Eduardo Lani Volpe da Silveira.

Células T CD8+ e anticorpos são capazes de promover imunidade contra o T. cruzi. Enquanto a grande maioria dos estudos têm explorado várias nuances da dinâmica das respostas das células T no contexto de imunidade induzida por vacinas contra a doença de Chagas, a análise da resposta humoral normalmente tem se limitado à quantificação de títulos de anticorpos séricos a alguns antígenos do parasita. Nossa hipótese é que anticorpos anti-TS, induzidos por vacinação intranasal com o adenovírus recombinante Adeno-TS, têm capacidade neutralizante tanto para conter uma infecção in vivo se presente em concentrações suficientes no soro ou até mesmo de impedir a disseminação da infecção se administrados posteriormente à ela. Desta forma, o objetivo dessa proposta é de produzir anticorpos monoclonais (mAbs) anti-TS derivados de ASCs únicas isoladas de linfonodos drenantes de animais vacinados com Adeno-TS, pela via intranasal, e testar suas capacidades terapêuticas de inibir a disseminação sistêmica do parasita em camundongos desafiados letalmente.

Malária é uma doença parasitária causada principalmente por Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax em humanos. De maneira geral, esta doença possui um gigantesco impacto em regiões endêmicas (países tropicais) por apresentar alta morbidade e mortalidade (este último no caso de crianças até 5 anos de idade infectadas pelo Plasmodium falciparum). Até o momento, há uma série de formulações vacinais sendo testadas em ensaios clínicos, mas ainda não há nenhuma vacina com alta capacidade protetora disponível no mercado. Um fato que chama a atenção sobre as formulações que visam inibir o desenvolvimento da fase sanguínea da malária, e assim diminuir a morbidade da infecção, é o pequeno número de antígenos testados. Nas últimas 4 décadas, cerca de 15 diferentes proteínas de Plasmodium tiveram descritas seus potenciais protetores quando utilizados em imunizações. Considerando que o principal mecanismo desta inibição de invasão de células vermelhas do sangue pelos parasitas seria desencadeado por anticorpos, o objetivo deste trabalho visa identificar novos antígenos protetores contra o desenvolvimento de fase sanguínea da malária a partir de anticorpos monoclonais. Para isso, camundongos semi-imunes ao Plasmodium berghei terão plasmócitos (células secretoras de anticorpos) isolados por cell sorting para clonagem de regiões variáveis de imunoglobulinas para produção de anticorpos monoclonais. Em seguida, estes anticorpos serão testados quanto suas capacidades de inibir invasão de células por formas sanguíneas do Plasmodium berghei. Os anticorpos inibidores serão posteriormente imunoprecipitados com seus respectivos antígenos alvo para identificação destes antígenos protetores.

O vírus da Dengue é transmitido pelo vetores Aedes aegypti ou Aedes albopictus aos seres humanos e causa um enorme impacto na saúde pública de áreas endêmicas. Estimativas apontam para 50-100 milhões de infecções anuais nessas regiões. Quatro diferentes sorotipos do vírus desencadeiam, clinicamente, as seguintes formas da doença: assintomática, moderada e grave. Esta forma grave da doença, caracterizada por febre hemorrágica ou síndrome de choque, pode até matar o indivíduo infectado. Atualmente, não existe vacina ou terapia protetora contra estes 4 diferentes sorotipos. A terapia atual é somente paliativa e ineficiente quando iniciada tardiamente contra a forma grave da doença. Assim, o objetivo geral deste projeto é de gerar anticorpos monoclonais (IgG) específicos a epítopos do envelope viral dimérico (EDE) a partir de células secretoras de anticorpos (plasmablastos). Para isso, amostras de PBMC de pacientes infectados com Dengue durante a fase aguda da infecção serão utilizadas para a quantificação de plasmablastos específicos ao vírion (ELISPOT) e isolamento destas mesmas células por citometria de fluxo (single cell sorting). As sequências de cadeias leve e pesada de imunoglobulinas destas células únicas serão clonadas em vetores de expressão e transfectadas em células eucariontes 293. Os anticorpos monoclonais serão purificados dos sobrenadantes destas células transfectadas e caracterizados quanto à capacidade de reconhecer o vírion (ELISA) e a epítopos do envelope dimérico (EDE) (Immunoblotting) e a de neutralizar infecções in vitro com os 4 sorotipos do vírus. Ainda, o repertório dos genes V(D)J de anticorpos que se mostrarem tetravalentes e neutralizantes será comparado com aqueles anticorpos também anti-EDE, porém não tetravalentes e/ou neutralizantes. Caso algum anticorpo seja identificado como tetravalente e neutralizante, ele será testado futuramente como terapia após a infecção pelo vírus da Dengue em modelos animais.

