Regina Lúcia Baldini.

O CEPID B3 é uma rede com pólos de pesquisa sediados em São Paulo (IQ-USP, ICB-USP), Campinas (IB-UNICAMP, IAC), Ribeirão Preto (FCFRP-USP, FMRP-USP) e Rio Claro (UNESP) que colaborará na realização de pesquisas básicas de ponta sobre os mecanismos moleculares de importância primordial para a reprodução bacteriana, o comportamento multicelular, a competição, a colonização e as interações de bactérias com seus hospedeiros eucarióticos e bacteriófagos. Os conhecimentos adquiridos serão utilizados na busca e desenvolvimento de novos inibidores químicos e biológicos do crescimento bacteriano.

A emergência e disseminação de bactérias multiresistentes a antibióticos é um grande problema de saúde pública mundial, com a crescente dificuldade de se combater infecções, sobretudo em ambientes hospitalares. Dentre os patógenos importantes nas infecções nosocomiais, destaca-se a proteobactéria Pseudomonas aeruginosa, que apresenta resistência intrínseca a diversas drogas e que têm alta capacidade de adaptação. Assim, o estudo da fisiologia desta bactéria, especialmente de mecanismos ligados ao crescimento na presença de antimicrobianos, pode indicar novos alvos para o desenvolvimento de alternativas terapêuticas. O segundo mensageiro c-di-GMP é crucial para a decisão entre os modos de vida séssil e planctônico das bactérias e as proteínas envolvidas com sua síntese, degradação ou que funcionam como sensores desse nucleotídeo podem estar entre esses alvos em potencial, visto que o crescimento em forma de biofilmes, estimulado por altas concentrações de c-di-GMP, acrescenta mais uma dificuldade na erradicação de infecções crônicas. Assim, este projeto visa estudar proteínas das vias de sinalização por c-di-GMP ainda não caracterizadas. Nossos estudos anteriores mostraram que a diguanilato ciclase DgcP se localiza nos polos das células e interage com uma proteína essencial para a montagem do pilus tipo IV (T4P), um importante fator de virulência pelo seu papel nas primeiras etapas de formação de biofilmes e por ser o mecanossensor de uma via que ativa genes envolvidos com patogenicidade. Neste presente trabalho, pretendemos aumentar a compreensão sobre a proteína DgcP, que apresenta uma grande região sem estrutura ou função determinados e que interaje com um fator sigma da família ECF, anotado como PA14_46810, que tem genes para a síntese de óxido nítrico como parte de seu regulon. Sabe-se que o NO é um sinal exógeno para a dispersão de biofilmes, e aqui pretendemos investigar se sua síntese endógena por vias que integram a sinalização por c-di-GMP, pode também ter um papel nesses eventos de dispersão. Como um terceiro objetivo, a proteína PA14_04420, que apresenta um domínio de síntese de c-di-GMP que pode ser cataliticamente ativo ou apenas funcionar como um receptor desta molécula, será caracterizada. Ensaios preliminares demonstraram que PA14_04420 pode interagir com diversas proteínas ligadas ao crescimento e divisão celular e um mutante em seu gene apresenta diferenças em relação à adaptação a concentrações sub-inibitórias de antibióticos, quando comparado com a linhagem selvagem. Para atingir as metas deste projeto, combinaremos estratégias genéticas, bioquímicas e de biologia molecular, tanto com metodologia já estabelecida pelo nosso grupo, quanto com colaborações com grupos importantes nacional e internacionalmente. Esperamos assim descobrir novos mecanismos moleculares usados por P. aeruginosa e outras bacterias que podem indicar novas estratégias para o combate a infecções, tão necessárias atualmente.

A fim de coordenar suas funções, todo organismo precisa ser capaz de receber informações do ambiente e utilizá-las para ajustar os mecanismos que vão garantir sua sobrevivência e adaptação às condições imediatas. Em bactérias, assim como em todas as células, sistemas de sinalização celular e de resposta devem ser finamente coordenados para assegurar o sucesso em situações específicas. Enquanto algumas bactérias possuem nichos restritos, Pseudomonas aeruginosa é uma oportunista por excelência, podendo habitar sítios diversos, utilizar fontes alternativas de carbono e obter energia usando diferentes aceptores finais de elétrons, além de poder viver em associação com organismos filogeneticamente distantes, causando infecções oportunistas. Ela também tem a capacidade de sintetizar compostos que lhe provêm vantagens na competição com outros microrganismos, apresenta sofisticados sistemas de comunicação célula-à-célula, mecanismos intrínsecos de resistência a antimicrobianos e pode viver na forma de intrincados biofilmes. Em humanos, P. aeruginosa é frequentemente associada a infecções adquiridas no ambiente hospitalar, além de ser causa importante de infecções audas e crônicas em portadores de fibrose cística. Com quase 20% de seu genoma dedicado a vias de regulação de expressão gênica, P. aeruginosa é alvo de estudos em diferentes aspectos de sua fisiologia, mas ainda há muito o que ser explorado em relação a vias de transdução de sinais ainda não caracterizadas. Assim, nosso grupo visa contribuir para a ampliação do conhecimento de mecanismos de sinalização, com o intuito de trazer mais informações que permitam a prevenção e manejo das infecções causadas por P. aeruginosa. Dentre estes mecanismos, destacam-se sistemas de dois componentes, sinalização por nucleotídeos e regulação da resistência a antibióticos por estresses ambientais, focos de estudo do presente projeto.

