Carmen Lúcia Cardoso.

Este projeto promoverá o fortalecimento das atividades de difusão realizadas pelo CEIQ, com a produção de podcast sobre a pesquisa realizada pelo grupo de biocromatografia e Produtos Naturais (GCBPN) e seu impacto na sociedade. Além disso, contribuirá com a formação dos estudantes da pós-graduação em Química que poderão realizar atividades de extensão dentro da ORQ e dos subprojetos de difusão desenvolvidos pelo CEIQ,

Um dos desafios na identificação de novos compostos bioativos é o grande número de candidatos, seja de origem natural ou sintética. O uso de técnicas rápidas e eficientes de separação e de triagem na identificação de molécula ativas oriundas de extratos naturais e coleções combinatórias é crescente e estimula o desenvolvimento e aplicação de plataformas integradas de triagem que utilizem métodos on-line e off-line, que facilitem e reduzam o tempo empregado na identificação de moléculas ativas. Nesse contexto a seleção por afinidade e espectrometria de massa (AS-MS) tem alcançado relevância sobre as técnicas convencionais de High-throughput screening (HTS). Essa técnica se baseia nas interações por afinidade entre ligante-alvo biológico, separando os ligantes dos não ligantes. Os ligantes fortes são analisados por MS, reduzindo o número de candidatos a serem testados em ensaios de inibição. Essa estratégia é especialmente interessante para amostras complexas como extratos naturais. A proposta desse projeto é associar os ensaios de afinidade (AS-MS) com os ensaios de triagem da atividade biológica criando uma plataforma de ensaios. Essa plataforma pode ser aplicada a diferentes alvos enzimáticos. Entre os alvos de interesse destacam-se as enzimas colinesterases; Acetilcolinesterase AChE humana (AChEhu) e do percevejo marrom Euschistus heros (AChEhe), buscando inibidores seletivos, a butirilcolinesterase recombinante humana (BChEhu) e as monoaminaoxidases A e B (MAO-A e MAO-B) na busca por inibidores multialvos. Outros alvos podem ser incluídos no decorrer do projeto.

Triagem de ligantes enzimáticos usando plataformas integradas de ensaio

O reconhecimento da necessidade de responsabilidade ambiental e sustentabilidade torna imperativo que profissionais na área de química tenham uma formação consolidada, com fundamentação teórica e práticas atuais nos contextos de Química verde e contribuam com os Objetivos de Desenvolvimento Sustentável (ODS). Dentro da área de Química Orgânica muitas reações fundamentais são realizadas na presença de reagentes e solventes altamente tóxicos, sendo geradora de produtos fundamentais a nossa vida, mas acompanhado de resíduos poluentes. Nesse contexto, a formação de nossos estudantes na vertente sustentável deve incluir o conhecimento e contato com métodos mais sustentáveis, especialmente relacionada à área de síntese de compostos orgânicos.

Com a proposta de desenvolver novos modelos de triagem de ligantes criando uma plataforma integrada, utilizando métodos on-line e off-line, nesse projeto, métodos de triagem por cromatografia de bioafinidade para avaliar a atividade biológica monitorando a modulação da atividade enzimática em ensaios de triagem de alta eficiência e por pesca fishing de ligantes serão desenvolvidos. Em modelos on-line o acoplamento das técnicas de separação cromatográfica com os ensaios biológicos, ou triagem de alta eficiência (high-resolution screening HRS), envolve a inclusão de um ensaio enzimático eficiente ao final dessa separação e assim, detectar a atividade biológica diretamente no eluente do LC além de caracterizar quimicamente o(s) composto(s) biologicamente ativos on-line, reduzindo tempo e trabalho. Em abordagens at-line pode-se ainda incluir o nanofracionamento seguido de ensaios off-line. Em um modelo off-line de estudos de afinidade enzimas imobilizadas sobre partículas magnéticas (MBs) e/ou sepharose, são imersas diretamente na amostra. Moléculas com afinidade ficam retidas e são pescadas para futura identificação estrutural e de atividade biológica. Essas duas abordagens (afinidade e atividade) serão integradas permitindo avanços na busca por substâncias bioativas que poderão ser extrapoladas para qualquer alvo biológico de interesse. Entre os alvos de interesse destacam-se as colinesterases; Acetilcolinesterase (AChE) e Butirilcolinesterase, e a ácido aspártico-protease beta-secretase-1 (BACE1). As monoamina oxidases (MAO) e as serino-proteases denominadas calicreína (KLK), com especial interesse na KLK1, KLK-3, KLK-5, KLK-6 e KLK-8 humanas.