Zika vírus é um membro da família dos Flavivírus que vem causando grande preocupação mundial devido à diversidade de sintomas que induz em indivíduos infectados. Desde 2014, iniciou-se um surto no Brasil e entre os sintomas que mais chamaram a atenção de toda comunidade científica foram: microcefalia, calcificação cerebral, alterações neurológicas que alteram o desenvolvimento motor e cognitivo, além de poder causar paralisia (síndrome de Guillain-Barré), cegueira, alterações morfológicas em membros inferiores como artrogripose, entre outras. Além dos sintomas, algo que tornou essa infecção mais alarmante foi a capacidade do vírus de ser transmitido não só por mosquitos vetores, mas também por contato sexual. 
Consequentemente, uma série de estudos vem sendo realizados mundialmente com o intuito de se entender a patogênese derivada desta infecção viral. No entanto, pouco ainda se sabe sobre como é organizada a resposta imune contra o Zika vírus. Assim, o objetivo geral deste estudo visa entender detalhadamente como se dá a resposta humoral após a infecção pelo Zika vírus. Para isso, amostras de sangue de pacientes infectados por até 7 dias pelo Zika vírus terão plasmablastos isolados por cell sorting. Suas respectivas seqüências de regiões variáveis de imunoglobulinas serão clonadas para produção de anticorpos monoclonais. Em seguida, estes anticorpos serão avaliados quanto afinidade e avidez ao antígeno do Zika vírus, ao tipo e número de mutações nos genes V(D)J em relação às seqüências germline, além da capacidade funcional (neutralização do patógeno e interação com proteínas do sistema complemento).

Zika vírus é um membro da família dos Flavivírus que vem causando grande preocupação mundial devido à diversidade de sintomas que induz em indivíduos infectados. Desde 2014, iniciou-se um surto no Brasil e entre os sintomas que mais chamaram a atenção de toda comunidade científica foram: microcefalia, calcificação cerebral, alterações neurológicas que alteram o desenvolvimento motor e cognitivo, além de poder causar paralisia (síndrome de Guillain-Barré), cegueira, alterações morfológicas em membros inferiores como artrogripose, entre outras. Além dos sintomas, algo que tornou essa infecção mais alarmante foi a capacidade do vírus de ser transmitido não só por mosquitos vetores, mas também por contato sexual. 
Consequentemente, uma série de estudos vem sendo realizados mundialmente com o intuito de se entender a patogênese derivada desta infecção viral. No entanto, pouco ainda se sabe sobre como é organizada a resposta imune contra o Zika vírus. Assim, o objetivo geral deste estudo visa entender detalhadamente como se dá a resposta humoral após a infecção pelo Zika vírus. Para isso, uma análise da estrutura tridimensional das proteínas do envelope e pré-membrana do Zika vírus será realizada in silica para identificar porções de imunoglobulinas que originariam um anticorpo capaz de se ligar ao vírus. Estas porções serão combinadas e suas respectivas seqüências de DNA serão sintetizadas para clonagem de anticorpos monoclonais. 
Em seguida, estes anticorpos serão avaliados quanto afinidade e avidez ao antígeno do Zika vírus, ao tipo e número de mutações nos genes V(D)J em relação às seqüências germline, além da capacidade funcional (neutralização do patógeno e interação com proteínas do sistema complemento).

Zika vírus é um membro da família dos Flavivírus que vem causando grande preocupação mundial devido à diversidade de sintomas que induz em indivíduos infectados. Desde 2014, iniciou-se um surto no Brasil e entre os sintomas que mais chamaram a atenção de toda comunidade científica foram: microcefalia, calcificação cerebral, alterações neurológicas que alteram o desenvolvimento motor e cognitivo, além de poder causar paralisia (síndrome de Guillain-Barré), cegueira, alterações morfológicas em membros inferiores como artrogripose, entre outras. Além dos sintomas, algo que tornou essa infecção mais alarmante foi a capacidade do vírus de ser transmitido não só por mosquitos vetores, mas também por contato sexual. 
Consequentemente, uma série de estudos vem sendo realizados mundialmente com o intuito de se entender a patogênese derivada desta infecção viral. No entanto, pouco ainda se sabe sobre como é organizada a resposta imune contra o Zika vírus. Assim, o objetivo geral deste estudo é de desenvolver um modelo animal de infecção pelo Zika vírus em macacos resus. Para isso, a presença de carga viral será caracterizada em amostras como sangue, saliva, urina, saliva, semen, em diferentes tempos após o desafio experimental. Alterações comportamentais serão avaliadas diariamente nestes animais. Com relação à resposta imune desencadeada por este vírus, aspectos de resposta celular e humoral serão mensurados em amostras de sangue, medula óssea e biópsias de linfonodos. Mais especificamente, populações de células como linfócitos B, NK, monólitos, macrófagos, células dendríticas terão suas freqüências e atividade funcional mensuradas em diferentes tempos após o desafio.

