Beatriz Simonsen Stolf.

Os glicossomos são organelas de protozoários da família Trypanosomatidae que abrigam a maior parte das enzimas da via glicolítica e de outras vias metabólicas, que são produzidas no citoplasma e transportadas ao glicossomo com auxílio de proteínas PEX. A ligação de PEX5-PEX14 é essencial para o transporte, formando um poro transitório de importação. Trabalhos recentes criaram um modelo de farmacóforo 3D que mimetiza a ligação de PEX5 ao PEX14. Os compostos elaborados a partir desse modelo bloquearam a interação PEX14-PEX5 e foram tóxicos para Trypanosoma brucei e T. cruzi, com baixa toxicidade para células de mamíferos. Considerando a alta toxicidade e baixa eficiência dos tratamentos para leishmaniose, pretendemos avaliar o efeito dos compostos na viabilidade de Leishmania. Para isso, avaliaremos seus efeitos em promastigotas e em infecções in vitro e in vivo. Esperamos contribuir com opções para um melhor tratamento da leishmaniose.

A modulação da ativação dos macrófagos mediada por long noncoding RNA (lncRNA) e microRNAs (miRNAs) e sua influência na regulação de genes relacionados com a sobrevivência ou morte do parasita é importante para entender como fatores do parasita e do hospedeiro contribuem para a patogênese da leishmaniose. O objetivo central do projeto é avaliar a função de lncRNA, miRNAs na regulação da resposta imune e metabolismo de macrófagos infectados com Leishmania e usar interferência metabólica como estratégia terapêutica. A parte 1 do projeto será dedicada ao estudo da expressão de lncRNAs, miRNAs e genes correlacionados (host-genes) para elucidar os sinais que regulam a ativação de macrófagos infectados por L. amazonensis e L. infantum. Na parte 2 do projeto avaliaremos a atividade leishmanicida de novas drogas desenvolvidas para bloquear a interação PEX5-14 e localização de enzimas no glicossomo em formas promastigotas e em modelos in vitro e in vivo de infecção com Leishmania.

Amastigotas das cepas PH8 e LV79 de L. (L.) amazonensis possuem diferenças na virulência em camundongos e no perfil proteico (proteoma). De forma semelhante, promastigotas da cepa PH8 têm maior adesão a macrófagos in vitro e maior internalização. A comparação dos proteomas de frações enriquecidas em membrana de promastigotas das cepas PH8 e LV79 mostrou diversas 
diferenças. Este projeto tem como objetivo validar as diferenças observadas nos proteomas e avaliar a
importância funcional de algumas proteínas. Para isso, pretendemos gerar mutantes (knockout
e/ou etiquetados) de enolase e LABCG1 por CRISPR-Cas9 e comparar a infectividade e
fagocitose de parasitos mutantes com as das duas cepas selvagens. Pretendemos ainda avaliar
a suscetibilidade de PH8 e LV79 a lise por complemento e a fármacos (no caso de ko para
LABCG1), comparar seus LPGs e sua capacidade de colonização de flebotomineos.

Nos últimos dez anos nosso grupo descreveu a interação de dezenas de compostos naturais e
sintéticos com a enzima arginase de Leishmania amazonensis (La-Arg). Estes estudos colocaram em evidencia a arginase como alvo terapêutico e possibilitaram a criação de parcerias com laboratórios de síntese de novos compostos de vários países. Neste projeto propomos continuar com a prospecção de novos inibidores da arginase através de síntese planejada a partir de estudos de relação estrutura atividade (SAR). Com isso, esperamos avançar no desenvolvimento de compostos sintéticos e semissintéticos com a finalidade de desenvolver um novo medicamento para o tratamento da leishmaniose humana e canina.

Projeto em colaboração USP- Fiocruz RJ -Instituto Pasteur do Canadá. Grant 2018

As leishmanioses são causadas por protozoários do gênero Leishmania, e podem apresentar manifestações clínicas tegumentares (LT) e visceral (LV). Vários fatores influenciam a forma e severidade da doença, principalmente a espécie de Leishmania e a resposta imune do hospedeiro.
CD100 (Sema 4D) tem grande importância no sistema imune. Nosso grupo mostrou que CD100 solúvel (sCD100) aumenta a infecção de macrófagos murinos por Leishmania amazonensis pela interação com o receptor CD72. Acreditamos que o mesmo ocorra com outras espécies do parasita, e por isso um dos objetivos desse projeto é avaliar o efeito de sCD100 sobre a infecção in vitro e fagocitose de L. braziliensis e L. chagasi, as espécies mais frequentemente isoladas de LT e de LV no Brasil. Iremos ainda investigar os efeitos de sCD100 sobre a infecção de macrófagos humanos. Por fim, para avaliar o papel de CD100 in vivo, compararemos infecções por L. amazonensis em
camundongos selvagens e nocautes para CD100.

