Jose Antonio Visintin.

Células-tronco espermatogoniais (SSCs) são as responsáveis por manter a espermatogênese contínua durante a vida de um indivíduo. Estas células podem ser isoladas e transplantadas de modo a colonizar testículos e reconstituir sua funcionalidade. Entretanto, métodos de seleção e marcadores moleculares não isolam exclusivamente as verdadeiras células-tronco do testículo e estudos de caracterização destas células em bovinos são mais escassos que em murinos. Neste projeto, pretende-se testar a hipótese que SOX2, NANOG ou OCT4 são marcadores de SSCs indiferenciadas em bovinos em três experimentos. Primeiro, será verificado qual método é mais eficiente para seleção inicial de espermatogônias. Em seguida, a expressão dos genes mencionados será verificada no parênquima testicular, assim como a co-localização desta proteína com outras já utilizadas para marcação de SSCs. Na sequência, pretende-se identificar genes diferencialmente expressos em populações que expressam ou não um desses marcadores. Em um quarto experimento, pretende-se transplantar células espermatogoniais isoladas por separação magnética para avaliar a formação de colônias. No quinto e último experimento, células espermatogoniais isoladas serão cultivadas in vitro, para avaliar a manutenção do estado de células-tronco. Espera-se com este projeto identificar um marcador de SSC indiferenciadas bovinas, assim como identificar marcadores de membrana que estejam presentes nesta população de células. Desta maneira, espera-se obter uma população celular que seja mais eficiente na colonização testicular após transplante e capazes de se manter em cultivo in vitro. (AU)

Bolsa de produtividade em pesquisa

O objetivo deste estudo será caracterizar as células da granulosa e os fibroblastos fetal e adulto de bovinos da raça Nelore como fontes doadoras de núcleos na reconstrução de embriões. Para tanto, serão utilizados fibroblastos colhidos por biópsia auricular de animais adultos ou explantes de fetos de 60 dias oriundos de matadouro. As células da granulosa e os fibroblastos serão caracterizados por aspectos morfológicos e imunocitoquímicos (Experimento I). As culturas primárias do fibroblastos, tanto fetal quanto adulto, serão caracterizados como positivos para vimentina e negativos para citoqueratina. Para a reconstrução dos embriões serão utilizados oócitos de ovários colhidos em matadouro, maturados in vitro por 16 horas e enucleados pela remoção do primeiro corpúsculo polar (CP) e da região do oolema contendo a placa metafásica. As células da granulosa ou os fibroblastos serão inseridos sob as zonas pelúcidas dos oócitos enucleados e os complexos citoplasma receptor-núcleo doador (CCN) eletrofundidos com 2 pulsos de 4,5KV/cm durante 20 s. Após a eletrofusão, os embriões reconstruídos serão ativados por 1 hora em TCM 199 contendo 10% de soro fetal bovino, 10 g de ciclohexemide por ml e 2,5 g de citocalasina D por ml em estufa a 39 C, 5% de CO2 e alta umidade, sendo em seguida mantidos por mais 4 horas em TCM 199 contendo 10% de soro fetal bovino e 10 g de ciclohexemide por ml. Os embriões reconstruídos e ativados (Experimentos II), assim como os não manipulados (Controle), serão co-cultivados em células da granulosa bovina no meio TCM 199 por 9 dias em estufa a 39 C, 5% de CO2 e alta umidade, por 7 dias até alcançarem o estádio de blastocisto. As células da granulosa, os fibroblastos adulto e fetal, os embriões e os possíveis bezerros serão avaliados quanto ao comprimento do telômero e a atividade da telomerase.

O objetivo deste estudo será avaliar a viabilidade in vitro e in vivo de embriões bovinos reconstruídos com oócitos enucleados em Metáfase II e núcleos de células somáticas (fibroblastos) fetais e adultas. Para tanto, oócitos de ovários colhidos em matadouro serão maturados in vitro por 17 horas e enucleados pela remoção do primeiro corpúsculo polar (CP) e da região do oolema contendo a placa metafásica. Como núcleo doador, serão utilizados fibroblastos de orelha de vaca da raça Nelore e de feto colhido em abatedouro. Para a reconstrução dos embriões, cada célula doadora de núcleo, após indução à G0, será inserida sob a zona pelúcida de cada oócito enucleado e o complexo citoplasma receptor - núcleo doador (CCN) fundido e ativado por eletrofusão (2 pulsos de 4 KV/cm durante 20 s). Após ativação elétrica, cada CCN será incubado em solução de ciclohexemide (10 g/ml) e citocalasina D (2,5 g/ml) por 1 hora e, em seguida, em solução de ciclohexemide (10 g/ml) por mais 4 horas. Os embriões reconstruídos e ativados, assim como os fecundados in vitro (controle), serão co-cultivados em monocamada de células da granulosa e TCM 199 acrescido de 10% de SFB por 7-9 dias. Após o co-cultivo por 7-9 dias, parte dos embriões (controle e reconstruídos) será fixada e corada para determinação do número de células e parte transferida para receptoras.

O objetivo deste estudo será avaliar a viabilidade in vitro e in vivo de embriões bovinos reconstruídos com oócitos enucleados em Metáfase II e núcleos de células somáticas (fibroblastos) fetais e adultas. Para tanto, oócitos de ovários colhidos em matadouro serão maturados in vitro por 17 horas e enucleados pela remoção do primeiro corpúsculo polar (CP) e da região do oolema contendo a placa metafásica. Como núcleo doador, serão utilizados fibroblastos de orelha de vaca da raça Nelore e de feto colhido em abatedouro. Para a reconstrução dos embriões, cada célula doadora de núcleo, após indução à G0, será inserida sob a zona pelúcida de cada oócito enucleado e o complexo citoplasma receptor - núcleo doador (CCN) fundido e ativado por eletrofusão (2 pulsos de 4 KV/cm durante 20 s). Após ativação elétrica, cada CCN será incubado em solução de ciclohexemide (10 g/ml) e citocalasina D (2,5 g/ml) por 1 hora e, em seguida, em solução de ciclohexemide (10 g/ml) por mais 4 horas. Os embriões reconstruídos e ativados, assim como os fecundados in vitro (controle), serão co-cultivados em monocamada de células da granulosa e TCM 199 acrescido de 10% de SFB por 7-9 dias. Após o co-cultivo por 7-9 dias, parte dos embriões (controle e reconstruídos) será fixada e corada para determinação do número de células e parte transferida para receptoras.

FALTA DESCRIÇÃO