Fausto Bruno dos Reis Almeida.

Cryptococcus neoformans é um patógeno fúngico encapsulado que causa meningoencefalite fatal. As vesículas extracelulares (EVs) desempenham um papel importante na biologia de todos os domínios da vida, incluindo os fungos. Em C. neoformans, as EVs são requeridas para o tráfego de moléculas cruzando pela cápsula e parede celular fúngica. Os mecanismos pelos quais C. neoformans modulam a resposta imunológica ainda não estão claros, mas nossos grupos têm estudado quinases e fosfatases como reguladoras da infecção cerebral em C. neoformans, e EVs como potenciais imunomoduladores de infecções fúngicas. Compreender as funções/efeitos das quinases e fosfatases relacionadas à fisiopatologia de C. neoformans é fundamental para entendermos a gênese da resposta imunológica do hospedeiro contra C. neoformans. Nesta proposta, pretendemos determinar o papel de quinases e fosfatases em EVs de C. neoformans na resposta imunológica do hospedeiro. Mais especificamente, propomos os seguintes objetivos: (1) Caracterizar a produção de EVs a partir de mutantes de C. neoformans para quinases e fosfatases; (2) Avaliar a capacidade mutantes de C. neoformans para quinases e fosfatases em modular a resposta imunológica do hospedeiro; (3) Analisar a expressão regulada de mediadores do hospedeiro em macrófagos infectados por mutantes de C. neoformans para quinases e fosfatases; (4) Avaliar a atividade fungicida de macrófagos expostos a mutantes de C. neoformans para quinases e fosfatases. O desenvolvimento desta proposta de pesquisa contribuirá diretamente para o nosso conhecimento sobre a fisiopatologia do C. neoformans. Nossa expectativa é identificar e propor novos alvos terapêuticos para o combate às infecções fúngicas.

O vírus da gripe aviária (AIV) é um dos vírus amplamente disseminados em aves, que ameaça a economia global e a saúde pública. As vesículas extracelulares (EVs) desempenham um papel importante na biologia de todos os domínios da vida. Durante infecções virais, os mecanismos pelos quais as EVs das células infectadas modulam o sistema imunológico do hospedeiro ainda são pouco explorados. Nossos grupos têm concentrado esforços para compreender a base patológica da virulência do AIV e como as VEs atuam como potenciais imunomoduladores. Nesta proposta, pretendemos determinar o papel das VEs derivadas de células infectadas pelo AIV na modulação da resposta imune. Mais especificamente, propomos os seguintes objetivos: (1) Caracterizar a produção de EVs a partir de células infectadas pelo AIV; (2) Avaliar a capacidade da produção de EVs a partir de células infectadas pelo AIV para modular a imunidade do hospedeiro; (3) Analisar a influência das EVs derivada de células infectadas pelo AIV na regulação da imunidade do hospedeiro. Compreender como as EVs derivadas de células infectadas pelo IAV modulam o sistema imunológico pode ser crucial para identificar novos alvos terapêuticos e desenvolver novas estratégias para combater o vírus influenza e outras infecções virais.

