Isabel Kinney Ferreira de Miranda Santos.

FAPESP Auxílio Regular
A leishmaniose visceral (LV) é caracterizada por uma "tempestade de citocinas" e pode ser letal se não for tratada. A maioria das infecções com o agente etiológico é, no entanto, assintomática. Desnutrição e coinfecções com helmintos invasivos são fatores de risco conhecidos para LV. A atual dieta humana, insalubre, e o novo conceito da disfunção entérica ambiental (DEA) justificam reavaliar esses fatores. Perfis de N-glicanas de proteínas séricas afetam suas funções e são marcadores de padrão socioeconômico e de síndrome metabólica (SMet), doença inflamatória associada à translocação microbiana (TM). DEA também cursa com TM. A ativação imune crônica subsequente à TM associa-se a resposta imune deficiente. Em coorte de indivíduos controles ou infectados com L. infantum, de Teresina, PI, observamos que: a) pacientes com LV produzem padrões inflamatórios de N-glicanas em Fcs de IgGs; b) o transcriptoma de leucócitos do sangue periférico tem assinaturas indicando que células B diferem funcionalmente entre indivíduos que apresentam LV ativa ou curada ou infecções assintomáticas. Hipotetizamos agora que: SMet e DEA, frequentes na coorte, são fatores de risco para LV; perfis de N-glicanas de proteínas séricas associam-se a desfechos distintos de infecções por L. infantum; infestações com helmintos não invasivos protegem humanos contra SMet e, portanto, contra LV; perfis transcricionais de células B variam de acordo com desfechos de infecções por L. infantum. Temos soro, fezes, urina, e mRNA de células B purificadas e dados relevantes da coorte de Teresina. Avaliaremos assinaturas de: N-glicanas de proteínas séricas e de inflamação, SMet, DEA, TM e infecções com helmintos não invasivos. Geraremos e analisaremos transcriptoma de células B. Identificaremos biomarcadores para fatores de risco e orientar intervenções e diagnóstico de LV e obteremos informações para elucidar mecanismos de suscetibilidade à LV.

Uma vacina multicomponente, formulada com antígenos recombinantes derivados de proteínas salivares dos estágios de desenvolvimento do carrapato dos bovinos será testada em gado estabulado; três formulações compostas de diferentes conjuntos de antígenos serão testadas. Para avaliar o desempenho das diferentes formulações os seguintes parâmetros serão mensurados: carga e eficiência reprodutiva de carrapatos; sobrevida de larvas; imunogenicidade e indução de anticorpos; inocuidade.

A leishmaniose visceral (LV) pode ser fatal se não tratada e, embora hipergamaglobulinemia seja um dos sintomas clínicos em pacientes com LV, a real contribuição de anticorpos na progressão da doença permanece desconhecida. Funções efetoras e reguladoras de anticorpos dependem de sua interação com receptores Fc dos tipos I e II~ essas interações, por sua vez, são reguladas por padrões de N-glicanas ligadas à porção Fc de anticorpos. Demonstramos recentemente que, em comparação com indivíduos saudáveis, os perfis globais de N-glicosilação da região Fc de IgG estão alterados significativamente em pacientescom LV. Em conjunto com reguladores da resposta imune (citocinas e proteína C reativa) presentes no soro dos indivíduos estudados, demonstramos que esses perfis de glicosilação podem predizer categorias de gravidade de LV. Observamos queapós o tratamento de LV os perfis de glicosilação de IgG aproximam-se daqueles de indivíduos saudáveis. Em vista disso propomos avaliar o papel dos perfis de glicosilação de IgG na patogênese da LV e os mecanismos que atuam nessas alteraçõespor meio das seguintes estratégias: (i) análise da expressão gênica de células B isoladas de pacientes estratificados em categorias de gravidade e a associação com títulos de IgGs específicos para antígenos de leishmanias e perfis de N-glicosilação de Fc~ (ii) baseado no conhecimento gerado na meta (i), testaremos a viabilidade e eficácia de estratégias de terapia em um modelo de LV progressiva em hamsters. Inocularemos preparações de imunoglobulina intravenosa (IVIG) enriquecidas para ácido siálico em hamsters infectados cronicamente com L. infantum, avaliando os efeitos dos tratamentos na doença. Havendo recursos também faremos a deglicosilação enzimática da região Fc de IgG. Obteremos, assim, mais conhecimento sobre a influência de perfis de glicosilação da região Fc de IgG em mecanismos de progressão e gravidade da LV.

