Igor Cesarino.

Biomassa lignocelulósica é uma alternativa sustentável à complexa cadeia produtiva de petróleo, podendo ser processada em açúcares simples e compostos aromáticos que são convertidos em biocombustíveis e outros bioprodutos em biorrefinarias. Neste contexto, o polímero aromático lignina, presente nas paredes secundárias que compõem a biomassa vegetal, é um grande gargalo pois dificulta o processamento e posterior conversão da lignocelulose em bioprodutos. Por isso, o metabolismo de lignina tem sido intensamente estudado e caracterizado, cujo conhecimento permite desenvolver estratégias de manipulação genética para a geração de biomassa otimizada para a bioeconomia. O metabolismo de lignina apresenta diversos aspectos, como regulação, biossíntese dos monômeros, transporte dos monômeros para a parede celular e polimerização. Por ser um investimento de carbono irrecuperável para a planta, a deposição de lignina deve ser precisamente regulada. Esta regulação acontece aos níveis epigenético, transcricional, pós-transcricional e pós-traducional. No entanto, existe uma lacuna no conhecimento do controle pós-transcricional da lignificação, especialmente em gramíneas C4. Portanto, o objetivo deste projeto é contribuir na elucidação dos mecanismos pós-transcricionais de regulação da lignificação em gramíneas C4, utilizando Setaria viridis como modelo. Para identificar possíveis módulos de regulação pós- transcricional, inicialmente será realizada uma análise integrada de micro-transcriptômica e degradômica em 4 órgãos de S. viridis contrastantes para a deposição de lignina. A partir da integração destes dados com a predição de interação miRNAs/genes-alvo, serão selecionados possíveis módulos de regulação entre miRNAs e genes envolvidos nos diferentes aspectos do metabolismo de lignina. Um total de 5 módulos serão selecionados para validação in vivo, que será realizada por meio de ensaios de expressão transiente em folhas de tabaco. Este trabalho será vinculado ao projeto Jovem Pesquisador Fase 2 (Processo Fapesp 2021/06142-8) e está totalmente alinhado aos seus objetivos de caracterizar mecanismos moleculares envolvidos na lignificação em gramíneas C4. Os resultados desse trabalho não somente contribuirão para um aprofundamento no conhecimento do metabolismo de lignina em gramíneas C4 mas também poderão auxiliar no desenvolvimento de estratégias biotecnológicas para engenharia genética da biomassa vegetal para a bioeconomia.

Plant lignocellulosic biomass constitutes a sustainable alternative to replace the complex carbon chemistries of petroleum as it can be deconstructed into simple sugars and aromatics that are further converted into biofuels and bioproducts. In this context, the shikimate/phenylpropanoid pathway is a major biotechnological target, as it is the source of not only the aromatic polymer lignin (a major bottleneck to biomass processing in biorefineries) but also of metabolites eligible as important bio- replacements for commonly fossil fuel-derived aromatics. This project aims to contribute both basic (novel knowledge) and applied (novel products) research regarding the shikimate/phenylpropanoid pathway in C4 grasses. The first objective is to perform the functional characterization of five candidate genes potentially involved in lignin metabolism using the model C4 grass Setaria viridis. These candidate genes were previously selected during JP1 Fapesp (2015/02527-1), in which large-scale transcriptomics followed by co-expression analyses were applied to model tools developed to facilitate the study of lignin metabolism in C4 grasses. The genes were selected to cover broad aspects of lignin metabolism, including transcriptional regulation, monolignol biosynthesis, monolignol transport and monolignol glycosylation. The second objective is to boost the status of sugarcane plants as multipurpose crops via bioengineering of the shikimate/phenylpropanoid pathway. Three strategies were selected, based on target metabolites that represent high-value compounds and whose metabolic engineering approach would potentially affect lignin deposition and, consequently, enhance biomass processability. Considering both parts of the project, target genes will be misregulated and the corresponding transgenic lines will be characterized by multiple-level phenotyping, including anatomical/structural analyses, wet- chemistry, large-scale transcriptomics, metabolic profiling and saccharification efficiency. This project has the potential to not only generate novel basic knowledge on lignin metabolism in C4 grasses but also to explore novel strategies for steering the shikimate/phenylpropanoid pathway for industrial purposes.