As Vesículas Extracelulares (VEs) desempenham um importante papel nos sistemas de exportação de moléculas. Elas atuam como veículos para a transferência de complexas cargas com amplas funções biológicas. As VEs cruzam a parede celular do fungo para alcançar o espaço extracelular e transportar os principais fatores de virulência, contribuindo para o sucesso da infecção fúngica. Uma vez que tivemos o projeto jovem pesquisador FAPESP fase 1, nosso grupo demonstrou que VEs fúngicas exercem importantes funções imunomoduladoras durante as interações fungo-hospedeiro e medeiam a comunicação celular intra espécie. Além disso, verificamos que VEs fúngicas também podem desempenhar papéis cruciais em relação à comunicação celular entre diferentes espécies. Essas observações motivam a proposta de estudar a comunicação celular interespécie de fungos e entender melhor o papel dos VEs fúngicas na imunomodulação e na comunicação celular. Mais especificamente, propomos fazer os seguintes objetivos: (1) esclarecer as propriedades imunomoduladoras de VEs produzidas por C. neoformans, P. brasiliensis, A. fumigatus e C. albicans; (2) dissecar as interações responsáveis das VEs produzidas por C. neoformans, P. brasiliensis, A. fumigatus e C. albicans na comunicação intra e interespécies por meio de diferentes abordagens. Nossa expectativa é que VEs fúngicas sejam responsáveis por importantes funções no processo de infecção fúngica. Assim, o desenvolvimento desta fase 2 do projeto jovem pesquisador FAPESP consolidará a linha de pesquisa de VEs iniciada pela FAPESP e proporcionará oportunidades para o desenvolvimento de novas estratégias contra infecções fúngicas.

Ferro apresenta uma posição central na interface patógeno-hospedeiro. Os mamíferos possuem sistemas de alta afinidade para sequestrar o ferro de patógenos e a resistência de patógenos à privação de ferro é um fator de virulência. Na privação de ferro, membros do complexo Paracoccidioides, agentes etiológicos da doença paracoccidioidomicose induzem sistemas de aquisição de ferro, incluindo a produção de sideróforos, a captação de heme e de ferro extracelular, processos regulados pelo fator de transcrição HapX. A despeito de estudos, pouco se sabe sobre: os mecanismos de captação e síntese de sideróforos, moléculas para captação extracelular de ferro, via de captação de heme da molécula de hemoglobina e genes que controlam a homeostase de ferro nesse patógeno. Nesse contexto, propomo-nos a cumprir os seguintes objetivos: caracterizar, ao nível molecular, mutantes de Paracoccidioides para o gene HapX; caracterizar moléculas envolvidas na captação extracelular de ferro e produção de mutantes silenciados para as mesmas; definir a via de secreção das proteínas extracelulares ligantes de ferro; investigar o papel de vesículas extracelulares durante a privação de ferro; avaliar, in vitro, a produção de mediadores inflamatórios e atividade celular de macrófagos estimulados com mutantes de Paracoccidioides para o gene HapX; explorar novos alvos para terapia antifúngica.

Ferro apresenta uma posição central na interface patógeno-hospedeiro. Os mamíferos possuem sistemas de alta afinidade para sequestrar o ferro de patógenos e a resistência de patógenos à privação de ferro é um fator de virulência. Na privação de ferro, membros do complexo Paracoccidioides, agentes etiológicos da doença paracoccidioidomicose induzem sistemas de aquisição de ferro, incluindo a produção de sideróforos, a captação de heme e de ferro extracelular, processos regulados pelo fator de transcrição HapX. A despeito de estudos, pouco se sabe sobre: os mecanismos de captação e síntese de sideróforos, moléculas para captação extracelular de ferro, via de captação de heme da molécula de hemoglobina e genes que controlam a homeostase de ferro nesse patógeno. Nesse contexto, propomo-nos a cumprir os seguintes objetivos: caracterizar, ao nível molecular, mutantes de Paracoccidioides para o gene HapX; caracterizar moléculas envolvidas na captação extracelular de ferro e produção de mutantes silenciados para as mesmas; definir a via de secreção das proteínas extracelulares ligantes de ferro; investigar o papel de vesículas extracelulares durante a privação de ferro; avaliar, in vitro, a produção de mediadores inflamatórios e atividade celular de macrófagos estimulados com mutantes de Paracoccidioides para o gene HapX; explorar novos alvos para terapia antifúngica.

