Marcia Regina von Zeska Kress.

Detalhamento: (programa com bibliografia)
(i)	Obtenção e manipulação de DNA, RNA, proteínas e metabólitos secundários de fungos filamentosos; 
(ii)	Isolamento e identificação de metabólitos secundários;
(iii)	Ensaio de citotoxicidade em bactérias e fungos;
(iv)	Avaliação da expressão gênica por PCR quantitativo relacionada aos metabólito secundário isolado. 

Bibliografia:
Sambrook J. e Russell D.W. Molecular Cloning, A laboratory Manual, 3rs edition, 2001.
Sidrim J.J.C. e Rocha M.F.G. Micologia médica à luz de autores contemporâneos, Ed. Guanabara e Coogan, 2004.
Bos C.J. Fungal Genetics: principles and practice. Mycology series, v.13, Marcel Dekker Inc., 1996.
Maheshwaru R. Fungi: Experimental Methods in Biology. CRC Press, 2005.
Goldman G.H. e Osmani S.A. The Aspergilli: Genomics, Medical Aspects, Biotechnology, and Research Methods. Mycology, v.26, CRC Press, 2008.

Detalhamento: (programa com bibliografia)
(i)	Obtenção e manipulação de DNA, RNA e proteínas; 
(ii)	Transformação de fungo filamentoso e bactéria; 
(iii)	Southern e western blot; 
(iv)	Transcriptômica (microarray e qPCR); 
(v)	Proteômica (purificação de complexos protéicos e gel bidimensional).
Bibliografia:
Sambrook J. e Russell D.W. Molecular Cloning, A laboratory Manual, 3rs edition, 2001.
Sidrim J.J.C. e Rocha M.F.G. Micologia médica à luz de autores contemporâneos, Ed. Guanabara e Coogan, 2004.
Todd R.B., Davis M.A., Hynes M.J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols, 2(4), 811-821, 2007.
Bos C.J. Fungal Genetics: principles and practice. Mycology series, v.13, Marcel Dekker Inc., 1996.
Maheshwaru R. Fungi: Experimental Methods in Biology. CRC Press, 2005.
Goldman G.H. e Osmani S.A. The Aspergilli: Genomics, Medical Aspects, Biotechnology, and Research Methods. Mycology, v.26, CRC Press, 2008.

Os microrganimos e seu equilíbrio no corpo humano são necessários para manter um indivíduo saudável. Uma vez que este equilíbrio é rompido, ocorre o crescimento excessivo de agentes patogênicos. Diversos fatores levam a este desequilíbrio, um deles é pela mutação no gene do Regulador de Condutância Transmembrana da Fibrose Cística que causa a interrupção da transferência normal dos íons cloro e sódio através das membranas celulares que levam a desidratação e consequentemente aumento da viscosidade das secreções celulares, que pode ocasionar falência do clearance mucociliar pulmonar de pacientes com Fibrose Cística (FC). O estudo dos microbiomas vem sendo facilitado pela tecnologia do sequenciamento de nova geração, capaz de inclusive sequenciar material genético de microrganismos não cultiváveis. O presente projeto tem por objetivo estudar por metagenômica, o microbioma (bactérias e fungos) do pulmão de pacientes com fibrose cística antes e após antibioticoterapia; conhecendo os fungos e bactérias presentes bem como inventariar os genes relacionados a virulência, resistência a antimicrobianos e outros. Adicionalmente, estudar isolados clínicos dos fungos filamentosos patogênicos dos gêneros Aspergillus e Fusarium de vários sítios anatômicos, inclusive do escarro de pacientes com FC. A identificação molecular pelo estudo do seu material genético, susceptibilidade aos antifúngicos e terapia fotodinâmica antimicrobiana com fotossensibilizadores fenotiazínicos, estudo dos fatores de virulência e virulência em modelo experimental Galleria mellonella trarão informação importantes quanto ao perfil destes microrganismos fúngicos causadores de infecção. Os resultados aqui obtidos possibilitarão uma visão crítica e auxiliarão na tomada de decisão clínica sobre a melhor abordagem terapêutica.
Palavras chave: microbioma, metagenômica, fibrose cística, fatores de virulência, terapia fotodinâmica antimicrobiana.