Todos os organismos coordenam suas funções recebendo informações do ambiente e utilizando-as para ajustar as vias que permitem sua sobrevivência e adaptação. Como em todas as células, os sistemas de sinalização em bactérias devem ser finamente regulados para garantir seu sucesso em diferentes condições. Enquanto algumas bactérias possuem nichos muito específicos, Pseudomonas aeruginosa é o símbolo do oportunismo: ela habita ambientes diversos, utiliza várias fontes de carbono e energia e é capaz de sintetizar metabólitos secundários que aumentam sua capacidade de competição com outros microrganismos. P. aeruginosa possui intrincados sistemas de comunicação célula-a-célula, resistência intrínseca a antibióticos e pode viver em comunidades multicelulares denominadas biofilmes. Está frequentemente associada a infecções hospitalares e pode causar pneumonias agudas e crônicas em portadores de fibrose cística. Com quase 20% de seu genoma dedicado à regulação da expressão gênica, P. aeruginosa tem sido extensivamente estudada no que se refere às várias faces de sua fisiologia, mas muito de suas vias de sinalização permanecem inexplorados. Este projeto visa aumentar o conhecimento desses sistemas, que poderiam ser alvos para tratar e prevenir infecções por P. aeruginosa. Mais especificamente, pretendemos entender as funções das proteínas PrlC e PA14_00800, cuja expressão é influenciada pelos níveis de c-di-GMP e que aparentam fazer parte da via de sinalização Chp, relacionada ao reconhecimento do contato com a superfície, que ativa vias de motilidade celular e de expressão de fatores de virulência.

Desde que o primeiro genoma de uma linhagem de Pseudomonas aeruginosa foi sequenciado há mais de uma década, ficou evidente a grande proporção de genes regulatórios presentes nesta bactéria, refletindo sua alta capacidade de adaptação. Frequentemente encontrada em amostras de água e solo dos mais diversos ambientes, a proteobactéria P. aeruginosa também pode estar associada a plantas e animais. Sua versatilidade se deve à capacidade de utilizar diversos substratos como fonte de nutrientes, de sintetizar compostos que lhe provêm vantagens na competição com outros microrganismos, à sua resistência intrínseca a antibióticos e à habilidade de se comunicar utilizando mensagens químicas, além de formar biofilmes em superfícies bióticas e abióticas. P. aeruginosa pode ainda se comportar como um patógeno oportunista, infectando queimaduras e feridas cirúrgicas, causando ceratite ulcerativa e infecções pulmonares, tanto em portadores de fibrose cística quanto em indivíduos com ventilação mecânica no ambiente hospitalar. Possui amplo repertório de fatores de virulência que, somado à alta resistência a antibióticos, resultam em dificuldades no tratamento dessas infecções. Para que as bactérias sejam capazes de perceber as condições do ambiente em que se encontram e de responder adequadamente a esses estímulos, sistemas de sinalização celular e de resposta devem ser finamente coordenados para assegurar o sucesso em situações específicas. Apesar de um amplo conhecimento sobre P. aeruginosa e suas estratégias de adaptação, muitos genes supostamente envolvidos em transdução de sinal ainda não tiveram seus produtos caracterizados quanto à função e sua regulação. Assim, este projeto pretende estudar novos sistemas regulatórios de P. aeruginosa, ampliando o conhecimento acadêmico sobre este microrganismo e possibilitando a descoberta de novos alvos terapêuticos. Entre esses sistemas, estão proteínas envolvidas com a sinalização pelo segundo mensageiro c-di-GMP, fatores sigma da família ECF e reguladores de resposta importantes para a virulência. Serão utilizadas abordagens genéticas, bioquímicas e de expressão diferencial de genes para atingir os objetivos específicos desta proposta.

