Lucia Rossetti Lopes.

O oxigênio singleto (1O2) é o primeiro estado excitado do oxigênio molecular com 94,3 kJ/mol em excesso de energia ao seu estado fundamental tripleto, e com uma reatividade química completamente diferente daquela do oxigênio molecular, pois o 1O2 pode se adicionar diretamente a ligações duplas. O 1O2 desempenha papéis importantes nas ciências dos materiais, e nas disciplinas básicas de física, química, biologia e medicina, sendo a principal espécie responsável por catalisar as oxidações fotossensibilizadas. Nos últimos vinte anos temos trabalhado diariamente para tornar a nossa instalação central de 1O2 numa das mais bem equipadas do mundo. No entanto, agora precisamos de substituições de hardware/software para continuar a funcionar e de expansão para se manter no estado da arte. A substituição de algumas das partes do equipamento é fundamental para que ele seja mantido funcionando, pois a parte central do equipamento já tem mais de 20 anos. Propomos também expandir a instalação central para permitir a excitação no UVA e para permitir a construção de imagens de emissão de 1O2. A construção de imagens de 1O2, hoje disponíveis apenas para alguns outros laboratórios de pesquisa no mundo, permitirá uma melhoria significativa na ferramenta para caracterizar a presença e a reatividade de 1O2 em diferentes ambientes. Nos últimos anos, grandes melhorias foram alcançadas no rastreamento em tempo real de 1O2 por diferentes métodos de detecção, incluindo detecção da característica de emissão em torno de 1270 nm, detecção de fluorescência retardada e de fosforescência do fotossensibilizador. Propomos a aquisição de um espectrofosforômetro com funcionalidade 3D para permitir a aquisição de varreduras de resolução espacial de sinais de emissão com detecção resolvida no tempo, na faixa de comprimento de onda de 400-1400 nm (usando filtros e ópticas apropriadas). Dezenas de usuários acadêmicos e empresariais são e continuarão sendo beneficiários diretos da core-facility de oxigênio singlete.

O melanoma é um tipo de câncer de pele extremamente agressivo. Esta característica está associada a maior capacidade de metastização e quimiorresistência do tumor. As espécies reativas de oxigênio (ROS) contribuem para o início da tumorigênese, proliferação, invasão e metástase. A metástase é um dos fatores mais importantes relacionados ao pior prognóstico e responsável por grande parte da morbidade relacionada aos tumores sólidos. O entendimento do papel destes oxidantes na etiologia e progressão do melanoma é fundamental para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas no tratamento desta doença. A família das NADPH oxidases, uma enzima dedicada a geração de ROS, tem sido apontada como uma importante fonte de oxidantes na progressão e reincidência do melanoma. Entre as isoformas, a NADPH oxidase 4 (Nox4) encontra-se aumentada em pacientes com melanoma e tem sido implicada na sobrevivência de células de melanoma. A expressão de Nox4 está envolvida na organização do citoesqueleto e nas alterações de fenótipo de células musculares lisas vasculares. A Nox2 tem sido implicada na regulação do fator de transcrição NF-kB que leva a expressão de AXL, um receptor tirosina quinase cuja expressão está correlacionada a resistência a quimioterapia em pacientes com diferentes tipos de câncer. Pretendemos neste projeto investigar o papel da Nox2 e Nox4 nas progressão e resistência das células de melanoma analisando: sobrevivência, migração, invasão e capacidade de formação de colônias em linhagens de melanoma sensíveis e resistentes aos inibidores de B-RAF com expressão diferenciada de Nox2 ou Nox4. Adicionalmente, em amostras primárias de pacientes com melanoma investigaremos o impacto prognóstico da expressão de Nox2 e Nox4 em tumores primários e metastáticos. Nossos dados preliminares sugerem que a expressão desta família de enzimas está correlacionada com a progressão do melanoma. O projeto visa investigar este novo paradigma no tratamento do melanoma proporcionando alternativas para diminuir a sua progressão e resistência aos quimioterápicos.

