Nícolas Carlos Hoch.

A resistência a terapia no câncer é gerada por poucas células que se comportam de forma diferente da maioria das células que são eliminadas pelas terapias tradicionais. Isto significa que para entender mecanismos de resistência é necessário investigar processos em células individuais vivas. Diversas abordagens permitem fazer isto utilizando células que expressam estavelmente proteínas fluorescentes, como indicadores de estados de ativação de vias de sinalização, processos celulares como dano e reparo no DNA, autofagia, apoptose, estresse de retículo, estágio do ciclo celular e senescência entre outros. Os grupos de pesquisa proponentes deste projeto têm experiência em estudar estes processos em células tumorais, em grande parte utilizando média de populações celulares. Resultados anteriores dos nossos grupos indicaram que analisar mais que um processo em células únicas mostrou que relações inferidas por experimentos populacionais não são confirmadas em células individuais e que neste comportamento individual estão inferências biológicas importantes para compreender o processo de resistência. O objetivo geral deste projeto é construir linhagens celulares contendo marcadores fluorescentes de vias de sinalização e processos celulares importantes na sobrevivência de células tumorais à terapia. Estas células serão utilizadas pelos grupos proponentes e demais grupos de pesquisa interessados para estudar processos celulares em diversos tipos tumorais. A estratégia de ação é produzir células que expressem estavelmente os marcadores de interesse utilizando transdução lentiviral e retrotransposons. Combinações de três mar-cações diferentes serão produzidas em linhagens de glioma, câncer de mama, câncer de próstata e melanomas. Será produzido uma combinação de marcações fluorescentes para cada grupo de pesquisa e este grupo irá caracterizar este tipo de marcação. Considerando que a maioria dos quimioterápicos induzem danos ao DNA, os processos celulares estão focados em dano e reparo de DNA e suas consequências sobre a célula como autofagia, senescência, estresse de retículo, estresse mitocondrial e parada no ciclo celular bem co-mo na transição epitélio-mesenquimal. As investigações mecanísticas serão conduzidas por 5 grupos de SP e por 7 grupos do RS. Outros 3 grupos do RS darão apoio na detecção automática das células através de aprendizado de máquina, avaliação estatística dos resultados e modelagem das redes de sinalização que controlam estes processos. A execução deste projeto permitirá a geração de um banco de plasmídeos e células caracterizadas para uso biotecnológico em diagnóstico e desenvolvimento de estratégias terapêuticas. A rede de colaboração já está bem estabelecida entre os grupos do RS e de SP, com diversos artigos publicados em colaboração ao longo de mais de 10 anos. A rede de colaboração do RS envolve na sua maioria colaborações bem estabelecidas além de uma pro-posta de colaboração nova para a modelagem dos dados encontrados em células individuais. A rede paulista envolve grupos estabelecidos com colaborações já em andamento As áreas envolvem principalmente biotecnologia, biologia molecular e celular e medicina, mas estrategicamente incluem também estatística, informática e física para a detecção e análise dos resultados encontrados. O impacto esperado é que estas ferramentas possam ser utilizadas pelos grupos proponentes e outros grupos de pesquisa para entender o funcionamento e integração entre vias de sinalização e processos celulares em células individuais para o estudo de diversos mecanismos, principalmente o de resistência de células tumorais a terapia. Adicionalmente, este projeto permitirá consolidar melhor as interações entre os grupos de pesquisa envolvi-dos, ampliando a qualidade da pesquisa já realizada por estes

