Felipe Perecin.

Enquanto os atributos espermáticos de caráteres morfológicos e funcionais são associados à qualidade espermática e ao potencial fértil masculino, recentemente os atributos moleculares dos espermatozoides também têm sido reconhecidos como fatores determinantes destes. Neste contexto, os espermatozoides carregam moléculas de RNAs, principalmente ncRNAs (RNAs não codificadores) que se relacionam com o desenvolvimento embrionário inicial. Pelo fato de os espermatozoides apresentarem DNA altamente condensado e, serem considerados, portanto, transcrionalmente inertes, é durante a passagem pelo epidídimo que as células espermáticas adquirem grande parte dessas moléculas, por meio das vesículas extracelulares (epididimossomos) liberadas pelo epitélio epididimário. Recentemente, mostramos que microRNAs, uma subpopulação específica de ncRNAs, são alteradas nas vesículas extracelulares isoladas do plasma seminal de touros submetidos ao estresse térmico escrotal. Entretanto, não sabemos se o conteúdo molecular do epitélio epididimário também poderia ser alterado e se as vesículas alteradas poderiam modular o conteúdo molecular espermático e, consequentemente, impactar o desenvolvimento embrionário inicial. De fato, os efeitos do estresse térmico são bem descritos no tocante às interações testículos-espermatozoides e sabidamente geram prejuízo à qualidade espermática e ao potencial fértil. No entanto, pouco se sabe como as interações epidídimos-espermatozoides, mediadas pelos epididimossomos, poderiam responder a este estresse. Assim, a hipótese do presente estudo é que o estresse térmico leva a alterações moleculares nos epidídimos e nos espermatozoides, mediadas pelos epididimossomos, que apresentam impacto sobre o desenvolvimento embrionário inicial.

A via de sinalização PI3K-Akt tem papel fundamental no desenvolvimento oocitário regulando importantes funções celulares como a proliferação celular, apoptose, reparo de DNA, metabolismo de glicose e síntese proteica. No ambiente folicular a via da PI3K-Akt já foi descrita como importante para o início do desenvolvimento, para a maturação, para a proliferação das células da granulosa e recentemente, pelo nosso grupo de pesquisa, descrita como sendo fortemente regulada pelos miRNAs das células foliculares e positivamente relacionada à competência oocitária. Este projeto visa compreender melhor a função da via de sinalização PI3K-Akt e as funções celulares reguladas por ela nos complexos cumulus-óocito durante o processo de maturação. Serão utilizadas três abordagens com o objetivo de compreender as consequências da sua ativação/inibição durante a maturação in vitro na produção in vitro de embriões bovinos. A primeira abordagem consistirá na avaliação da influência da maturação in vitro na atividade da via de sinalização PI3K-Akt utilizando amostras de células do cumulus de COCs imaturos, e maturados in vivo e in vitro. Serão avaliados os genes da via propriamente dita e também genes relacionados a diferentes funções celulares e que são regulados por essa via. A segunda e terceira abordagens consistirão na estimulação ou inibição da via PI3K-Akt através de fármacos e biomoléculas (miRNAs) em complexos cumulus-oocitário durante a maturação. Serão avaliados os efeitos celulares (apoptose, metabolismo, síntese protéica e proliferação celular) da ativação/inibição via de sinalização PI3K-Akt em COCs, e será avaliada a influência da modulação dessa via de sinalização durante a maturação nas taxas de maturação (MII), clivagem e de produção de embriões bovinos in vitro. O conhecimento funcional de vias de sinalização como a PI3K-Akt dentro do complexo cumulus-oocitário e como essas vias influenciam na capacidade dos oócitos desenvolverem-se até o estágio de blastocisto é essencial para melhorar os resultados das tecnologias de reprodução assistida além de melhorar a qualidade dos embriões produzidos in vitro.