Não é necessário apresentar argumentos para esta chamada sobre a importância da leishmaniose para
a saúde pública no Brasil. É necessário, contudo, apontar as lacunas que ainda existem no
conhecimento sobre os mecanismos de imunidade inata e adquirida que resultam nos diferentes
desfechos clínicos da infecção com L. infantum. Antes da infecção, porém, ocorre um passo
fundamental no estabelecimento da infecção que é a atração exercida pelo hospedeiro vertebrado
sobre o artrópode hematófago vetor do protozoário que o procura para fazer seu repasto sanguíneo.
Esse aspecto da leishmaniose visceral também carece de conhecimento científico suficiente para
desenvolver controle eficaz do vetor. Em relação à imunidade adquirida contra L. infantum, o papel dos
anticorpos no desfecho da infecção ainda não está bem estabelecido, como será argumentado em
detalhes adiante. Resultados do grupo proponente mostram que os perfis de glicanas da região Fc de
IgG estão profundamente alterados na doença e, ainda, que se correlacionam com a severidade clínica.
De fato, os perfis de glicanas de imunoglobulinas estão sendo manipulados para controlar diversas
doenças de base inflamatória. É importante ressaltar que estudos recentes demonstram que o
agravamento do calazar está associado com descontrole da resposta inflamatória. Essa situação
levanta a possiblidade de fazer um novo tipo de intervenção farmacológica no calazar grave,
especificamente infusão com gamaglobulina endovenosa. A fim de avaliar esse tratamento potencial
para controlar a inflamação desregulada no calazar, avaliaremos os perfis de glicans de Fc de IgG em
hamsters infectados por via intracardíaca e natural e tratar os hamsters doentes com preparados de
IgG enriquecidos para perfis de glicanas anti-inflamatórios. Em relação à interface Lu. longipalpishospedeiro
vertebrado e a atraentabilidade maior ou menor do hospedeiro para o vetor, existem
relativamente poucos trabalhos sobre a comunicação química entre eles e apenas uma pesquisa sobre
o papel da microbiota cutânea do hospedeiro no controle da infecção cutânea com L. major. No entanto,
a microbiota da pele, além de determinar a imunidade local contra Leishmania, também participa de
modo muito importante na produção de sinais químicos para vetores de doenças, conforme dita a
hipótese da fermentação para a comunicação química entre seres vivos. Esse papel da microbiota ainda
não foi investigado em relação à transmissão de L. infantum pelo Lu. longipalpis. É importante conhecer
esses aspectos da transmissão porque podem orientar intervenções para controlar a disseminação do
calazar. A fim de estabelecer o papel da microbiotana geração de semioquímicos potenciais para o
vetor acompanheremos os perfis microbinaos com abordagens genômicas em hamsters antes e depois
da infecção, determinaremos os perfis químicos de volatéis e sebos de pele e determinaremos a
atraetabilidade de hamsters tratados com componentes químicos diferencilamente representados nos
dois grupos de hospedeiros e em hamsters tratados com desinfetantes e antibióticos.