Pseudomonas aeruginosa, uma gama-proteobactéria frequentemente encontrada em amostras de água e solo dos mais diversos ambientes, apresenta em seu genoma uma grande proporção de genes regulatórios, refletindo sua alta capacidade de adaptação. Sua versatilidade se deve à capacidade de utilizar diversos substratos como fonte de nutrientes, de sintetizar compostos que lhe provêm vantagens na competição com outros microrganismos, à sua resistência a antibióticos e à habilidade de se comunicar utilizando mensagens químicas, além de formar biofilmes em superfícies bióticas e abióticas. P. aeruginosa pode se comportar como um patógeno oportunista, infectando queimaduras e feridas cirúrgicas e causando infecções pulmonares, tanto em portadores de fibrose cística quanto em indivíduos com ventilação mecânica no ambiente hospitalar. Possui amplo repertório de fatores de virulência que, somado à alta resistência a antibióticos, resulta em dificuldades no tratamento dessas infecções. Para que as bactérias sejam capazes de perceber as condições do ambiente e de responder a esses estímulos, sistemas de sinalização celular e de resposta devem ser finamente coordenados para assegurar o sucesso em situações específicas. Apesar de um amplo conhecimento sobre P. aeruginosa e suas estratégias de adaptação, muitos genes supostamente envolvidos em transdução de sinal não tiveram seus produtos caracterizados quanto à função e sua regulação. Dentre estes, encontram-se fatores sigma da família ECF, assim denominada porque seus primeiros membros descritos respondem a fatores extracitoplasmáticos. Assim, este projeto pretende estudar fatores sigma ECF ainda não caracterizados em P. aeruginosa, utilizando abordagens genéticas, bioquímicas e de expressão diferencial de genes para aumentar a compreensão dos mecanismos regulatórios desta importante bactéria oportunista.

As bactérias foram por muito tempo consideradas como indivíduos unicelulares isolados, mas nas últimas décadas ficou evidente que elas se comunicam entre si e com os hospedeiros, podendo apresentar diferentes estilos de vida. Estes estilos incluem formas planctônicas, frequentemente móveis, ou aderidas a superfícies, formando biofilmes. Nesta última condição, as bactérias se tornam mais resistentes a condições adversas, não apenas por estarem protegidas por uma matriz extracelular, mas também por estarem em condições fisiológicas específicas, resultado de processos que podem ser considerados como desenvolvimento e diferenciação celular. Os mecanismos moleculares envolvidos na decisão entre vida planctônica ou em biofilmes têm sido bastante explorados nos últimos anos, não apenas pela importância acadêmica, mas também pela relevância médica, agrícola e biotecnológica dos biofilmes. Além da percepção de quorum, forma de comunicação em que indivíduos de uma população respondem coordenadamente, ajustando a expressão gênica à concentração de moléculas auto-indutoras no meio extracelular, o segundo mensageiro bis-(3',5')-di-guanosina monofosfato cíclico (c-di-GMP) é de crucial importância na decisão entre os estilos de vida móvel e séssil. Níveis elevados de c-di-GMP favorecem a sessilidade e à produção de exopolissacarídeo, enquanto níveis mais baixos levam à maior motilidade e a dispersão do biofilme. Este projeto pretende analisar como níveis alterados de c-di-GMP afetam o proteoma do fitopatógeno Xanthomonas campestris pv. citri 306 (XAC) e do patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa PA14, a fim de buscar novos mecanismos de regulação. Para tanto, linhagens mutantes ou superexpressando genes relacionados ao metabolismo de c-di-GMP serão construídas, seu perfil proteico será avaliado por eletroforese bidimensional e as proteínas diferencialmente expressas serão identificadas por espectrometria de massa. Padrões comuns entre as bactérias estudadas poderão indicar vi

Pseudomonas aeruginosa é uma proteobactéria do grupo gama, comumente encontrada em solo e água, mas que também pode se comportar como patógeno oportunista, dificilmente combatido com o uso de antibióticos. Em humanos, é uma das principais causas de infecção hospitalar e coloniza os pulmões de portadores de fibrose cística, provocando um quadro acentuado de inflamação, que culmina em falência pulmonar. Além dos aspectos diretamente ligados a patogenicidade, como a secreção, regulação e modo de ação de fatores de virulência, P. aeruginosa tem sido um modelo de pesquisa bastante explorado no que diz respeito a alta resistência intrínseca a antibióticos, em fenômenos ligados a comunicação célula-a-célula, a adesão e formação de biofilmes e em diversos estudos de diversidade e variabilidade genética, bem como expressão gênica e metabolismo. Como objetivo geral, serão caracterizados, em relação a sua função e expressão, genes e proteínas envolvidos com a patogenicidade de P. aeruginosa, tanto em características peculiares da linhagem PA14 quanto em aspectos conservados em diversas bactérias patogênicas. Este objetivo inclui a caracterização da função da metiltransferase putativa KerV e sua relação com a percepção de quorum e a produção de fatores de virulência; a análise de fatores envolvidos com a mobilização da ilha de patogenicidade PAPI-1; o aprofundamento do estudo da regulação da expressão de genes presentes nessa ilha, bem como a procura por alvos regulados pela fosfodiesterase de diguanilato cíclico PvrR. Serão utilizadas estratégias genéticas, bioquímicas e de biologia molecular, já implementadas em nosso grupo.

Este projeto foi financiado na modalidade Jovem Pesquisador, FAPESP, e permitiu o início da linha de pesquisa do grupo.