A espécie bubalina destaca-se no cenário atual da pecuária por sua rusticidade e pelas qualidades nutricionais do leite e da carne. Nesta espécie, o emprego de biotecnologias reprodutivas como a produção in vitro de embriões (PIVE) ainda é incipiente e quando utilizada, dois fatores limitantes devem ser considerados: a transferência de embriões frescos ou vitrificados e a estacionalidade reprodutiva das búfalas. Reduzir a necessidade de utilizar embriões frescos ou vitrificados, pelo uso de embriões congelados para transferência direta; e utilizar receptoras na estação reprodutiva desfavorável, removendo o efeito sazonal das parições e da produção de leite, permitiria intensificar a exploração zootécnica e intensificar o desenvolvimento de programas de melhoramento nesta espécie. Assim, esse projeto propõe investigar a eficiência da produção in vitro de embriões (PIVE) durante a estação reprodutiva favorável (ERF) comparada com a estação reprodutiva desfavorável (ERD). O estudo propõe ainda, comparar as taxas de concepção entre embriões vitrificados (VT) e congelados para transferência direta (TD), produzidos na ERF e ERD. Embriões produzidos na ERF serão transferidos para receptoras na ERF e ERD, mesmo procedimento a ser adotado para os embriões produzidos na ERD. Espera-se, a partir dos resultados deste projeto, mostrar o efeito da estação reprodutiva (ERF ou ERD) das doadoras de oócitos sobre o sucesso da PIVE e comparar as taxas de gestação dos embriões criopreservados (VT e TD) transferidos para receptoras na ERF e ERD. A partir dos resultados deste projeto espera-se determinar se há efeitos oocitários (doadora em ERF e ERD) ou endometriais (receptora em ERF e ERD) influenciando o sucesso reprodutivo na espécie bubalina submetida à PIVE; espera-se também verificar o efeito do método de criopreservação.

Oócitos em desenvolvimento estocam lipídeos no ooplama e o utilizam como fonte energética. Este evento fisiológico normal pode ter efeito negativo quando ocorre de forma acentuada levando a excessivo acúmulo lipídico intraoocitário. Os resultados do projeto de auxílio pesquisa anterior (2014/21034-3) demonstraram em bovinos que a maturação in vitro (MIV) de oócitos, comparada a maturação in vivo, provoca, excessivo acúmulo lipídico intraoocitário associado a uma massiva desregulação das vias metabólicas nas células do cumulus. Ainda, demonstrou-se, pela primeira vez, um provável mecanismo de transporte de ácidos graxos desde as células do cumulus até o oócito via a proteína carreadora de ácidos graxos 3 (FABP3) e as projeções transzonais (TZPs). Foi demonstrado também que este transporte torna-se exacerbado na MIV. Estes prévios resultados demonstram que a MIV gera um ambiente in vitro metabolicamente alterado, e isso reflete-se em alterações no metabolismo de células do cumulus e acúmulo lipídico oocitário. Enquanto a MIV representa um modelo in vitro para estudo do acúmulo lipídico oocitário, a obesidade pode representar um modelo in vivo para estudar tal acúmulo em ambiente metabolicamente alterado. Resultados preliminares em camundongos (anexo à proposta), demonstram que a obesidade também leva a acúmulo lipídico oocitário. Diante destes resultados prévios este projeto propõe-se a investigar causas e mecanismos do acúmulo lipídico intraoocitário em situações metabolicamente alteradas in vitro (MIV) e in vivo (obesidade), em bovinos e murinos, respectivamente. Embora demonstrado que a MIV induza acúmulo lipídico oocitário, não se conhece plenamente os efeitos da MIV na regulação das vias de metabolismo e sinalização nas células do cumulus, nem como que determinados componentes do meio de MIV interferem no processo de acúmulo. Similarmente, desconhece-se os mecanismos pelos quais o oócitos de fêmeas obesas acumulam lipídeos excessivamente. Para nos aprofundarmos nesses pontos foram delineados 3 estudos. No Estudo 1 será analisado o transcriptoma das células do cumulus de complexos oócito-cumulus (COCs) imaturos, maturados in vivo e in vitro com intuito de detectar alterações nas vias metabólicas e de sinalização relacionadas com a maturação oócitaria. Os resultados deste experimento deverão permitir a identificação de novas vias de metabolismo a serem investigadas. No Estudo 2 serão realizados experimentos para investigar os efeitos das vesículas extracelulares (EVs) oriundas do soro fetal bovino e dos níveis de suplementação com FSH na MIV sobre o acúmulo lipídico oocitário e possível transporte de lipídeos via FABPs e TZPs. Para isso oócitos imaturos, maturados in vitro por 9 horas e maturados in vitro por 24 horas serão analisados quanto ao conteúdo de lipídeos e níveis de FABP3. As células do cumulus desses mesmos COCs serão destinados à quantificação da PLIN2 e mRNA de FABP3 e PLIN2. No Estudo 3 será utilizado o modelo de obesidade em camundongas para o estudo dos mecanismos de acúmulo lipídico dentro do COC. Neste estudo, o primeiro experimento terá como objetivo determinar e comparar o estoque lipídico nas células do cumulus e oócitos durante a fase final da maturação oocitária em camundongas obesas e controle. No segundo conjunto experimento serão estudados quatro possíveis mecanismos de acúmulo lipídico nos COCs de folículos pré-ovulatórios e em oócitos ovulados de camundongas obesas e controle, que são: (1) o aumento da síntese e do acúmulo de lipídeos no COC; (2) a diminuição da beta-oxidação; (3) o transporte de ácidos graxos das células do cumulus até o oócito via FABPs e TZPs; e (4) a deficiência da lipofagia no COC. Os resultados obtidos no presente auxílio possibilitarão a compreensão de mecanismos associados ao acúmulo lipídico intraoocitário em condições metabolicamente anormais, levando ao desenvolvimento de