Enzimas imobilizadas na identificação de ligantes: modelos de ensaios e aplicação

A identificação de substâncias com atividade biológica em extratos naturais ou oriundas de coleções sintéticas é uma etapa crucial e complexa e promove um crescente interesse no uso de técnicas rápidas e eficientes de separação e de triagem. Tal paradigma estimula o desenvolvimento de novos métodos de triagem que facilitem e reduzam o tempo empregado na identificação dessas substâncias.Amplamente difundido, o uso de ensaios enzimáticos off-line em solução envolve várias limitações, entre elas a pouca compatibilidade das enzimas com solventes orgânicos. A baixa estabilidade aliada ao alto custo de purificação torna os ensaios on-line utilizando enzimas em solução uma etapa pouco viável para triagem de alta eficiência. Em contrapartida, a realização dos ensaios biológicos on-line, empregando enzimas imobilizadas é uma alternativa valiosa. As enzimas imobilizadas possuem maior estabilidade na presença de solventes orgânicos e variações de temperatura, além de permitir a reutilização e o uso de pequenas quantidades de enzima. Como alternativa o acoplamento das técnicas de separação cromatográfica 2D com os ensaios biológicos, chamados de triagem de alta eficiência é promissora. Dessa forma, é possível detectar a atividade biológica diretamente no eluente do LC e caracterizar quimicamente o(s) composto(s) biologicamente ativos online, resultando em redução do tempo e trabalho despendidos na coleta das frações para posterior detecção de atividadeCom a proposta de desenvolvimento de novos modelos de triagem na identificação de substâncias ativas em coleções naturais e/ou sintéticas utilizando métodos online e enzimas imobilizadas, alvos importantes e protocolos de imobilização foram selecionados, destacando-se as enzimas ciclooxigenases (COX-1 e COX-2) a serem imobilizadas individualmente, as kalikreinas (KLK1- KLK-6 e KLK-8) imobilizadas individualmente mas utilizadas em sistemas online paralelos (metodologia home made), além das enzimas Acetilcolinesterase (AChE) e beta-secretase-1 (BACE1) que serão co-imobilizadas para aplicação em estudos de inibidores dual target.

Triagem de ligantes: uma abordagem on-flow via LC-MS/MS

N do Processo: 465357/2014-8 Edital: Chamada INCT-MCTI/CNPq/CAPES/FAPESP n16/2014.Situação: Em andamento; Natureza: Pesquisa.

Projeto desenvolvido em período de Pesquisador Visitante no exterior, emooregando te´cinas cromatográficas hifenadas e ensaios enzimáticos at-line. Utilização de configuração de sistemas e softwares desenvolvidos pelo grupo de pesquisa anfitrião da Vrije Univestiat Amsterdam com a colaboração do prof. Jeroen Kool.