Plant biomass, which is mostly composed of polysaccharide-rich secondary cell walls, constitutes a promising source of fermentable sugars for the production of biofuels and biomaterials. However, the presence of the phenolic polymer lignin largely precludes the release of monosaccharides during enzymatic hydrolysis of these cell wall polysaccharides in the biorefinery. Therefore, unraveling the molecular mechanisms underlying the phenylpropanoid metabolism and, thus, lignin metabolism is essential for unlocking the economic potential of lignocellulosic biomass. In the context of the bioeconomy, C4 grasses emerge as prominent lignocellulosic feedstocks due to their high biomass yield ensured by C4 photosynthesis. However, our understanding of many aspects of the lignin metabolism, such as regulation, biosynthesis and polymerization, remains fragmentary, especially when compared to eudicot species. Moreover, several grass-specific features of the phenylpropanoid metabolism cannot be extrapolated from data obtained with eudicot model plants. In this project, we aim to broaden our knowledge on the phenylpropanoid and lignin metabolisms in C4 grasses by applying a systems biology approach using Setaria viridis as model species. First, a deep systems characterization of different S. viridis tissues will be performed using metabolomics (employing mass spectrometry-based techniques) and transcriptomics (employing RNAseq) to generate comprehensive molecular data to build a Setaria viridis eFP (electronic fluorescent pictographs) browser. This tool allows the visualization of molecular data (e.g. gene expression patterns, metabolite accumulation) in different plant tissues in a user-friendly interface, which might be very useful for the scientific community to initially infer gene functions. Secondly, top candidate genes that are co-expressed with lignin biosynthetic genes in large-scale transcriptomics databases of grasses (previously generated in the scope of a Fapesp Young Investigator Awards Project, Processo n° 2015/02527-1) will be functionally characterized in S. viridis. These genes have been already selected and their initial characterization has been performed. These genes will be further misregulated in planta and the resulting transgenic lines will be deeply characterized for i) biomass parameters, ii) metabolite profiling, iii) lignin deposition, iv) global gene expression; and v) saccharification yield. Therefore, the misregulation of such genes will be used as a strategy to both elucidate novel aspects of the phenylpropanoid/lignin metabolism in C4 grasses and to validate novel biotechnological strategies to improve biomass processing in the biorefinery.

O crescimento vegetal depende de como as plantas produzem estruturas de parede celular secundária. Estas estruturas são constituídas basicamente por polímeros de açúcar, formando a maior parte da biomassa vegetal, essencial para diversas aplicações industriais, incluindo biocombustíveis, construção e biomateriais. Nesta proposta será investigado como um modulador central do metabolismo de carbono, o complexo proteico da quinase Target Of Rapamycin (TOR), regula a partição de carbono em parede celular secundária em Arabidopsis e no modelo de gramínea C4 Setaria viridis. Os resultados servirão de base para uma importante colaboração científica que incluirá intercâmbio de estudantes e estreitamento das colaborações entre FAPESP e Universidade de Melbourne. (AU)

Recently, interest on lignin research has increased significantly since several studies have identified this biopolymer as the main factor responsible for the recalcitrance of cell walls to cellulose-to-glucose conversion for downstream applications, such as the production of biofuels and bio-based materials. Despite recent advances, most of our current knowledge of cell wall formation and lignin metabolism is primarily derived from dicotyledoneous species. However, the molecular mechanisms controlling different aspects of lignin metabolism in grasses, such as transcriptional regulation, biosynthesis and polymerization, remains largely unknown, despite of the economic importance of this group of plants. Therefore, comprehensive and systematic studies are needed to unravel specific characteristics of secondary cell wall formation and lignin metabolism in grasses. The present project aims to develop model systems of sorghum and use them in a systems biology approach based on transcriptomics and metabolomics to correlate changes in cell wall composition with changes in gene expression, with a major focus on lignin and phenolic metabolism. The proposed model systems are: i) the elongating internode system, and ii) inducible cell suspension culture for tracheary element differentiation. Both systems will be characterized for lignin deposition and phenolic profiling and subsequently used in high-throughput transcriptomic analysis using RNAseq. Finally, the transcriptomic data will be used to generate a co-expression network and a database of co-expressed genes, in order to select candidate genes that potentially play a role in secondary cell wall formation and lignin biosynthesis in grasses. The obtained knowledge might be very helpful for future biotechnological strategies to reduce biomass recalcitrance in bioenergy crops, such as sugarcane.