Embriões bovinos produzidos in vivo e in vitro possuem diferentes características metabólicas, além de diferenças no desenvolvimento embrionário e na transcrição gênica, o que consequentemente afeta as taxas de concepção e a produtividade dos rebanhos de corte. Entre os dias 8 e 17 do ciclo estral é quando ocorrem 40% das perdas embrionárias, coincidindo com a sinalização entre o concepto e o organismo materno. Vesículas extracelulares (EVs) fazem parte desta sinalização transportando miRNAs que podem atuar nas diversas células do organismo bovino. Com isso, a hipótese deste projeto é que embriões bovinos produzidos in vivo e in vitro secretam EVs que possuem o conteúdo de miRNA diferencial podendo mudar o padrão de expressão gênica do endométrio e do corpo lúteo. Para testar a hipótese o primeiro objetivo é caracterizar o padrão e conteúdo de miRNAs das EVs secretadas por embriões bovinos produzidos em diferentes ambientes entre o dia 7 e o dia 9 de desenvolvimento. O segundo objetivo é avaliar o efeito das EVs secretadas no meio condicionado por embriões bovinos produzidos in vivo e in vitro sobre a expressão gênica do cultivo de células luteais. O terceiro objetivo é determinar os níveis de mRNA e miRNAs no epitélio endometrial e no corpo lúteo de vacas gestantes de embriões produzidos in vivo e in vitro entre o dia 7 até o dia 9 de desenvolvimento. Os resultados obtidos mostrarão que o ambiente onde os embriões foram produzidos pode modificar as características morfológicas e o conteúdo das EVs que eles secretam, o que consequentemente altera o padrão de transcritos do endométrio e do corpo lúteo. Desta forma, moléculas que contribuem positivamente com o estabelecimento da gestação bovina poderão ser identificadas, abrindo a possibilidade de modular positivamente as taxas de concepção de vacas receptoras de embriões produzidos in vitro.

