Eduardo Moraes Rego Reis.

O melanoma é uma das neoplasias mais agressivas e resistentes a terapias. Apesar dos avanços obtidos pelo desenvolvimento de terapias alvo, como inibidores de BRAF e de MEK, e imunoterapias, como anti-CTLA4 e anti-PD1, que resultaram no aumento da sobrevida de pacientes com melanoma maligno, cerca de 50 destes desenvolvem resistência aos tratamentos. A plasticidade fenotípica característica do melanoma, que recapitula mudanças fenotípicas que ocorrem durante a diferenciação de melanócitos a partir de células tronco da crista neural, contribui significativamente com a heterogeneidade tumoral e está correlacionada com pior sobrevida do paciente. A reativação de vias do desenvolvimento embrionário contribui com a adaptação a ambientes hostis, facilitando a progressão do melanoma, a disseminação metastática e a resistência terapêutica. Células de melanoma com programas transcricionais distintos foram descritas tanto em culturas celulares quanto em amostras de melanoma, inclusive em um mesmo tumor. As condições do microambiente tumoral, assim como as terapias, são capazes de modificar o estado fenotípico das células de melanoma, resultando na emergência de diferentes subpopulações celulares, incluindo células tolerantes ao tratamento e células dormentes. Análises de amostras de melanoma primário e metastático do mesmo paciente foram incapazes de identificar mutações causadoras ("driver") de metástase, apontando o papel de mecanismos epigenéticos no controle da mudança de fenótipos. Mudanças importantes na estrutura da cromatina associadas a alterações epigenéticas, como metilação do DNA, modificações de histonas e regulação por RNAs não codificantes, permitem mudanças rápidas e reversíveis na expressão gênica e são observadas na mudança de fenótipos do melanoma. Entre estes mecanismos, os RNAs longos não codificantes (lncRNAs) têm mostrado um papel central em circuitos epigenéticos que controlam processos biológicos complexos, como programas de desenvolvimento. Seus diversos mecanismos de ação incluem o direcionamento de enzimas modificadoras da cromatina a promotores específicos, formação de plataformas para recrutamento de complexos ribonucleoprotéicos, remoção de proteínas de sítios transcricionais, sequestro de miRNAs, ação como precursores de miRNAs, bloqueio de enhancers para a formação de alças de cromatina e impedimento da tradução de mRNAs, tornando os lncRNAs candidatos a reguladores efetivos da mudança dinâmica de estados transcricionais, sendo portanto alvos terapêuticos atrativos. Apesar do número crescente de estudos revelando estados transcricionais que definem subpopulações de células de melanoma de diferentes fenótipos, o conhecimento acerca das bases moleculares desta plasticidade ainda é escasso. A identificação de vulnerabilidades de células de melanoma de diferentes estados fenotípicos e, em especial, de reguladores da plasticidade fenotípica pode propiciar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas capazes de evitar o aparecimento de subpopulações resistentes. Uma vez que estados de desenvolvimento estão associados a resposta a terapias, uma estratégia possível seria alvejar lncRNAs que controlam estados celulares, sensibilizando células de melanoma a terapias como terapias alvo e imunoterapias.

A quimioterapia com gemcitabina faz parte da primeira linha de tratamento da doença invasiva e é usada como terapia adjuvante após remoção cirúrgica dos tumores ressecáveis. Porém o benefício clínico é extremamente limitado devido a aquisição de quimioresistência seguida de evolução para doença metastática. O objetivo deste projeto é investigar a existência de componentes da maquinaria epigenética que sejam críticos para o estabelecimento de resistência a gemcitabina. Linhagens tumorais de pâncreas serão interrogadas com uma biblioteca customizada de short hairpin RNAs que alveja cerca de 300 genes que codificam proteínas que regulam a cromatina. Células tumorais ?naȉve? ou selecionadas para resistência a gemcitabina serão transfectadas com a biblioteca e a seguir serão mantidas na presença de concentrações sub-letais da droga. A análise da representação diferencial de shRNAs específicos antes e após a seleção com a gemcitabina poderá revelar genes críticos para a sobrevivência do PDAC ou que sensibilizem as células tumorais ao tratamento com a droga. Os genes candidatos mais promissores serão validados individualmente em diferentes linhagens de PDAC e em uma coleção de xenotumores derivados de pacientes (PDXs) gerada em nosso laboratório. Espera-se obter informações originais e relevantes sobre o papel da maquinaria epigenética na aquisição de quimioresistência ao principal agente quimioterápico utilizado no PDAC, e apontar alvos promissores para serem explorados em combinação com a gemcitabina no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que aumentem a eficácia do tratamento e a sobrevida de pacientes com câncer de pâncreas.

Atividade de cooperação internacional no laboratório do Dr. Paul Boutros no Ontario Institute for Cancer Research (OICR) com bolsa da CAPES na modalidade Estágio Sênior com vigência de bolsa de 01/09/2015 a 30/09/2015 (Proc. 99999.005764/2015-07).
Durante o estágio foram discutidas estratégias para a análise de dados genômicos de tumores pancreaticos gerados no IQ-USP e sua integração com dados gerados pelo International Cancer Genomic Consortium, com participação de pesquisadores do OICR. 
Durante a vista foi feito o planejamento do curso teórico-prático de pós-graduação "Introduction to Genomics Informatics" que foi ministrado na USP entre os dias 19 e 22 de outubro de 2015 pelo Dr. Boutros e colaboradores do OICR.

