Adriano Rodrigues Azzoni.

Neste Projeto, a síntese de nanopartículas de ouro (AuNPs) será estudada, em sistemas convencionais e microfluídicos, buscando-se avaliar a influência de diferentes parâmetros de processo (concentração de reagentes, temperatura, tempo de residência e características do reator) sobre o tamanho, a carga superficial e a forma das nanopartículas. Essas AuNPs serão então funcionalizadas com mRNAs e a eficiência de entrega para células será estudada em ensaios in vitro.

O objetivo desse Projeto é estudar a síntese controlada e reprodutível de AuNPs que apresentem características físico-químicas diversas tendo em vista a funcionalização com RNAs mensageiros (mRNAs) visando ao desenvolvimento de novas plataformas vacinais.

Projeto n.º 2018/14047-2 aprovado na modalidade do Programas de Inovação Tecnológica / PITE - Programa de Apoio à Pesquisa em Parceria para Inovação Tecnológica / PITE - Modalidade 1 - Fluxo Contínuo da FAPESP em 02/01/2020

A baixa eficiência de transferência de ácidos nucleicos para o interior de células tumorais continua a ser um problema limitante em estudos de terapia gênica para o tratamento do câncer. Isso tem origem na dificuldade de direcionamento e transporte das moléculas terapêuticas do exterior para o interior das células alvo, devido à presença de barreiras físicas, enzimáticas e difusionais. Nosso grupo de pesquisa tem, ao longo dos últimos anos, desenvolvido proteínas recombinantes multifuncionais especialmente desenhadas para entrega gênica, buscando mimetizar a habilidade dos vírus de explorar as sinalizações e respostas extra- e intra-celulares para infectar as células. O principal objetivo deste projeto é o desenvolvimento e caracterização de novas proteínas recombinantes multifuncionais, capazes de se auto-organizar em nanopartículas e realizar eficientemente o transporte de material genético (DNA plasmidial ou RNA de interferência) para o interior de células tumorais. Para esse fim, nanopartículas serão formadas combinando-se pDNA ou siRNA e proteínas especificamente desenhadas para facilitar o direcionamento, entrada na célula e tráfego intracelular de ácidos nucleicos. Espera-se, dessa forma, a obtenção de nanopartículas pDNA-Proteína e siRNA-Proteína capazes de eficientemente proteger, direcionar, facilitar a entrada na célula e o tráfego intracelular de transgenes.

Auxílio Jovens Docentes da Escola Politécnica da USP. O projeto visa ao desenvolvimento de nanopartículas compostas por metais e proteínas com o objetivo de entrega de drogas e ácidos nucleicos.

As atividades de pesquisa estão direcionadas para a área de microfluídica, que é a ciência e tecnologia que envolve a manipulação de dispositivos em escala micrométrica e trabalha com escoamento de pequenas quantidades de fluidos, que circulam em microssistemas artificiais fabricados utilizando materiais específicos. Nessas características de escoamento, é possível o controle de forma reprodutível de moléculas no tempo e no espaço, permitindo várias aplicações. Uma importante aplicação é na terapia gênica, que baseia-se na ideia de realizar o tratamento de determinadas doenças através da inserção de um gene terapêutico em células alvo ou diretamente nos pacientes. Nesse contexto, a microfluídica é promissora para a obtenção de lipossomas e nanopartículas poliméricas (quitosana), e de poliaminoácidos. Na área de bioprocessos, a microfluídica pode ser utilizada como ferramenta para seleção de condições ótimas de crescimento microbiano e também para imobilização de biocatalisadores. Nesse sentido, esse projeto de pesquisa apresenta 6 subprojetos do LaNBDA inseridos em duas linhas de pesquisa: (i) Microfluídica e Nanobiotecnologia para aplicação em terapia gênica, visando a produção de lipossomas incorporando siRNA (Projeto I) e novos métodos de transfecção in vitro em ambiente microfluídico (Projeto II); nanopartículas de quitosana e quitosana glicosilada (Projeto III); nanopartículas baseadas em poliaminoácidos (Projeto IV); e Microfluídica e Biotecnologia para o desenvolvimento de técnicas de seleção das condições ótimas de crescimento microbiano (Projeto V) e imobilização de microorganismos (Projeto VI). Dessa forma, esse projeto visa contribuir na área de microfluídica, mais especificamente para aplicações em terapia gênica e no desenvolvimento de ferramentas e processos na área de biotecnologia, além de formar recursos humanos nessas respectivas áreas.