A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia amplamente empregada na pecuária bovina brasileira. Todavia as taxas de sucesso desta técnica são inferiores àquelas obtidas com embriões produzidos in vivo, em parte devido à suscetibilidade do embrião a fatores estressantes relacionados ao ambiente in vitro, principalmente ao estresse oxidativo, favorecido pelas altas tensões de oxigênio durante o cultivo embrionário e mediada pela formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular. Em mamíferos, estudos demonstram que o estresse oxidativo interfere na capacidade do desenvolvimento do embrião através de modificações epigenéticas, como a metilação da fita de DNA, que promove a manutenção dos padrões de expressão gênica. Estas modificações alteram de forma significativa a expressão de reguladores gênicos pós-transcricionais, que coordenam diversos mecanismos de crescimento e diferenciação celular, como pequenos RNAs não codificadores, com destaque para o miR-199a. Estudos indicam que em condições de cultivo in vitro o mi- 199a tem sua expressão alterada pela metilação do DNA, o que altera, consequentemente os níveis de proteína de seus genes alvo, ERBB2 e ERBB3. As proteínas codificadas por ERBB2 ERBB3, respectivamente ERBB2 e ERBB3, tem sido implicadas no processo de reconhecimento materno-fetal e implantação embrionária. A partir destas observações é possível formular a hipótese que o sistema de produção in vitro levam a alterações nos níveis de ERBB2 e ERBB3 em embriões bovinos, e que esse efeito é mediado por alterações na expressão do miR-199a em resposta ao estresse oxidativo. O presente projeto tem o objetivo de determinar o efeito do estresse oxidativo sobre a expressão do miR-199a durante o desenvolvimento embrionário, e determinar o efeito de alterações do miRNA-199a nos genes alvo e as proteínas ERBB2 e ERBB3. A partir dos resultados deste projeto espera-se elucidar alguns dos efeitos do ambiente in vitro na regulação de vias de sinalização associadas ao estabelecimento da gestação.

A produção in vitro de embriões bovinos é uma biotecnologia bastante difundida no Brasil, o país foi responsável por aproximadamente 77% dos embriões bovinos produzidos in vitro e transferidos no ano de 2010 (STROUD e CALLESEN, 2012). Embora bastante utilizada desenvolver estratégias que levem a maior aproveitamento dos oócitos e compreender os mecanismos (no microambiente folicular) que determinam a competência oocitária é de grande interesse para o mercado nacional. O microambiente folicular é fundamental para o crescimento e a aquisição da competência oocitária, tornando o oócito apto a desenvolver-se e manter o embrião até a transição materno-zigótica. Para tanto, os componentes foliculares ? células da granulosa, células do cúmulus, oócito e líquido folicular ? precisam trabalhar em unidade, visto que possuem uma relação de interdependência. Conhecidas como um mecanismo importante de comunicação celular recentemente descrito, as vesículas secretadas por células e seu conteúdo ? proteínas e miRNAS ? podem ter ação importante nessa comunicação e influenciar a aquisição da competência oocitária. Portanto, a hipótese deste projeto é que proteínas presentes em vesículas secretadas por células foliculares e presentes no líquido folicular e miRNAs presentes nas células do cumulus modulam a qualidade oocitária. Foram escolhidas duas estratégias: 1) identificar e quantificar proteínas no líquido folicular presentes em vesículas secretadas por células (microvesículas e exossomos) e relacioná-las à competência oocitária; 2) determinar o perfil dos miRNAs das células do cumulus e correlacioná-los com a competência oocitária. Caso alguns miRNAs estejam relacionados ao potencial de desenvolvimento oocitário, testes funcionais serão realizados através da adição de replicadores (?miRNA mimics?) ou inibidores (?miRNA inhibitors?) destes miRNAs alvos, e posterior avaliação do efeito nas taxas de produção embrionária. Os resultados deste projeto trarão benefícios como o esclarecimento dos mecanismos de comunicação intercelular dentro no folículo ovariano, caracterização do perfil de miRNAs nas células do cumulus, identificação de possíveis miRNAs e proteínas biomarcadores de qualidade oocitária, permitindo o desenvolvimento de novas ferramentas para intensificar a produção in vitro de embriões bovinos.