Cryptococcus neoformans, agente etiológico da criptococose, é considerado o principal patógeno fúngico que acomete indivíduos imunocomprometidos. Esse microrganismo constitui um modelo singular para estudos de biologia celular, devido à sua característica única de ser um patógeno eucariótico dotado de cápsula polissacarídica. Além disso, C. neoformans produz vesículas extracelulares que contêm seus principais fatores de virulência. Essas vesículas atravessam a parede celular e alcançam o espaço extracelular, onde seus polissacarídeos parecem contribuir tanto para o crescimento da cápsula quanto para a entrega desses componentes aos tecidos do hospedeiro. A galectina-3, uma proteína ligante de carboidratos, participa da regulação fina de diversas funções imunológicas, incluindo adesão, migração e ativação celular, apoptose e secreção de citocinas, estando envolvida na resposta imune inata e adaptativa. Sob supervisão do Dr. Arturo Casadevall, no Albert Einstein College of Medicine (Nova Iorque), nosso grupo demonstrou que a galectina-3 exerce efeito lítico sobre as vesículas extracelulares de C. neoformans, além de termos observado níveis séricos elevados dessa proteína em camundongos infectados. Esses achados motivam a presente proposta, cujo objetivo é investigar o papel da galectina-3 no curso da criptococose experimental. Para isso, propomos: Comparar a sobrevida de camundongos selvagens e nocauteados para galectina-3 (galectina-3 KO) após infecção por C. neoformans; Avaliar parâmetros imunológicos e histopatológicos durante a infecção em ambos os grupos de animais; Analisar, por PCR em tempo real (PCR Array), a modulação de genes relacionados à resposta antifúngica durante a criptococose, comparando o perfil gênico de camundongos selvagens e galectina-3 KO. Nossa hipótese é que a galectina-3 desempenhe papel crucial na modulação da resposta imune do hospedeiro e no desfecho da infecção por C. neoformans.

Cryptococcus neoformans, agente causador da criptococose, é considerado o principal patógeno fúngico que acomete indivíduos imunodeprimidos. C. neoformans representa um modelo único para estudos de biologia celular, por sua singular característica de ser um patógeno eucarioto com cápsula polissacarídica. Além do mais produz vesículas extracelulares, as quais contém seus principais fatores de virulência. As vesículas cruzam a parede celular para alcançar o espaço extracelular, sendo seus polissacarídeos supostamente usados para possibilitar o crescimento da capsula ou facilitar sua entrega no tecido do hospedeiro. Galectina-3, uma proteína ligante de carboidrato, exerce o controle fino de várias funções imunológicas, incluindo adesão celular, migração, ativação, apoptose e secreção de citocinas, estando envolvida na resposta imune inata e adaptativa. Durante estágio pós doutoral no Albert Einstein College of Medicine de Nova Iorque sob supervisão do Dr. Arturo Casadevall, verificamos que galectina-3 exerce efeito lítico sobre as vesículas extracelulares de C. neoformans, bem como detectamos elevados níveis séricos de galectina-3 em camundongos infectados com C. neoformans. Essas observações motivam a presente proposta de estudar o papel de galectina-3 no curso da criptococose experimental, além de entender melhor o efeito de galectina-3 sobre as vesículas extracelulares produzidas por C. neoformans. Mais especificamente, propomo-nos a cumprir os seguintes objetivos: (1) dissecar as interações responsáveis pelo efeito lítico de galectina-3 sobre as vesículas extracelulares de C. neoformans, (2) investigar a expressão e distribuição de galectina-3 em tecidos de camundongos infectados por C. neoformans, (3) comparar a sobrevivência à infecção por C. neoformans entre camundongos selvagens e nocauteados (galectina-3 KO), (4) investigar o papel de galectina-3 no curso da infecção por C. neoformans em camundongos, através de parâmetros histopatológicos e imunológicos, (5) analisar comparativamente o perfil gênico da resposta imune inata do hospedeiro, durante a criptococose, por arranjo de PCR em tempo real (PCR Array), da modulação de genes relacionados a resposta antifúngica, bem como adicionalmente comparar com a modulação gênica do animal galectina-3 KO infectado por C. neoformans. Nossa expectativa é de que galectina-3 desempenhe importantes papéis no processo de infecção por C. neoformans.