It is commonly known that fossil fuels contribute to climate change and that we need to look for more environmentally friendly substitutes. Plant biomass can serve as a renewable and carbon-neutral raw material for the production of bioenergy. Indeed, lignocellulosic plant biomass can be processed into liquid biofuels via the conversion of cell wall polysaccharides, comprising mainly cellulose and hemicelluloses, into fermentable sugars, in a process called saccharification. However, the presence of lignin hampers the saccharification process and, hence, plant biomass needs to be pre-treated to make the polysaccharides accessibly by the enzymes. The pretreatment of biomass is the most costly process in the valorization of biomass to liquid biofuels, and is also an environmentally hazardous process. Lignin is a complex aromatic polymer that provides both structure and rigidity to the cell and waterproofs the cell wall, enabling water transport through the vascular system. From an industrial perspective, engineering plants that either deposit less lignin or produce lignins more amenable to chemical degradation could reduce the amount of energy and chemicals needed in the pretreatment step. Indeed, many studies have reported an improved biomass processing by altering cell wall composition through genetic engineering. However, lignin biosynthesis is a complex process where there is as yet a lot to be discovered. In addition, the outcome of genetic alterations is not always in agreement with the existing knowledge and those modifications often result in perturbations on biochemical processes and pathways other than the target. 
The first goal of this project is to characterize a pre-selected gene that is highly likely involved in lignin biosynthesis in the model plant Arabidopsis thaliana. The target gene was derived from a systems biology project, carried out within the Bioenergy Group, which covered the metabolome and transcriptome analysis of a set of Arabidopsis mutants, defective in consecutive steps of the lignin biosynthetic pathway. After these analyses, knockout mutants of candidate genes were screened for their saccharification potential and their total amount of lignin, and the target genes were selected for further characterization. The second goal is to use the knowledge gained with Arabidopsis to engineer poplar plants with better saccharification potential. The ultimate goal of the project is, therefore, to perform field trials using the transgenic poplar lines with enhanced cell wall extractability to evaluate their performance in field conditions and determine their potential as improved bioenergy crops. http://multibiopro.eu/

· Next generation sequencing in a natural population of Populus nigra revealed a mutant with a premature stop codon in the gene encoding hydroxycinnamoyl-CoA:shikimate
hydroxycinnamoyl transferase1 (HCT1), an essential enzyme in lignin biosynthesis.
· The lignin composition of P. nigra trees homozygous for the defective allele was compared with that of heterozygous trees and trees without the defective allele. The lignin
wascharacterized by phenolic profiling, lignin oligomer sequencing, thioacidolysis and NMR. In addition, HCT1 was heterologously expressed for activity assays and crosses were made to
introduce the mutation in different genetic backgrounds.
· HCT1 converts p-coumaroyl-CoA into p-coumaroyl shikimate. The mutant allele, PnHCT1-Δ73, encodes a truncated protein and trees homozygous for this recessive allele have a modified
lignin composition characterized by a 17-fold increase in p-hydroxyphenyl units.
· Using the lignin pathway as proof of concept, we illustrated that next generation EcoTILLING to identify rare defective alleles is a straightforward approach to initiate reverse genetics and
accelerate tree breeding. The proposed breeding strategy, called ?Breeding with Rare Defective Alleles? (BRDA), should be widely applicable independent of the target gene or the species.

A lignina é um heteropolímero complexo depositado principalmente na parede celular secundária de tipos celulares especializados, conferindo força mecânica e rigidez para as plantas se manterem eretas e também proporcionando hidrofobicidade para que células condutoras transportem água e nutrientes por longas distâncias. Embora a lignina seja essencial para o desenvolvimento da planta, este polímero é o principal componente da parede celular responsável pela recalcitrância da biomassa vegetal, sendo que sua presença afeta negativamente o uso do material lignocelulósico para a produção de biocombustíveis e biomateriais. Diversas evidências suportam um papel para peroxidases e laccases no processo de polimerização da lignina. No entanto, identificar genes/isoformas relacionados com o processo de polimerização de lignina e caracterizar seu mecanismo de ação estão entre as tarefas mais desafiadoras acerca do metabolismo deste polímero fenólico. Neste trabalho, uma abordagem técnica abrangente foi aplicada com o objetivo de se identificar potenciais candidatos envolvidos na radicalização oxidativa dos monômeros de lignina. A estratégia envolveu análise de atividade enzimática e o perfil proteômico de peroxidases de classe III durante o desenvolvimento do colmo de cana-de-açúcar; o uso de células em suspensão como ferramenta para isolar e caracterizar peroxidases de classe III potencialmente envolvidas na polimerização de lignina; e a combinação de análises de co-expressão, expressão tecido/tipo celular específica e complementação de um mutante de Arabidopsis thaliana para a caracterização de uma laccase.