Na última década a produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos tornou-se uma biotécnica amplamente empregada na pecuária nacional. Segundo dados computados pela Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS) no ano 2011 foram realizadas 373,836 transferências de embriões bovinos produzidos in vitro, das quais 85% foram produzidos no Brasil (IETS, 2012). Todavia o sistema de produção in vitro, embora viável tecnicamente, ainda provoca alterações celulares e moleculares nos embriões, e tem uma eficiência aquém daquela que seria desejável, com taxas que variam de 30 a 50% na produção de blastocistos a partir de oócitos imaturos. Uma das etapas com maior impacto sobre a competência oocitária em atingir a fase de blastocisto é a maturação in vitro (MIV). Estudos prévios conduzidos por nosso grupo de pesquisas demonstraram deficiências em relação à migração e quantidade de mitocôndrias ativas e gotas lipídicas durante a MIV comparado ao processo in vivo. Considerando que as mitocôndrias oocitárias são responsáveis pelo aporte energético até o estádio de blastocisto, e que a oxidação dos ácidos graxos que ocorre nas mitocôndrias é o principal mecanismo celular responsável pelo fornecimento energético para o desenvolvimento oocitário e embrionário, a atividade de ambas organelas é determinante para o sucesso da PIVE. Há evidências (WU et al., 2011, DUNNING et al., 2012, YAMAGUCHI et al., 2012 e CHANKITISAKUL et al., 2013) de que substâncias moduladoras da beta-oxidação, como a L-carnitina e o bezafibrato, possam estimular o processo oxidativo e levar a incremento nas taxas da produção de embriões. Dessa forma, este trabalho visa comparar a atividade mitocondrial e o metabolismo lipídico entre a produção in vivo de embriões e a PIVE, bem como determinar o efeito da adição de moduladores da oxidação mitocondrial (L-carnitina e bezafibrato) durante a MIV nas taxas de produção in vitro. Para esse fim, serão avaliadas tanto o comportamento lipídico e mitocondrial e a beta-oxidação, quanto fatores de estresse celular durante a maturação e desenvolvimento embrionário em diferentes condições de produção embrionária. A partir dos resultados deste projeto espera-se compreender os efeitos dos sistemas in vitro sobre a beta-oxidação e metabolismo lipídico-mitocondrial, e também obter incremento na produção embrionária através da adição de moduladores da oxidação mitocondrial que não aumentem o estresse oxidativo celular.

As descobertas de mecanismos de indução da pluripotência revolucionaram os estudos acerca dos eventos celulares envolvidos nos processos de indiferenciação e de reprogramação nuclear. No entanto, embora a geração de iPS já tenha sido relatada em diversas espécies, os resultados na espécie bovina ainda são inconsistentes. Recentemente alguns artigos tem correlacionado o sucesso da indiferenciação à reprogramação adequada de alguns genes imprinted (1, 2, 3). Assim, o presente projeto propõe-se a estudar os efeitos de ensaios de indiferenciação sobre o estado epigenético e expressão de genes imprinted na espécie bovina. Para tal, através de um modelo baseado na presença de polimorfismo de base única entre os alelos dos genes imprinted IGF2R e H19, os quais tem reconhecida importância sobre o desenvolvimento embrionário e fetal, serão avaliados seus padrões de expressão em fibroblastos bovinos durante o processo de geração de células pluripotentes bovinas por diferentes protocolos. Os resultados desse trabalho permitirão aprofundar o conhecimento acerca dos mecanismos envolvidos no processo de indução de pluripotência na espécie bovina, bem como o papel dos genes imprinted neste processo.