Metabolitos derivados do metabolism não protéico do triptofano (TRY) afetam processos neurológicos, comportamentais, imunológicos e semioquimicos em vertebrados e em artrópodes. No entanto, quase nada é conhecido sobre seu papel nos carrapatos e nas respostas dos hospedeiros às picadas desse ectoparasita. A fim de elucidar os mecanismos de imunidade contra carrapatos nós exploramos um modelo de fenótipos contratantes de infestações que diferentes raças de bovinos apresentam e no qual perfilamos a expressão gênica global em pele infestada e não infestada por carrapatos. A análise funcional dos genes diferencialmente expressos com Metacore indicou que o metabolism de TRY é um componente muito significativo tanto das reações locais aos carrapatos quanto dos desfechos distintos apresentados pelos fenótipos contrastantes. Neste projeto confirmaremos e elucidaremos o papel do metabolism do TRY nas infestações com carrapatos no nosso modelo. Para tanto quantificaremos a expressão de genes candidatos em pele e em leucócitos de sangue de bovinos infestados controladamente com um arranjo de PCR contruído especificamente para este fim e curado pelo Metacore e pela nossa garimpagem da literatura. Mediremos metabolitos de TRY na pele, urina e sangue de animais infestados e livres de carrapatos e caracterizaremos os componentes químicos obtidos de esfregaços de pele. Também interferiremos em pontos seletos do metabolismo do TRY e depois mediremos em bovinos antes e depois de infestações controladas os seguintes parâmetros: o desfecho metabólico na pele, urina e sangue; o desfecho das infestações; o desfecho do ciclo do folículo piloso, a expressão dos genes candidatos; a inflamação de pele. Em cruzamentos entre raças que apresentam fenótipos extremos de infestação (Girolandos) também sequenciaremos produtos de PCR dos principais genes identificados nos estudos de expressão gênica. Procuraremos por polimorfismos únicos de nucleotídeos nesses produtos e examinaremos se estão associaidos significativamente com os fenótipos de infestação, com níveis de metabolitos de TRY e com produção de semioquímicos. Esperamos gerar evidências de que o metabolismo do TRY tem um papel na resistência aos carrapatos.

O carrapato do boi, Rhipicephalus microplus, é o principal empecilho para o avanço da produção pecuária e causa enormes prejuízos econômicos. O método atual de controle depende de acaricidas, contra os quais carrapatos desenvolvem níveis alarmantes de resistência e que deixam resíduos em produtos e no meio ambiente. Durante a infestação, uma grande quantidade de imunoglobulinas acaba sendo ingerida. Consequentemente, como mecanismo de defesa e com o objetivo de auxiliar o repasto sanguíneo realizado pelas fêmeas, carrapatos machos Ixodidae, secretam proteínas ligantes de IgG (IGBPs) contidas na sua saliva, teoricamente interferindo na ligação específica de anticorpos com o patógeno, na ativação do complemento e no posterior processo de fagocitose. Cada uma das diferentes raças bovinas possui uma peculiar distribuição de alótipos de IgG e, ao mesmo tempo, frente às infestações por carrapatos, tais raças se comportam de maneira igualmente distinta. Já é conhecido haver ligação diferencial entre os diversos alótipos de IgG às IGBPs de patógenos e às proteína do sistema imune como complemento e receptores de Fc de fagócitos. Sendo assim, o presente trabalho tem por objetivo avaliar a natureza da ligação da IGBP-C de R. microplus com alótipos de IgGs bovinas visando acrescer estudos e pesquisas a essa importante vertente no desenvolvimento de estratégias de controle de afecções, como as decorrentes da infestação por carrapatos na espécie bovina.

Ticks have major impacts on animals and humans, worldwide. As well as transmitting disease, ticks lead to weight loss, anaemia and secondary infections. Acaricides are used for tick control, but this is problematic due to acaricide-resistance and chemical residue issues. But animals differ substantially in tick load, and this is genetically controlled. We hypothesize that the primary means by which host cattle differ in tick resistance is via their semiochemicals profiles, i.e. attractant/repellent volatile chemicals on the skin surface. We will perform a genome-wide association study (GWAS) for tick resistance, characterize semiochemicals which differ between cattle with high and low tick infestations (resistant and susceptible animals), identify genes differentially expressed between resistant and susceptible animals, integrate the results to obtain insights into the genetic and biochemical basis of tick resistance, and devise control options. The GWAS will be performed on >1000 Girolando cattle in Brazil, which will have been intensively phenotyped for tick burden with detailed epidemiological data (to identify risk factors). GWAS will be performed using data from the high density bovine SNP chip, giving >750,000 genotypes per animal, and analysed with current state-of-the-art techniques. From skin rubbings from animals with extreme tick counts, semiochemical profiles will be characterised using high resolution chromatography (GC, HPLC) and spectroscopic analysis. Gene expression will be performed using RNAseq on skin biopsies from extreme animals, before and after infestation, and pathways co-expressed with resistance determined. Together these data will inform on true extent of genetic control, underlying mechanisms and indicate actual loci contributing to variation. Validated SNPs for resistance will be identified, as will potential semiochemicals to be used as repellents.