Espécies reativas de oxigênio (EROs) desempenham papel fundamental como mediadores da sinalização fisiológica e patológica contribuindo para as alterações estruturais e funcionais observadas nas doenças vasculares. Doenças como hipertensão arterial são associadas a alterações vasculares mediadas por EROs tais como alteração do tônus vascular, remodelamento e inflamação. Diversos estudos demonstram que a angiotensina II (Ang II) participa efetivamente no desenvolvimento das patologias do sistema vascular. Estudos demonstram que o uso de antagonistas do receptor AT1 não só melhoram o estado clínico dos pacientes, mas, diminuem o remodelamento, melhoram a função endotelial, reduzem o tônus vasomotor, diminuem a inflamação e a ativação de circuitos patológicos em células musculares lisas vasculares. Estudos clínicos, no entanto, sugerem que o uso de antioxidantes tais como vitaminas ou drogas não são capazes de diminuir a incidência de doenças cardiovasculares. Neste contexto, acreditamos que novas estratégias de prevenção de doenças cardiovasculares devem focar na inibição de enzimas geradoras de EROs, principalmente a NADPH oxidase vascular. Recentemente o nosso grupo identificou a proteína dissulfeto isomerase (PDI), uma ditiol dissulfeto tiol oxidoredutase, chaperona do retículo plasmático como uma proteína capaz de se associar e regular a ativação da NADPH oxidase vascular. Nossos estudos mostraram que intervenções capazes de antagonizar a PDI promoveram uma redução na geração de EROs pela NADPH oxidase em resposta a Ang II. Demonstramos que a PDI é capaz de se associar as subunidades da NADPH oxidase incluindo p22phox, nox1, nox4, nox2 em células vasculares e em células HEK 293 transfectadas com as isoformas da Nox. Estudos recentes do nosso grupo demonstraram ainda que a super expressão de PDI em células musculares lisas vasculares da aorta de coelho (RASM) provoca um aumento da geração de EROs e da expressão de Nox1, sugerindo uma estreita relação entre a expressão de PDI e esta isoforma da NADPH oxidase. EROs tem um papel fundamental na modulação do tônus vascular atuando como segundo mensageiros de vias que regulam o aumento da concentração de cálcio intracelular e também ativando vias sensíveis a cálcio tais como RhoA/Rho kinase resultando em maior acoplamento actina/miosina e contração. O papel da PDI na modulação da geração de EROs pela NADPH oxidase e suas implicações na reatividade vascular a Ang II na hipertensão arterial permanece desconhecido. O presente projeto tem como objetivo investigar o papel da PDI na reatividade vascular e na geração de EROs pela NADPH oxidase em artérias de resistência durante o desenvolvimento da hipertensão arterial. O entendimento do papel da PDI no estresse oxidativo e disfunção vascular associados a hipertensão arterial pode fornecer novas formas de intervenção terapêutica no controle desta patologia.

O estudo de processos redox tem alto potencial para elucidar mecanismos integrativos, devido à ubiquidade e potência de efeitos. Muitos estudos envolvem o papel de mecanismos redox em doenças. Porém, a complexidade deste campo aumentou com respeito a estruturas, estrutura-função, métodos, patologia molecular e sub-celular de proteínas redox, genômica, [ proteômica e metabolômica do estresse oxidativo. Assim, uma abordagem multidisciplinar se tornou essencial para avanços relevantes na área. Além disso, grupos emergentes têm dificuldade em realizar investigações relevantes e reeducar-se em novas habilidades. O principal objetivo do CEPID Redoxoma é promover colaborações integrativas, desenvolvimento sustentado e assistência a grupos emergentes. Nossa meta é realizar estudos que permitam o desenho e avaliação de novas estratégias antioxidantes de aplicabilidade clínica. Focalizaremos pontos críticos para superar limitações do conhecimento de processos redox: 1) Geração e controle de espécies reativas de oxigênio (ROS) em sistemas biológicos; 2) Reatividade química de ROS em ambientes biológicos e consequentes mudanças na estrutura e função de biomoléculas; 3) Mecanismos e redes envolvidos nos processos de sinalização redox relevantes para doenças humanas; 4) Aplicações diagnósticas e I terapêuticas de processos redox. As estratégias propostas permitirão, em âmbito nacional, um coerente esforço para estudar questões-chave que preencham lacunas relevantes na área. Tais esforços serão estratégicos para promover integração disciplinar e de Instituições do Brasil, resultando em avanços que tenham impacto científico, educacional, ambiental e socioeconômico.

Espécies reativas de oxigênio (EROs) desempenham papel fundamental como mediadores da sinalização fisiológica e patológica contribuindo para as alterações estruturais e funcionais observadas nas doenças vasculares. Doenças como hipertensão arterial são associadas a alterações vasculares mediadas por EROs tais como alteração do tônus vascular, remodelamento e inflamação. Diversos estudos demonstram que a angiotensina II (Ang II) participa efetivamente no desenvolvimento das patologias do sistema vascular. Estudos demonstram que o uso de antagonistas do receptor AT1 não só melhoram o estado clínico dos pacientes, mas, diminuem o remodelamento, melhoram a função endotelial, reduzem o tônus vasomotor, diminuem a inflamação e a ativação de circuitos patológicos em células musculares lisas vasculares. Estudos clínicos, no entanto, sugerem que o uso de antioxidantes tais como vitaminas ou drogas não são capazes de diminuir a incidência de doenças cardiovasculares. Neste contexto, acreditamos que novas estratégias de prevenção de doenças cardiovasculares devem focar na inibição de enzimas geradoras de EROs, principalmente a NADPH oxidase vascular. Recentemente o nosso grupo identificou a proteína dissulfeto isomerase (PDI), uma ditiol dissulfeto tiol oxidoredutase, chaperona do retículo plasmático como uma proteína capaz de se associar e regular a ativação da NADPH oxidase vascular. Nossos estudos mostraram que intervenções capazes de antagonizar a PDI promoveram uma redução na geração de EROs pela NADPH oxidase em resposta a Ang II. Demonstramos que a PDI é capaz de se associar as subunidades da NADPH oxidase incluindo p22phox, nox1, nox4, nox2 em células vasculares e em células HEK 293 transfectadas com as isoformas da Nox. Estudos recentes do nosso grupo demonstraram ainda que a super expressão de PDI em células musculares lisas vasculares da aorta de coelho (RASM) provoca um aumento da geração de EROs e da expressão de Nox1, sugerindo uma estreita relação entre a expres