O amplo emprego da clonagem por transferência nuclear na produção animal ainda é limitado pela baixa capacidade dos embriões em estabelecer gestações, pelas elevadas perdas embrionárias iniciais e baixas taxas de sobrevivência a termo. Além disso, uma miríade de anormalidades fenotípicas é observada nos animais clonados. Dentre as mais comuns inclui-se a síndrome da cria gigante (LOS), caracterizada por crescimento acima do normal dos conceptos, anormalidades placentárias e imaturidade pulmonar.
 	Embora mais freqüente entre os animais clonados, a LOS não está associada somente à esta técnica, tendo sido relatado casos em animais nascidos após fertilização in vitro. Os mecanismos que levam ao aparecimento da LOS ainda não estão integralmente elucidados, todavia extensas evidências apontam para eventos epigenéticos como seus determinantes, em especial o fenômeno do ?imprinting? genômico e, em particular, o gene ?imprinted? IGF2R. Os genes ?imprinted?, que podem ser definidos como genes de expressão monoalélica dependente da origem parental, são particularmente importantes na regulação do crescimento fetal e placentário e no transporte de nutrientes entre a placenta e o feto. 
Em nosso laboratório, similarmente ao que é descrito por outros grupos de pesquisa (HILL et al., 2000) mais de 60% das gestações estabelecidas a partir de embriões clonados se perdem até o segundo mês de gestação. Nesta fase, a ocorrência de morte embrionária concentrada pode ser relacionada a importantes eventos ligados ao desenvolvimento do embrião e da placenta, como o estabelecimento dos placentônios e o início da organogênese. Além disso, os resultados de estudos conduzidos por nosso grupo de pesquisa demonstraram decréscimo dos transcritos de IGF2R em tecidos placentários de animais clonados, além de alta correlação negativa entre os níveis cotiledonários de IGF2R e peso ao nascimento destes (YAMAZAKI, 2006; PERECIN, 2007). 
Os estudos focados nos genes ?imprinted? em bovinos furtam-se

A clonagem em bovinos tem ganhado importância crescente na pecuária nacional com o aumento da demanda pela clonagem de animais geneticamente superiores e com o surgimento de empresas que disponibilizam esta tecnologia aos pecuaristas. Além das aplicações comerciais a técnica de transferência nuclear (TN) também serve como modelo para estudo do desenvolvimento embrionário e da reprogramação nuclear. No entanto, a técnica ainda possui limitações, em especial, uma baixa eficiência em gerar animais a termo. A principal razão para esta eficiência insatisfatória reside na inadequada reprogramação nuclear (remodelação da cromatina) da célula doadora de núcleo após a transferência nuclear. Em outras palavras, os padrões epigenéticos (metilação de DNA e modificações pós-transcricionais nas proteínas histonas) resultantes da remodelação da cromatina pelo oócito receptor são na maioria das vezes incompatíveis com o desenvolvimento. O emprego de moléculas capazes de modificar a cromatina e auxiliar a reprogramação nuclear produzida pelo citoplasma do oócito consiste em uma estratégia capaz de mudar o panorama da clonagem. A presente proposta tem como objetivos avaliar o uso de inibidores das DNA metiltransferases (agentes desmetilantes) e inibidores das histonas desacetilases (agentes acetilantes) em linhagens celulares destinadas à TN, avaliando as diferenças epigenéticas resultantes nas células e visando aumentar a eficiência da clonagem em bovinos modificando a cromatina da célula doadora de núcleo antes da transferência para o oócito receptor.

A mitocôndria, além de participar da produção de adenosina trifosfato pelo processo de fosforilação oxidativa, possui papel na sinalização intracelular do processo de apoptose. Células rho zero (desprovidas de DNA mitocondrial) contribuíram para a caracterização do papel das mitocôndrias nestas vias de sinalização. Recentemente, em estudos realizados com zigotos bovinos submetidos a uma diminuição de cerca de 50% do conteúdo mitocondrial não apresentou efeito deletério ao desenvolvimento embrionário in vitro. Este modelo foi desenvolvido pela centrifugação de zigotos após a fecundação in vitro (FIV), retirada do extrato citoplasmático rico em mitocôndrias (ECRM) e posterior introdução de 20-30% de ooplasto. Sabendo-se que esse modelo biológico permite o desenvolvimento embrionário em condição de depleção mitocondrial, o objetivo deste trabalho é avaliar o efeito da remoção e da suplementação mitocondrial em estádio de zigoto visando compreender a importância da organela no processo de morte celular programada..