A baixa eficiência de transferência gênica é um problema recorrente na utilização de vetores não-virais em estudos de terapia gênica e vacinação por DNA. Isso surge, principalmente, pela dificuldade de transporte do DNA estrangeiro do exterior para o núcleo das células alvo, devido à presença de inúmeras barreiras físicas, enzimáticas e difusionais. O principal objetivo do projeto aqui proposto é o desenvolvimento e caracterização de novos vetores não-virais multifuncionais, capazes de realizar eficientemente a entrega de material genético (DNA plasmidial, pDNA) no núcleo de células de mamífero. Para esse fim, partículas serão formadas combinando-se pDNA, nanopartículas metálicas (NPMs de ouro e prata) e proteínas especificamente desenhadas para facilitar o tráfego intracelular de DNA plasmidial. Espera-se, dessa forma, a obtenção de complexos ternários pDNA-Proteína-NPMs capazes de eficientemente condensar, proteger, facilitar a entrada na célula e o tráfego intracelular de transgenes.

Projeto de pesquisa multidisciplinar que busca o desenvolvimentos de novas estratégias para uma vacina contra o vírus da raiva

Avaliação in vitro e in vivo de complexos formados por pDNA e proteínas recombinantes. Buscou-se conhecer os mecanismos envolvidos na entrada na célula e tráfego intracelular, com a colaboração da Profa. Neus Ferrer-Miralles da UAB, Barcelona, Espanha. Pretendeu-se também avaliar o potencial de aplicação in vivo, em um modelo de tumor induzido por HPV, através da colaboração com o Prof. Luiz Carlos Ferreira, do ICB, USP.

O objetivo deste projeto é o desenvolvimento de partículas especialmente projetadas para entrega gênica, simulando as características que conferem aos vírus a capacidade de eficientemente transportar material genético até o núcleo de células de mamíferos. Essas partículas serão formadas por DNA plasmidial, proteínas recombinantes e lipídeos, cada molécula desempenhando um papel específico no tráfego extra e intracelular.

Este projeto visa ao desenvolvimento tecnológico de processo microfluídico para a obtenção de vetores não virais, baseados na complexação eletrostática entre lipossomas catiônicos e DNA destinados à terapia e vacinação gênica e comparação com o processo convencional bulk . Este último processo, o qual utiliza tanque agitado ou sistema de vórtice, pode produzir variações nos resultados biológicos e na estabilidade coloidal, refletindo a dificuldade no controle do tamanho destas estruturas. Já o processo microfluídico, que utiliza dispositivos que processam pequenas quantidades de fluidos (10e-9 a 10e-18 litros), permite a complexação eletrostática em fluxo contínuo, com o controle das condições difusionais

Desenvolvimento de processo de purificação de DNA plasmidial através de cromatografia de interação hidrofóbica

Desenvolvimento de proteínas recombinantes de fusão desenhadas especificamente para "gene delivery". Aplicando-se técnicas de engenharia de proteínas, busca-se o desenvolvimento de vetores multifuncionais capazes de aumentar a eficiência de entrega de transgenes no núcleo das células alvo. Trata-se Auxílio Jovem Pesquisador FAPESP.

Desenvolvimento de vetores não virais mais resistentes à ação de nucleases e, portanto, mais eficientes, através de técnicas de mutagênese sítio-dirigida. Desenvolvimento de técnicas de acompanhamento e quantificação da expressão gênica e tráfego intracelular de plasmídeos em células de mamífero.

Participação nos estudos desenvolvidos pela doutoranda Joana A. Carvalho para a criação de vetores de expressão (plasmídeos) mais eficientes através do uso de sequencias de direcionamento intracelular do antígeno explorando-se os mecanismos intracelulares de apresentação e processamento (MHC II pathway). O estudo está inserido no desenvolvimento de um protótipo de vacina de DNA contra a "doença do sono" com base em modelo animal efetuado no CEBQ-IST.