A procura por estratégias de tratamento anti-coronavírus está predominante focada em inibidores da polimerase viral ou de uma das proteases virais. No entanto, o macrodomínio contido na proteína não-estrutural 3 (Nsp3) viral é um alvo atraente e subexplorado, uma vez que tem um bolsão catalítico druggable, é necessário para a replicação viral e é parte de um importante mecanismo viral de repressão da resposta interferon do hospedeiro. Estas funções são decorrentes da atividade catalítica deste domínio, que hidrolisa (remove) uma modificação pós-traducional de proteínas mediadas por enzimas que participam da resposta anti-viral do hospedeiro, chamada ADP-ribosilação, e que é o objeto de pesquisa do projeto Jovem Pesquisador vigente ao qual esta solicitação está vinculada. Estabelecemos uma rede de colaboradores nacionais e internacionais no final de março/início de abril de 2020, com o objetivo de identificar inibidores do macrodomínio de SARS-CoV-2, começando por, mas não limitados a, um esforço para reposicionar fármacos já aprovados para uso clínico. Estamos rapidamente implementando um pipeline que envolve triagem virtual de bibliotecas de compostos in silico, seguido de ensaios bioquímicos para determinar inibição da atividade do macrodomínio de SARS-CoV-2 in vitro, co-cristalização de compostos com o domínio viral, ensaios celulares para determinar inibição in vivo do macrodomínio viral ectopicamente expresso em células, além de experimentos em células infectadas com SARS-CoV-2 ou outros coronavírus semelhantes para testar atividade anti-viral. Esta solicitação engloba a coordenação geral deste esforço, além das fases de triagem virtual e de ensaios celulares, e busca, portanto, fomentar um esforço importante na busca por novas estratégias de tratamento farmacológico para COVID-19.

A instabilidade genômica é determinante para o surgimento e progressão do câncer e causa doenças neurodegenerativas e o envelhecimento. A modificação pós-translacional de proteínas com ADP-ribose é central para a resposta celular aos danos ao DNA, mas muitas das enzimas que catalisam sua formação, assim como as hidrolases que a retiram, são insuficientemente caracterizadas. Nós identificamos que as mono-ADP-ribose transferases PARP3 e PARP9 e a ubiquitina ligase DTX3L constituem uma via que protege as células de uma forma de dano ao DNA pouco estudada, induzida pela estabilização de "G4 quadruplex", uma estrutura secundária de DNA. Tanto PARP9 quanto DTX3L frequentemente estão super-expressadas em linfomas difusos de grandes células B (DLBCL) e mutações em histona H4 lisina 91, o sítio-alvo de ubiquitinação por DTX3L, causam uma síndrome genética rara caracterizada por um aumento espontâneo de danos ao DNA e defeitos no desenvolvimento neuronal. O primeiro objetivo desta proposta é a caracterização detalhada desta nova via de reparo de DNA, com vistas a identificar mecanismos moleculares que possibilitem posterior desenvolvimento de alternativas terapêuticas para estas doenças. Em um projeto paralelo, vamos estudar ARH3, outro gene envolvido em uma síndrome genética neurodegenerativa, que codifica uma ADP-ribose hidrolase cujas funções celulares em resposta a danos ao DNA são desconhecidas. Esta proposta combina estudos de mecanismos biológicos fundamentais com genética humana, buscando elucidar a função da ADP-ribosilação de proteínas em reparo de DNA e doenças humanas.

A manutenção da estabilidade genômica é crítica para prevenir as alterações que levam ao desenvolvimento e progressão de câncer. Mutações em vias de reparo de DNA são recorrentes na evolução de diversas neoplasias, pois aumentam a probabilidade de células tumorais adquirirem características novas e mais agressivas. Por outro lado, estes defeitos na capacidade de reparo de DNA vêm sendo explorados para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, já que permitem atacar células cancerosas sem afetar células saudáveis. Os inibidores de PARP, por exemplo, são utilizados na clínica para tratamento dirigido de cânceres de mama e ovário com mutações em genes de uma via de reparo de DNA chamada recombinação homóloga (HR), pois geram uma dependência nesta via para sobrevivência celular. No entanto, diversos mecanismos de resistência a estes agentes vêm sendo descritos, levando à necessidade de desenvolver tratamentos mais eficazes para estes tumores. Nós identificamos que o análogo de timidina clorodeoxiuridina, que é incorporado ao DNA e bem tolerado mesmo em altas doses, drasticamente aumenta a citotoxicidade de inibidores de PARP. Neste projeto buscamos identificar os mecanismos moleculares que levam a este efeito e explorar a possibilidade de utilizar a combinação destes agentes tanto para tratamento mais eficaz de tumores HR-negativos quanto em tumores com outras vulnerabilidades em vias de reparo de DNA.