Cryptococcus neoformans, agente causador da criptococose, é considerado o principal patógeno fúngico que acomete indivíduos imunodeprimidos. C. neoformans representa um modelo único para estudos de biologia celular, por sua singular característica de ser um patógeno eucarioto com cápsula polissacarídica. Além do mais produz vesículas extracelulares, as quais contém seus principais fatores de virulência. As vesículas cruzam a parede celular para alcançar o espaço extracelular, sendo seus polissacarídeos supostamente usados para possibilitar o crescimento da capsula ou facilitar sua entrega no tecido do hospedeiro. Galectina-3, uma proteína ligante de carboidrato, exerce o controle fino de várias funções imunológicas, incluindo adesão celular, migração, ativação, apoptose e secreção de citocinas, estando envolvida na resposta imune inata e adaptativa. Durante estágio pós doutoral no Albert Einstein College of Medicine de Nova Iorque sob supervisão do Dr. Arturo Casadevall, verificamos que galectina-3 exerce efeito lítico sobre as vesículas extracelulares de C. neoformans, bem como detectamos elevados níveis séricos de galectina-3 em camundongos infectados com C. neoformans. Essas observações motivam a presente proposta de estudar o papel de galectina-3 no curso da criptococose experimental, além de entender melhor o efeito de galectina-3 sobre as vesículas extracelulares produzidas por C. neoformans. Mais especificamente, propomo-nos a cumprir os seguintes objetivos: (1) dissecar as interações responsáveis pelo efeito lítico de galectina-3 sobre as vesículas extracelulares de C. neoformans, (2) investigar a expressão e distribuição de galectina-3 em tecidos de camundongos infectados por C. neoformans, (3) comparar a sobrevivência à infecção por C. neoformans entre camundongos selvagens e nocauteados (galectina-3 KO), (4) investigar o papel de galectina-3 no curso da infecção por C. neoformans em camundongos, através de parâmetros histopatológicos e imunológicos, (5) analisar comparativamente o perfil gênico da resposta imune inata do hospedeiro, durante a criptococose, por arranjo de PCR em tempo real (PCR Array), da modulação de genes relacionados a resposta antifúngica, bem como adicionalmente comparar com a modulação gênica do animal galectina-3 KO infectado por C. neoformans. Nossa expectativa é de que galectina-3 desempenhe importantes papéis no processo de infecção por C. neoformans.

Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, a micose profunda de maior prevalência na América Latina. Dentre os fatores próprios do fungo capazes de aumentar sua patogenicidade são mencionados lipídios, polissacarídeos e glicoproteínas. A glicosilação é importante para a secreção protéica, função, estabilidade e imunogenicidade. Glicanas N-ligadas a proteínas têm sido caracterizadas em diferentes espécies, de mamíferos a leveduras. Em leveduras de P. brasiliensis, N-glicanas exercem importante papel na atividade de N-acetil--D-glicosaminidase (NAGase) produzida, e estão diretamente envolvidas no crescimento e morfogênese fúngico. Exercem ainda considerável influência sobre a regulação da expressão de NAGase, a e -1,3-glucanase, a-1,4-amilase, bem como de outras enzimas relacionadas a biossíntese/degradação da parede celular de P. brasiliensis. O fato de N-glicanas influenciarem atividades biológicas de proteínas de P. brasiliensis, motiva-nos a investigar, de maneira mais global, os efeitos da inibição da N-glicosilação sobre o transcriptoma e proteoma de leveduras. Para tanto, propomo-nos a cumprir as seguintes metas: (1) avaliar o efeito da inibição de N-glicosilação (proporcionada pelo uso de tunicamicina) sobre o perfil transcricional de P. brasiliensis, por HSS (Hibridização Subtrativa Suprimida); (2) validar os genes diferencialmente expressos por PCR em tempo real (RT-qPCR); (3) avaliar o efeito da inibição de N-glicosilação sobre o perfil proteômico de P. brasiliensis, por 2D-DIGE (Bidimensional - Differential Gel Electrophoresis). Nossa expectativa é de que o cumprimento dessas metas permita que se investigue a existência de associação direta entre o processo de N-glicosilação com genes e proteínas relevantes para o crescimento, a morfogênese e a patogenicidade de P. brasiliensis.

Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, a micose profunda de maior prevalência na América Latina. Dentre os fatores próprios do fungo capazes de aumentar sua patogenicidade são mencionados lipídeos, polissacarídeos e glicoproteínas. A glicosilação é importante para a secreção protéica, função, estabilidade e imunogenicidade. Proteínas N-glicosiladas têm sido caracterizadas em mamíferos e em algumas leveduras. Em P. brasiliensis, a lectina paracoccina com afinidade por N-acetil-glicosamina e quitina, foi identificada como exercendo papel relevante na biogênese da parede e no crescimento fúngico. Além disso, demonstrou-se que paracoccina interage com macrófagos do hospedeiro, induzindo-os a liberarem altas concentrações de TNF-#945; e óxido nítrico. Mais recentemente, constatou-se que a paracoccina exerce ainda atividade de N-acetil--D-glicosaminidase (NAGase). O fato da molécula de paracoccina ser pesadamente glicosilada, somado a recentes evidências de que cadeias oligossacarídicas sejam requeridas para a atividade de algumas enzimas, motiva-nos a investigar o papel de N-glicanas em atividades desempenhadas por paracoccina, com ênfase às atividades NAGase e favorecedora do crescimento fúngico. Para tanto propomo-nos a cumprir as seguintes metas: (1) avaliação do efeito de tunicamicina (inibidor de N-glicosilação) no crescimento de P. brasiliensis; (2) avaliação do efeito de N-glicanas na atividade de NAGase(s) expressas pelo fungo; (3) avaliação do efeito de N-glicanas na atividade de NAGase de paracoccina; (4) caracterização do perfil estrutural e cinético da paracoccina nativa e desglicosilada; (5) tentativa de identificação de segundo mensageiro envolvido na atividade de NAGase, com ênfase ao AMPc. Nossa expectativa é de que o cumprimento dessas metas abra perspectivas para o esclarecimento da associação direta entre a expressão da molécula de paracoccina e o crescimento de P. brasiliensis.

Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da Paracoccidioidomicose, a micose profunda de maior prevalência na América Latina. Dentre os fatores próprios do fungo capazes de aumentar sua patogenicidade são mencionados lipídeos, polissacarídeos e glicoproteínas. Uma lectina de P. brasiliensis denominada paracoccina (70 kDa), com afinidade por N- acetil-glicosamina, foi identificada e localizada na superfície celular de leveduras. Essa lectina contribui para a adesão do fungo à matriz extracelular e induz macrófagos a produzir JHF-a e oxido nítrico em altas concentrações. Tais características justificam o investimento de esforços em sua caracterização bioquímica detalhada, através do cumprimento das seguintes metas: (1) investigação de atividade quitinolítica e de N-acetil-#946;-D-glicosaminidase; (2) otimização de sua purificação por afinidade a anticorpos específicos; (3) caracterização por eletroforese bidimensional e imunoblotting; (4) seqüenciamento polipeptídico com análise da seqüência de peptídeos tripsínicos por espectrometria de massa, (5) determinação da estrutura tridimensional da proteína recombinante; (6) analisar a ligação de paracoccina à superfície de macrófagos e avaliar cíneticamente o processo de internalização da lectina. O cumprimento dessas metas abrirá perspectivas para o estabelecimento da relação estrutura-função da molécula paracoccina e para o esclarecimento da correlação entre a sua expressão e a virulência de P. brasiliensis.

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