O adenocarcinoma ductal do pâncreas (Pancreatic Ductal adenocarcinoma - PDAC) está entre as neoplasias mais letais, caracterizada pela ausência de esquemas terapêuticos eficazes além da remoção cirúrgica em estágios iniciais da doença. Neste trabalho iremos rastrear genes essenciais para a sobrevivência do PDAC empregando uma estratégia de silenciamento gênico com short hairpin RNAs (shRNAs), uma classe de RNA de interferência (RNAi). Para isto, células tumorais obtidas de pacientes com PDAC serão expandidas in vivo por meio da geração de xenotransplantes em camundongos severamente imunodeficientes. Culturas primárias derivadas dos xenotransplantes serão utilizadas para o rastreamento de vulnerabilidades genéticas utilizando bibliotecas de RNAi que alvejam centenas de genes simultaneamente. Inicialmente serão testadas bibliotecas de shRNAs que alvejam genes envolvidos na regulação da cromatina. Utilizando dessa abordagem esperamos identificar proteínas participantes da maquinaria epigenética cujo silenciamento afete significativamente a sobrevivência do PDAC, expondo assim potenciais novos candidatos à alvos farmacológicos para o tratamento da doença.

O câncer de pâncreas é uma das neoplasias mais letais e apenas 5% dos indivíduos afetados sobrevivem mais do que 5 anos após o diagnóstico. Isto se deve tanto à dificuldade em se obter um diagnóstico precoce, quanto à ausência de opções terapêuticas efetivas. O adenocarcinoma ductal (PDAC) é o tipo mais prevalente, sendo extremamente agressivo, e o único tratamento curativo disponível é a remoção cirúrgica do tumor se detectado em estadios iniciais da doença. Tumores císticos do pâncreas podem progredir para adenocarcinomas invasivos e atualmente não existem marcadores capazes de predizer com segurança sua evolução clínica. Para que o tratamento destas neoplasias se torne mais efetivo, é vital a identificação de novos biomarcadores que possibilitem o diagnóstico precoce da doença ou que permitam determinar o risco de lesões císticas evoluírem para tumores invasivos. Nesta proposta iremos estabelecer uma plataforma analítica para identificar alterações no perfil de expressão de RNAs (transcritoma) e na sequência de DNA (exoma) através do sequenciamento de alta-capacidade de RNA/DNA proveniente de amostras clínicas de tumores pancreáticos. Um aspecto original da proposta será a análise de RNAs nãocodificadores longos poliadenilados e nãopoliadenilados expressos em amostras de PDAC e tecido pancreático nãotumoral. Outro aspecto inovador será a utilização de biópsias de tumores de pâncreas obtidas através de ecoendoscopia aspirativa por agulha fina (EUS-FNA), um método minimamente invasivo, para a detecção de alterações somáticas no exoma. Investigaremos também o potencial diagnóstico de RNAs isolados de amostras do plasma e de líquido cístico de pacientes com tumores císticos de pâncreas. A análise integrada dos dados permitirá identificar genes, vias moleculares e módulos funcionais preferencialmente afetados por alterações somáticas ou transcricionais durante a transformação maligna e progressão de tumores de pâncreas. RNAs diferencialmente expressos e mutações somáticas com potencial relevância diagnóstica/clínica serão selecionados para avaliação em um painel independente de amostras de pacientes.

Evidências atuais indicam que a maior parte do genoma humano é transcrita em RNAs não-codificadores (ncRNAs) (Bertone et al., 2004; Kampa et al., 2004; Cheng et al., 2005; Johnson et al., 2005). Os estudos iniciais do projeto ENCODE, que analisaram apenas 1% do genoma humano, mostram que de 74 a 93% das bases são transcritas (Birney et al., 2007). As funções dos RNAs não-codificadores curtos, como microRNA e piRNA, estão sendo estudadas por vários grupos de pesquisa (O'Donnell and Boeke, 2007; Zhang et al., 2007). Entretanto, pouca atenção tem sido dada à caracterização funcional dos transcritos não-codificadores longos, inclusive os expressos a partir de íntrons de genes codificadores para proteínas. Embora na literatura exista um trabalho que descreve o envolvimento de um RNA intrônico (Saf) antisenso do gene Fas na regulação de splicing alternativo no mesmo locus (Yan et al., 2005), e um trabalho que descreve modificações globais no perfil de expressão gênica após super-expressão de seqüências intrônicas do gene CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) (Hill et al., 2006), a função exercida pelos mais de 55.000 RNAs não-codificadores (ncRNAs) que são transcritos nos íntrons de 74% de todos os genes presentes no genoma humano (Nakaya et al., 2007) permanece desconhecida.
Durante o desenvolvimento do projeto temático ?Identificação de marcadores moleculares para diagnóstico e prognóstico em câncer utilizando microarrays de DNA? (julho de 2004 a junho de 2008), o nosso grupo identificou vários transcritos longos intrônicos não-codificadores, cujos níveis de expressão estavam correlacionados ao grau de diferenciação de tumores de próstata (Reis et al., 2004). Em seguida, demonstramos que a expressão de uma série de transcritos intrônicos pode ser modulada por andrógeno (Louro et al., 2007) em uma linhagem de próstata. Na etapa seguinte, estudamos perfis de expressão intrônica em tecido normal de fígado e rim e tumores de próstata, usando microarray