A poluição ambiental proveniente das mais diversas formas é um problema mundial. Em uma incessante busca pelo aumento da produção industrial, vários países, principalmente os mais desenvolvidos, vêm consumindo cada vez mais combustíveis, acarretando na liberação de compostos extremamente tóxicos na atmosfera. Dentre os compostos tóxicos oriundos da poluição, encontramos monóxido de carbono, ozônio, dióxido nítrico, dióxido sulfúrico, entre outros. De forma geral, a poluição do ar leva a um aumento significativo de casos de doenças respiratórias, assim como de outras doenças que podem ser até fatais. Uma fonte menor de poluição, mas tão importante quanto todas as outras citadas acima, é o tabaco. A fumaça proveniente do cigarro apresenta mais de 4500 substâncias químicas, entre as quais já foram identificados metais e gases tóxicos, metais e substâncias cancerígenos. Dos compostos pertencentes à esta última classe, um elemento conhecido como hidroquinona (1,4-dihidroxibenzeno - HQ), é gerado durante a metabolização do benzeno (BZ). Tem se mostrado que a exposição à HQ in vivo afeta diretamente o sistema imune, induzindo uma certa imunossupressão, aumentando, assim, a suscetibilidade à infecções. Assim, o objetivo geral deste projeto é avaliar a exposição à HQ é capaz de alterar da resposta de células B induzida por vacinas virais. Para isso, os animais serão expostos à HQ mimetizando uma exposição crônica. Durante este período, eles serão vacinados com uma proteína recombinante do envelope do vírus da Dengue (sorotipo 2) em combinação com hidróxido de alumínio ou vacina comercial para Influenza ou Hepatite B. Em seguida, o título de IgG antígeno-específicos será quantificado no soro dos animais, assim como a freqüência de populações oriundas de células B e suas respectivas citocinas em amostras como baço, linfonodos e medula óssea. Também será quantificado o número e tamanho de folículos nos centros germinativos do baço e linfonodos destes mesmos animais.

O agente causador da Dengue é um vírus da família Flaviviridae que é transmitido pelo mosquitos vetores Aedes aegypti ou Aedes albopictus aos humanos. Este vírus causa um gigantesco impacto anualmente na saúde pública das áreas endêmicas de infecção (países tropicais). De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), cerca de 50-100 milhões de infecções são detectadas anualmente em mais de 100 países tropicais no mundo. Entre estes países, está o Brasil que apresenta praticamente uma nova epidemia dessa infecção a cada ano. Em 2015, houve um aumento significativo no número de casos confirmados em relação a 2014. Há 4 diferentes sorotipos do vírus da Dengue (DENV-1, -2, -3 e -4), os quais possuem uma certa diversidade quanto às seqüências de proteínas. Após a infecção primária, ocorre a produção de anticorpos que, na sua maioria, reagem cruzadamente com os diferentes sorotipos, mas não são neutralizantes contra eles, mas somente contra o próprio sorotipo. Inicialmente, essa resposta humoral não é efetiva, já que é detectada no soro normalmente após o declínio da viremia. Apesar disso, a resposta celular que suporta a produção de anticorpos é extremamente alta e específica. Pacientes infectados pelo vírus da Dengue apresentam um grande aumento na freqüência de plasmablastos (células secretoras de anticorpos de vida curta) na circulação durante os primeiros 7 dias após o desenvolvimento de sintomas. A grande maioria destes plasmablastos é específica a epítopos do envelope viral. Além disso, pacientes que apresentam dengue grave (hemorrágica) têm uma maior magnitude de resposta de plasmablastos específicos que os pacientes com Dengue moderada. Curiosamente, a quantidade de plasmablastos oriundos desta resposta equivale a mais de 50% de todas as células B circulantes no sangue. Essa representatividade é muito maior que a observada durante respostas imunes induzidas contra outros flavivírus (vacina da febre amarela) ou outros vírus (gripe), as quais não atingem 10% de média. Assim, como a infecção pelo vírus da Dengue é capaz de induzir uma resposta tão alta de plasmablastos? Para responder essa pergunta, pretendo abordar quais vias de sinalização são ativadas (e alteradas) durante esta resposta de células B durante esta infecção viral para gerar tantas células. Amostras de sangue serão coletadas durante a visita do indivíduo infectado ao hospital, as quais terão as células B isoladas por meio de beads magnéticas conjugadas a anticorpos anti-CD19. Uma vez isoladas, as células B de cada indivíduo serão homogeneizadas com tampão RIPA e terão um extrato proteico isolado. Este extrato proteico será utilizado em ensaios de Western blotting para avaliação da expressão de diversas proteínas envolvidas em cascatas de sinalização envolvidas na diferenciação de células B em plasmablastos.