Avalição dos efeitos da substituição das fontes protéicas de origem sangüínea bovina (SFB e BSA) pela ovalbumina (proteína da clara do ovo) durante os procedimentos de produção in vitro (PIV) de embriões bovinos

Avaliar a ação da demecolcina em oócitos bovinos em metáfase I e II por meio do acompanhamento da dinâmica nuclear e de microtúbulos, maturação nuclear, migração de grânulos corticais, clivagem e produção de blastocistos. Verificar o desenvolvimento embrionário após transferência nuclear empregando-se a técnica de enucleação assistida quimicamente pela demecolcina.

Estudo do padrão de expressão de genes imprinted (Igf2, Xist, Igf2r, H19 e Mash2), de genes relacionados à apoptose (Bax e Bcl-2) e de DNA metiltransferases (Dnmt1, Dnmt3a e Dnmt3b), por RT-PCR semi-quantitativo e em tempo-real, em embriões bovinos produzidos in vivo, in vitro, clonados e partenogenéticos, em diferentes estádios do desenvolvimento.

Avaliação da freqüência dos RNAs mensageiros das DNA metiltransferases (Dnmt) 1, 3a e 3b, e do gene de expressão constitutiva gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) em blastocistos bovinos produzidos in vivo e in vitro por transferência nuclear de célula somática (TNCS), ativação partenogenética e fertilização in vitro (FIV). Avaliação da expressão das Dnmts e dos genes imprinted IGF2, IGF2r e H19 em membranas cório-alantóide e fetos bovinos produzidos in vivo e in vitro por TNCS, ativação partenogenética e FIV e recuperados entre os dias 33 e 36 de gestação.

Emprego de um modelo taurus/indicus de transferência de citoplasma entre oócitos e zigotos bovinos, e de estratégias físicas e químicas para depleção de DNA mitocondrial e/ou mitocôndrias, na geração de embriões, fetos e animais heteroplásmicos para estudo dos mecanismos de herança mitocondrial.

Avaliação de drogas inibidoras reversíveis de topoisomerase I e II (etoposídeo, camptotecina, doxorubicina e ciclohexemide) como indutoras de enucleação química para posterior utilização em procedimentos de clonagem por transferência nuclear

Estudar a expressão de genes imprinted em diferentes estádios do desenvolvimento, em bovinos; avaliar a influência do tratamento de ativação sobre o desenvolvimento embrionário e a expressão dos genes imprinted em embriões bovinos partenogenéticos; avaliar a interação núcleo-citoplasmática entre embriões produzidos por fecundação in vitro e embriões partenogenéticos e entre embriões partenogenéticos produzidos por diferentes tratamentos

Embora a transferência nuclear com células somáticas tenha sido usada com êxito para produção de animais viáveis, a eficiência desta técnica ainda é baixa. Diversos problemas no desenvolvimento têm sido observados nos clones, com alta mortalidade embrionária, fetal e mesmo pós-natal. A principal causa das mortes tem sido atribuída a distúrbios placentários e fetais. Uma vez que os genes ?imprinted? são importantes para o desenvolvimento da placenta e do feto, o objetivo deste estudo foi avaliar os padrões de expressão dos genes Igf2, H19 e Igf2r na placenta de clones bovinos recém-nascidos, em comparação com animais controles produzidos por monta natural.

Avaliação dos efeitos (migração de grânulos corticais, dinâmica nuclear e de microtúbulos, taxas de formação de pronúcleo, clivagem e desenvolvimento até blastocisto, e coloração diferencial de blastocistos) da ativação com estrôncio, ionomicina e 6-DMAP, sozinhos ou em combinação, em oócitos bovinos maturados in vitro por 22, 26 e 30 horas.

Estudar os efeitos dos estimuladores da síntese de glutiona no desenvolvimento in vitro de embriões bovinos