Leishmania ssp. são protozoários parasitas responsáveis por um complexo de doenças conhecidas como leishmanioses. Apresentam duas formas principais: a promastigota flagelada no tudo digestivo do inseto vetor, e a amastigota no interior dos macrófagos do hospedeiro vertebrado. A sobrevivência e multiplicação da Leishmania no interior desses macrófagos devem-se à capacidade de evasão do parasito por meio de fatores de virulência. A análise do proteoma tem se mostrado uma ferramenta eficaz na identificação desses fatores. Estudo anterior de nosso laboratório comparou o proteoma de amastigotas de L. (L.) amazonensis obtidas de lesões de BALB/c e BALB/c nude para analisar o impacto de respostas T dependentes do hospedeiro na expressão de proteínas do parasita. Observamos que isoformas da oligopeptidase B (OPB) e de triparedoxina peroxidase citoplasmática (cTXNPx), sabidos fatores de virulência de tripanosomatídeos, estavam diferencialmente expressas. Neste projeto, pretendemos analisar a importância da OPB e da cTXNPx na virulência desta espécie obtendo e caracterizando parasitas superexpressores que serão utilizados em modelos murinos de infecção in vitro e in vivo, e, no caso dos parasitas superexpressores de cTXNPx, para avaliação da resistência a estresse oxidativo. 
Recentemente observamos que as cepas PH8 e LV79 de L. (L.) amazonensis mantidas em nosso laboratório apresentam padrões de infecção distintos em camundongos C57BL/6 e BALB/c e em macrófagos in vitro. Enquanto lesões pela cepa LV79 são bem menores nas duas linhagens murinas, lesões significantemente maiores e mais precoces são observadas após inoculação da cepa PH8. De forma semelhante, observamos maior porcentagem de células infectadas e de amastigotas por macrófago em infecções in vitro com a cepa PH8 do que com LV79. Pretendemos investigar esse fenótipo comparando o proteoma dessas cepas para identificar potenciais fatores de virulência de L. (L.) amazonensis. Analisaremos ainda se elas diferem quanto à fagocitose por macrófagos e à indução de citocinas e NO por essa célula.

No ciclo de vida da Leishmania, formas amastigotas vivem e se multiplicam no interior de macrófagos dos hospedeiros vertebrados enquanto que formas promastigotas vivem no inseto vetor. Visto que o sucesso de uma infecção, e portanto a forma e a severidade da doença, dependem tanto de fatores do hospedeiro quanto do parasita, esse projeto tem como objetivo estudar duas proteínas potencialmente importantes na infecção: uma do macrófago e outra da Leishmania. Estudaremos a proteína CD100 de macrófagos, que reduz a expressão de citocinas inflamatórias em monócitos humanos e é induzida em macrófagos por estimulos inflamatórios. Nosso objetivo nesse sentido é avaliar se CD100 afeta a infectividade do macrófago por Leishmania. O segundo objetivo do projeto é focado na metacaspase, uma proteína do parasita que pode afetar sua sobrevivência no macrófago. Metacaspases (MCAs) são formas evolutivas distantes das caspases de metazoários presentes em protozoários, plantas e fungos, também relacionadas com a apoptose. Pouco se sabe sobre proteínas reguladoras da atividade das MCAs. Utilizaremos a técnica de Phage Display com o propósito de selecionar ligantes da MCA de Leishmania L. amazonensis que fornecerão informações sobre sua regulação e que poderão induzir apoptose do parasita sem afetar a célula hospedeira.

O objetivo deste projeto é identificar as alterações na expressão proteica de amastigotas de L.amazonensis que ocorram como conseqüência da resposta imune do hospedeiro murino. Pretendemos identificar diferenças entre amastigotas provenientes de lesões de animais mais e menos suscetíveis à infecção, com base em análise de proteoma pelo sistema 2D DIGE. A análise dos padrões protéicos do parasita relacionados com o grau de suscetibilidade do hospedeiro deverá ajudar a compreender novos aspectos da relação desse parasita com o hospedeiro vertebrado.

O objetivo deste projeto é identificar as alterações na expressão proteica de amastigotas de L.amazonensis que ocorram como conseqüência da resposta imune do hospedeiro murino. Pretendemos identificar diferenças entre amastigotas provenientes de lesões de animais mais e menos suscetíveis à infecção, com base em análise de proteoma pelo sistema 2D DIGE. A análise dos padrões protéicos do parasita relacionados com o grau de suscetibilidade do hospedeiro deverá ajudar a compreender novos aspectos da relação desse parasita com o hospedeiro vertebrado.