Antecedentes: O carrapato do boi, Rhipicephalus microplus, apresenta uma enorme preferência por bovinos, mas raças zebuínas são altamente resistentes a infestações com esse parasita. A especificidade do vetor por hospedeiros é ditado pelo repertório de semioquímicos produzidos pelos hospedeiros e que pode diferir entre bovinos apresentando fenótipos contrastantes e herdáveis de infestações com carrapatos. Muitos semioquímicos são gerados por meio da ação da microbiota da pele sobre secreções dos hospedeiros. A diversidade e abundância da microbiota de nichos anatômicos de camundongos e humanos é determinado pela composição genética de indivíduos, é correlacionada com a expressão de diferentes peptídeos antimicrobianos e resulta em atratividade diferenciada a vetores. Resultados Preliminares: 1) genes que codificam peptídeos antimicrobianos são expressos diferencialmente entre pele de bovinos geneticamente resistentes ou suscetíveis ao carrapato; 2) a composição do microbioma fecal dessas raças apresenta diferenças significativas na abundância de certos gêneros; 3) esfregaços de pele das raças apresenta diferenças na atraentabilidade para R. microplus. Objetivos: Descrever o microbioma de pele de duas raças comerciais de bovinos que são geneticamente resistentes ou suscetíveis ao R. microplus. Métodos: Genes de rRNA 16S serão amplificados em DNA extraído de micróbios de pele empregando-se primers para as regiões V5-V6 16S RNA seguido de pirossequenciamento. Índices de diversidade e abundância microbiana serão extraídos. Posicionamentos taxonômicos serão atingidos em nível de filo, família e gênero. Analisaremos a literatura disponível para cada gênero representado diferencialmente a fim de determinar se há diversidade que possa gerar semioquímicos que afetam o comportamento de carrapatos. Resultados Esperados: Determinaremos se existem diferenças na composição do microbioma de pele de duas raças de bovinos que apresentam fenótipos contrastantes e herdáveis de infesta

Analyses of a salivary gland transcriptome of the cattle tick, Rhipicephalus microplus, revealed expressed sequence tags similar to the nonstructural proteins NS3 and NS5 of viruses of the Flaviviridae. This similarity was validated by bioinformatics and the virus was isolated in cell culture. The isolated virus replicated in invertebrate and vertebrate cells. Phylogenetic analysis identified the virus as more related to Tamana bat virus than to other viruses from the genus Flavivirus. Molecular detection of these sequences indicate that the new putative Flaviviridae member is present in many tick samples collected in different farms located in the Midwest, Southeast, and South of Brazil. We propose that this new virus be designated Mogiana tick virus (MGTV). This is the first report of the presence of Flavivirus transcripts in R. microplus ticks. The transmission dynamics of this new tick virus must be understood in order to monitor emerging tick-borne zoonotic viral diseases.

As infestações por Rhipicephalus microplus, o carrapato do boi, causam enormes prejuízos à pecuária. Carrapatos induzem resposta imune em seus hospedeiros, portanto o controle imunobiológico é possível. Devido à baixa eficácia de vacinas anti-carrapato comerciais têm se buscado novos antígenos protetores e os mecanismos imunes que protegem contra fortes infestações. O grupo de pesquisa em carrapatos da FMRP-USP tria antígenos candidatos selecionados por meio de análise comparativa do transcriptoma de carrapatos alimentados em hospedeiro resistente ou suscetível, sendo que quatro antígenos salivares recombinantes já foram testados como vacina anti-carrapato multicomponente para bovinos. A vacina induziu produção de anticorpos e reduziu significativamente parâmetros parasitológicos da infestação (eficácia de 73,2%). Uma visão global dos processos moleculares envolvidos durante a imunização e a infestação dos bovinos vacinados e do grupo controle (que recebeu apenas adjuvante/salina) gerará informações importantes para o entendimento dos mecanismos imunes envolvidos na interface carrapato/hospedeiro e na resposta à vacina. Desse modo, esta proposta tem por objetivo analisar o transcriptoma de leucócitos do sangue periférico desses animais. O transcriptoma foi obtido por RNA-seq e os dados gerados serão analisados por ferramentas de bioinformática (Data Ranger e Metacore) para identificação dos genes diferencialmente expressos e dos processos biológicos associados tanto à imunidade protetora conferida pela vacina e quanto à infestação em si. Resultados relativos aos processos biológicos associados a infestações serão validados em populações distintas de bovinos por meio de arranjos de PCR.