The Centre of Excellence for Research in Sustainable Chemistry (CERSusChem) is an initiative of researchers at the Chemistry Department of the Federal University of São Carlos aiming to promote the development and implementation of green and sustainable chemistry and related technologies. The Centre is formed by 18 faculty members of 5 different Public Universities (UFSCar, UNICAMP, USP-Ribeirão Preto, UNESP and UFSC), all of them with ongoing projects in the area herein proposed and with well-established national and international research collaborations. The expertise in the area by this team has allowed a continuous work production at the state of the art and justifies the creation of the Centre. The members of the CERSusChem have come together and defined a series of challenges, over-arching goals as long-term directions of research and integrative activities of the Centre. The proposal features novel strategies from across pharma, biotech and academia to meet current challenges in organic synthesis focused in the principles of sustainable chemistry, such as: solvent free approach or bio-solvents, cascade organocatalytic / multicomponent reactions, nanomaterials, biocatalysis, flow chemistry and new models for protein ligand assays. The education and knowledge dissemination action plan encompasses changeling approaches focused in all segment of society. A special attention will be given in producing experimental training focused in qualified industry worker and secondary school teacher. Technology transfer is an integrated part of this proposal and a master goal of this Centre. To meet this aim collaborative work with industrial partner will be pursued in a flexible manner in order to respond to our partners? necessities. Our final goal is the development of a tool box for operating catalytic reactions and assays which will afford practical applications impacting in the way of manufacturing new or well-established products with more environmental and economic returns, addressing social well-being and government legislation regarding environmental approaches.

Triagem de ligantes enzimáticos por métodos 2D-LC-MS/MS: desenvolvimento e aplicação em extratos naturais

Nº do Processo: 465357/2014-8 Edital: Chamada INCT-MCTI/CNPq/CAPES/FAPESP nº16/2014..

Como solução ao paradigma de identificar o maior número de compostos ativos em coleções sintéticas e/ou oriundas de extratos naturais, o desenvolvimento de métodos on-line que incorporem identificação e caracterização tem sido explorado. Nesse contexto, o desenvolvimento de novos ensaios de triagem de ligantes de proteínas tem se destacado na procura de hits. Amplamente difundido, o uso de ensaios enzimáticos off-line em solução envolve várias limitações, entre elas a pouca compatibilidade das enzimas com solventes orgânicos. A baixa estabilidade aliada ao alto custo de purificação torna os ensaios on-line utilizando enzimas em solução uma etapa pouco viável para triagem de alta eficiência. Em contrapartida, a realização dos ensaios biológicos on-line, empregando enzimas imobilizadas é uma alternativa valiosa. Os biorreatores ou IMERs (do inglês: Immobilized enzyme reactor) possuem maior estabilidade na presença de solventes orgânicos e variações de temperatura, além de permitir a reutilização e o uso de pequenas quantidades de enzima. Diferentes métodos de imobilização e uma grande variedade de suportes cromatográficos disponíveis ampliam, sobremaneira, as possibilidades de utilização de biorreaotres enzimáticos em estudos on-line, com diferentes formatos e configurações. O uso da cromatografia seletiva de afinidade, utilizando IMERs tem sido explorado com eficiência e demonstrado grandes vantagens como uma das técnicas de triagem de alta eficiência. A cromatografia seletiva de afinidade pode ser explorada através de cromatografia frontal, zonal (linear e não linear). Além disso, a cromatografia zonal pode ser empregada com sistemas 2D hifenadas a diferentes detectores. Enzimas imobilizadas em partículas magnéticas têm sido também eficientemente utilizadas em triagem de ligantes em coleção combinatórias naturais ou sintéticas. O objetivo deste projeto é desenvolver modelos de triagem para os seguintes alvos: ACE, as colinesterases AChE de formiga e humana, e BChE humana, nucleotídeo difosfato quinase (NDK) de Leishmania, NTPDases de T. cruzi e Leishmania e fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) de T. cruzi e Xantina oxidase (XO).