O café é uma importante fonte de divisas para o país, e no cenário internacional, depois do petróleo, é o commodity que mais movimenta as trocas comerciais. A espécie Coffea arabica responde por cerca de 70% de toda a produção mundial, além de produzir bebida de melhor qualidade. Devido à sua importância e ao fato de se conhecer pouco sobre a influência das proteínas e peptídeos na qualidade da bebida, este projeto inicialmente buscava analisar as diferenças no perfil protéico de amostras de C. arabica convencional e orgânico (ambos variedade Mundo Novo), e ?ruim? (variedade Catuaí Vermelho), utilizando-se como ferramenta a poderosa análise proteômica. Obtendo-se um mapa proteômico destas diferentes variedades, provenientes de localidades distintas, seria possível correlacionar o perfil protéico da semente e os mecanismos que influenciam a qualidade da bebida.

Em plantas, poucas funções biológicas estão relacionadas com flavina monooxigenases (Flavin-containing monooxygenases - FMOs), embora uma grande quantidade de genes codificantes para este tipo de enzimas seja encontrada nestes organismos. A análise dos genes FMO-like dos três genomas vegetais completamente seqüenciados, somada às recentes caracterizações funcionais de FMOs vegetais, revela que as FMOs de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa e Populus trichocharpa se distribuem em três clados, de acordo com suas funções básicas: (i) Clado I, relacionadas com defesa contra patógenos; (ii) Clado II, relacionadas com síntese de auxina; e (iii) Clado III, relacionadas com S-oxigenação de substratos endógenos. A maior parte do conhecimento das características bioquímicas destas enzimas foi gerado por pesquisas com FMOs animais, sendo que a primeira caracterização de uma FMO de origem vegetal foi realizada em 2001. Assim, com o intuito de identificar substratos naturais potenciais, o presente trabalho visa a realização da expressão heteróloga e caracterização funcional in vitro de uma FMO de Coffea arabica, a principal espécie comercial de café.

O estudo visa identificar genes MADS-like no Banco de Dados do Projeto Genoma Café e estudar o padrão de expressão dos genes identificados em diferentes órgãos da planta de café, por meio de PCR semi-quantitativa. Os genes de maior interesse, notadamente os genes homeóticos do padrão ABC que determinam a formação dos órgãos florais, serão estudados por meio da técnica de hibridização in situ.

Todos os compostos envolvidos nas vias de síntese e degradação de cafeína em café já foram elucidados, além da maioria das enzimas participantes. Entretanto, as atividades das enzimas que realizam as demetilações da cafeína até a formação de xantina ainda não foram detectadas. Em animais a demetilação de cafeína é realizada por enzimas do grande grupo dos citocromos P450. A partir desta informação, neste trabalho procuramos levantar evidências de que em café essas reações também são catalisadas por esta classe de enzimas. Para isso, acompanhamos o catabolismo de cafeína em folhas de Coffea dewevrei na presença de inibidores específicos de citocromos P450. Utilizou-se esta espécie de café, pois ela apresenta altas taxas de degradação de cafeína nas folhas, o que conseqüentemente resulta em uma baixa concentração do composto neste órgão. Alguns discos de folha foram infiltrados apenas com cafeína, servindo de controle, enquanto outros foram infiltrados com cafeína juntamente com algum inibidor específico de P450. A partir destes discos, foram feitos extratos metanólicos 24, 48 e 144 horas após a infiltração, que foram submetidos à análise em HPLC. A comparação com o controle mostrou que certos inibidores atrasaram a degradação de cafeína, o que constitui uma forte evidência de que o catabolismo de cafeína em plantas de café também é realizado por um citocromo P450.