido implicadas no controle de destas alterações. 
O projeto estuda a interação entre os sistemas glutamatérgico e nitrérgico, presentes em estruturas do SNC envolvidas com a resposta de medo, modula as atividades cardiovascular e comportamental, bem como as variações da temperatura e de atividade simpática decorrentes da REC em ratos, observadas no modelo do medo condicionado ao contexto.