Projeto para aquisição de equipamento multiusuário, associado a projeto Temático. Auxílio Pesquisa -Equipamentos Multiusuários- FAPESP

Titulo: Colunas capilares enzimáticas: desenvolvimento e aplicação de métodos on-line na triagem de inibidores seletivos e no monitoramento do trabalho fitoquímico de Produtos Naturais

Auxílios a Pesquisa - Reparo de Equipamento

Uma das estratégias empregadas no desenvolvimento de um novo fármaco envolve a descoberta de compostos que modulem a atividade de enzimas importantes ao processo infeccioso de agentes patogênicos. Uma abordagem interessante na triagem de novos ligantes é a utilização de métodos baseados na imobilização de enzimas em suportes cromatográficos acoplados a sistemas de cromatografia liquida multi e/ou unidimensional. O uso de IMERs (do inglês immobilized enzyme reactors) como fase estacionária acoplados a sistemas cromatográficos de alta eficiência constituem um método rápido e eficiente de screening de compostos de coleção ou de extratos naturais e possui vantagens em relação ao uso da enzima em solução tais como, fácil separação dos produtos de reação, aumento da estabilidade enzimática e uso de pequenos volumes de amostra. A enzima NTPDase2 de Leishmania funciona como um facilitador da infecção do patógeno, pois inibe a resposta imune do hospedeiro permitindo uma infecção silenciosa. A triagem de inibidores para esta enzima pode trazer importantes alternativas para o tratamento da leishmaniose e garantir melhor qualidade de vida às populações atingidas por endemias. Neste trabalho a enzima NTPDase2 será imobilizada para a construção de ICERs (immobilized capilarry enzyme reactors) que serão aplicados na identificação de substâncias ativas em coleções naturais e/ou sintéticas utilizando sistemas cromatográficos

INSTITUTO NACIONAL DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE CONTROLE BIORRACIONAL DE INSETOS PRAGAS: Financiamento CNPq- FAPESP: CNPq-FAPESP 2008-2012 (573742/2008-1 CNPq; 08/57859-5 FAPESP): R$ 6.003.392,10.

O projeto envolve o desenvolvimento de colunas capilares contendo enzimas alvos de doenças tropicais e do sistema nervoso central imobilizadas covalentemente e sua aplicação como ferramenta na triagem de inibidores seletivos fazendo uso da biocromatografia e cromatografia multidimensional.

Nesse projeto extratos naturais principalmente de origem mircobiológica são avaliados quanto á sua capacidade inibitória na enzima acetilcolinesterase. Os extratos ativos posteriomente são submetidos a metodologias de identificação e purificação dos compostos ativos responsáveis pela atividae detectada no extrato bruto.

O projeto tem como objetivo o isolamento de compostos ativos. O trabalho será monitorado pelos ensaios com o radical livre estável DPPH para a atividade antioxidante e de inibição da enzima acetilcolinesterase.

Nesse colunas de afinidade preparadas com gGAPDH do T. cruzi e humana serão utilizadas para identificação de substâncias ativas em extratos de plantas, utilizando-se sistemas cromatográficos multidimensionais para identificar e separar misturas de compostos ativos.

Esse projeto foi ralizado visando a obtenção do Título de Doutora em Química Orgânica com ênfase em Química De Produtos Naturais. O projeto envolveu a utilização de CLAE na purificação das diferentes classes de substâncias produzidas nas folhas e caules de C. turbinata. O estudo foi biomonitorado com ensaios antioxidantes para identificação das susbtâncias responsáveis pela atividade antioxidante detectada nos extratos brutos das folhas e caules. Foram isoladas e identificadas mais de 40 substâncias dentre as quais 5 são inéditas na literatura, sendo uma delas um novo esqueleto.

Esse projeto foi realizado durante o estágio de iniciação científica. Durante esse período foram apresentadas as técnicas cromatográficas simples de isolamento e técinicas espectroscópicas de determinação estrutural de substâncias produzidas pelas plantas. O extrato BuOH das folhas de C. turbinata foi o objeto de estudo durante esse projeto e resultou no isolamento de 4 alcalóides indólicos.

O projeto teve como objetivos principais o desenvolvimento do estudo fitoquímico de espécies da Mata Atlantica e Cerrado visando a seleção de plantas ativas em ensaios com cepas mutantes de Saccharomyces sereviseae.