As espécies de fungo filamentoso dos gêneros Fusarium e Fonsecae estão entre os mais importantes causadores de micoses oportunistas em humanos. O aumento crescente da tolerância aos fungicidas utilizados e a emergência de novas espécies de fungos patogênicos tornam extremamente necessários à identificação e o desenvolvimento de novas estratégias para o controle desses patógenos, com mecanismos de ação diferentes dos já existentes. A inativação fotodinâmica (IF) surge como uma alternativa promissora ao uso de fungicidas convencionais. A IF envolve a utilização de um fotossensibilizador (FS) que acumula preferencialmente nas células-alvo e é ativado por exposição à luz com comprimento de onda adequado. A ativação do FS na presença de oxigênio molecular induz a geração de espécies reativas de oxigênio, que são capazes de danificar virtualmente todas as biomoléculas, provocando a morte da célula microbiana. Apesar de promissor, a IF ainda é pouco utilizada para o tratamento de micoses. Os principais objetivos desse projeto são: (1) avaliar a eficácia da IF com os FS fenotiazínicos na inativação de conídios, macroconídios, microconídios e clamidósporos das diferentes espécies; (2) Estudar as interações entre os diferentes FS em estruturas especializadas das diferentes espécies e determinar a localização intracelular dos FS; (3) Determinar os efeitos da IF com os diferentes FS na integridade da parede celular e membrana plasmática; na integridade do núcleo e do material genético e determinar o efeito da IF na transcrição de genes relacionados à recuperação de danos causados por estresse oxidativo.

O fungo filamentoso Scytalidium spp. é um microrganismo saprofítico e fitopatogenico, encontrado no solo e vegetação de clima tropical e subtropical. Este gênero encontra-se dentre os principais agentes filamentosos não dermatófitos causadores da doença, juntamente com os gêneros Scopulariopsis, Fusarium, Aspergillus e Onychocola. Espécies de Scytalidium sp. estão sendo associadas à patogenia primária de unha, o qual a prevalência das infecções vem aumentando nas últimas décadas, embora ainda pouco seja relatado. Há relatos de infecções profundas e superficiais pelo gênero Scytalidium em pacientes imunocomprometidos e imunocompetentes, incluindo abscesso no sistema nervoso central, endoftalmites, sinusites, osteomielites, fungemias, infecções subcutâneas, eumicetoma, linfangite, linfadenite, tinea pedis, onicomicoses, entre outras. O Scytalidium dimidiatum tem sido mais associado a infecções profundas quando comparada a sua variante hialina, S. hyalinum. A variante hialina está envolvido preferencialmente em infecções de pele e unha sugerindo que o isolado deficiente de melanina pode ser menos virulento que o pigmentado. Pouco é descrito na literatura sobre a sensibilidade a drogas antifúngicas e não há relatos de avaliação do uso da terapia fotodinâmica para Scytalidium dimidiatum e Scytalidium hyalinum, embora trabalhos demonstrem o aumento da resistência de fungos não dermatófitos quando comparadas aos dermatófitos. Devido a maior resistência de Scytalidium para algumas drogas, quando comparada aos fungos dermatófitos, o diagnóstico diferencial é imprescindível para o sucesso do tratamento. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho é investigar possíveis polimorfismos entre isolados clínicos de S. hyalinum e S. dimidiatum, analisar o perfil de susceptibilidade a antifúngicos e fotossensibilizadores de cepas de Scytalidium dimidiatum e Scytalidium hyalinum isolados de amostras clínicas, assim como investigar fatores envolvidos que justificariam diferença na res

A proposta do presente projeto é a análise do perfil da expressão gênica global de uma linhagem selvagem e calcineurina deletada de A. fumigatus na resposta ao antifúngico da classe equinocandina. Adicionalmente, dois genes relacionados com a resistência a antifúngicos, hsp90 e age3, serão caracterizados fenitípicamente e funcionalmente em A. fumigatus. Para isso, são propostos os seguintes objetivos: 1- Para determinar a melhor concentração de antifúngico da classe equinocandina a ser utilizada para o experimento de microarray, será determinada a Concentração Inibitóri Mínima (CIM) e da Concentração Fungicida Mínima (CFM) para o referido antifúngico para as linhagens selvagem e calcineurina deletada de A.fumigatus, 2- Determinação e análise da expressão gênica global por microarray de linhagem de A. fumigatus selvagem e calcineurina deletada em resposta ao antifúngico da classe equinocandina e a validação dos genes diferencialmente expressos por PCR em tempo real; 3- Caracterização fenotípica e funcional dos genes hsp90 e age3 (deleção, teste de sensibilidade a diferentes condições, expressão de mRNA em diferentes condições, complementação do gene deletado para validar a deleção, etc); 4- Determinação de parceiros protéicos de Hsp90 e Age3 por intermédio de fusão dos genes com proteínas alvo para purificação de complexos protéicos (TAP-tag e S-tag); 5- Validação dos possíveis parceiros protéicos identificados na purificação de complexos protéicos (objetivo 4) por ensaio de Yeast-2-Hybrid (Y2H) e Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).