É intrigante o fato da maioria das infecções por Leishmania infantum, o agente etiológico da leishmaniose visceral (LV ou calazar), não resultar em doença. O consenso científico é o de que anticorpos não possuem papel relevante contra o desenvolvimento de LV e que até participariam dos mecanismos de susceptiblidade à doença. Estudos recentes contestam, porém, esse ponto de vista. Este projeto testará a hipótese de que indivíduos portadores de infecções assintomáticas de L. infantum permanecem assim porque produzem anticorpos cujas propriedades funcionais diferem daquelas dos anticorpos produzidos por indivíduos que desenvolvem LV. Estudará a reatividade de soros de humanos e cães apresentando VL ou infecções assintomáticas e de controles não infectados. Soros humanos serão estratificados de acordo com idade a fim de verificar, com ELISAs, se a imunidade a proteínas salivares secretadas do inseto vetor, Lutzomia longipalpis, induzida or meio da exposição crescente a suas picadas, participa na imunidade contra LV. ELISAS e imunoblots serão empregados para determinar os padrões da resposta IgG específica (títulos, subclasses e reatividade com proteínas do patógeno e vetor separadas eletroforeticamente) e a correlação destes com os desfechos clínicos. A descrição dos padrões da imunidade mediada por anticorpos IgG será refinada sondando-se os soros com um microarranjo contruído com 3000 proteínas oriundas de L. infantum e Lu. longipalpis. As protéinas a serem incluídas no microarranjo foram ou serão determinadas por meio de vacinologia reversa do genoma de L. infantum e de transcriptomas de intestino médio e glândulas salivares de Lu. longipalpis infectadas, ou não, com L. infantum. Grupamentos hierárquicos dos perfis de reatividades entre anticorpos e antígenos da sonda serão obtidos por meio do teste k-médias a fim de identificar conjuntos de antígenos que formularão futuras vacinas anti-LV. Os resultados também levantarão novas hipóteses sobre o papel de anticorpos n

Justificativa e Antecedentes. Vacinas anti-carrapato comerciais formuladas com antígenos ?ocultos?, ou não-salivares, apresentam pouca eficácia e baixa memória imunológica. A saliva do carrapato é mediador crucial do parasitismo e contém, portanto, alvos vacinais. Estudo do transcriptoma de glândulas salivares obtidos de R. microplus alimentados em bovinos geneticamente suscetíveis ou resistentes ao parasita revelou 22 genes cuja expressão foi afetada negativamente pela homeostasia do bovino resistente. Ainda, soros de bovinos geneticamente resistentes e suscetíveis ao carrapato e imunes por meio de infestações reconhecem perfis distintos de proteínas salivares de R. microplus, sendo apenas 20% do salivoma reconhecido. Hipóteses. 1) Proteínas secretadas na saliva do carrapato constituem antígenos mais eficazes do que antígenos ocultos porque permitem manter a memória imunológica quando da re-exposição do bovino vacinado a carrapatos e porque a saliva medeia os mecanismos do parasitismo; 2) Uma vacina anti-carrapato deve induzir anticorpos que neutralizem componentes seletos da saliva do parasita; 3) as proteínas salivares silenciosas, que não são imunogênicas durante infestações naturais, podem mediar os mecanismos de parasitismo e por isso constituem os melhores antígenos. Devem, portanto, ser caracterizados. Objetivos e Metodologia: 1) Por meio de sequenciamento de bibliotecas de cDNA em plataforma 454 Titanium aumentar o banco de ESTs de glândulas salivares de carrapatos para facilitar estudos proteômicos; 2) Por meio de MudPIT descrever, de forma comparativa, o proteoma de saliva e de glândulas salivares de ninfas e adultos alimentados em bovinos geneticamente suscetíveis ou resistentes ao carrapato; 3) Por meio de western blots de géis de proteínas separadas eletroforeticamente em duas dimensões com tecnologia DIGE descrever, de forma comparativa, os imunosalivomas de ninfas e adultos alimentados em bovinos geneticamente suscetíveis ou resistentes ao carrapato