A homeostase redox depende da produção regulada de espécies reativas
de oxigênio (ROS) por sistemas enzimáticos como o complexo NADPH oxidase da
família Nox, a principal fonte de ROS em células vasculares. Estudos recentes de
nosso laboratório caracterizaram um importante papel da dissulfeto isomerase
proteica (PDI) na regulação da NADPH oxidase. O importante efeito funcional da
PDI na NADPH oxidase em diversos tipos celulares, a proximidade física entre a
PDI e subunidades do complexo e a importante versatilidade funcional da PDI
com respeito à interação com outras proteínas, efeito chaperona, controle redox
de proteínas de membrana e tráfego sugeram que o estudo dos mecanismos pelos
quais a PDI afeta a NADPH oxidase pode fornecer importantes informações a
respeito da regulação da homeostase redox celular pela NADPH oxidase. O
objetivo principal deste Projeto Temático é aprofundar o estudo destes
mecanismos. Em paralelo, considerando que a PDI é uma proteína do retículo
endoplasmático (RE), trabalhamos ao longo do último projeto temático com a
hipótese de que PDI tem papel na convergência entre estresse oxidativo e
estresse do RE e coletamos dados indicando essa importante convergência em
modelos celulares. É possível que o efeito da PDI na homeostase redox celular em
doenças vasculares seja fortemente inserido na presença de estresse do RE.
Assim, uma segunda meta de nosso Projeto é o entendimento dos efeitos redox
da PDI no contexto da convergência entre NADPH oxidase e resposta integrativa
celular a estresse do RE. Metas específicas envolvem: (1) desenvolver peptídeos e
ferramentas moleculares para perda ou ganho de função da PDI, (2) investigar
certas modificações pós-traducionais da PDI, (3) avaliar o papel da PDI na
migração celular e possíveis mecanismos redox e não ?redox associados, (4)
estudar o efeito da PDI na regulação da interação NO-superóxido durante shear
stress laminar, (5) investigar o papel de corpúsculos lipídicos como

Este projeto representa um desenvolvimento mecanístico lógico e de grande alcance potencial de estudos prévios realizados pelos dois laboratórios envolvidos: Laboratório de Neurobiologia Celular e Laboratório de Sinalização Redox (ICB-USP). A proposta do presente estudo está relacionada com a principal linha de pesquisa do laboratório de Neurobiologia Celular e, portanto, com algumas investigações realizadas nos últimos anos, com o objetivo de elucidar os mecanismos envolvidos em lesões na retina de ratos adultos. Este projeto também está relacionado com a principal linha de pesquisa do Laboratório de Sinalização Redox que, tem como objetivo, a caracterização dos mecanismos da ativação da NADPH oxidase em diversas patologias, no intuito de entender melhor o papel do estresse oxidativo em doenças como hipertensão arterial, diabetes e neurodegeneração.

Nosso laboratório focalizou ao longo dos últimos anos o estudo de aspectos da fisiologia molecular de processos redox vasculares. Nossos estudos nos levaram à NAD(P)H oxidase, uma fonte primária de espécies reativas de oxigênio. A busca por mecanismos reguladores desse complexo enzimático levou-nos à identificação de que a Dissulfeto Isomerase Proteica (PDI), uma chaperona tiol oxidoredutase do retículo endoplasmático (RE), associa-se estreitamente à NAD(P)H oxidase de células musculares lisas vasculares e regula sua ativação por angiotensina II. Dada a combinação dos efeitos redox da PDI com seu conhecido papel no controle do tráfego e secreção de proteínas, nossos resultados sugerem um novo modelo de regulação da oxidase, e consequentemente do estado redox celular. O objetivo geral de nosso projeto é aprofundar o entendimento mecanístico e explorar em maior detalhe certas consequências da interação entre a PDI e NAD(P)H oxidase, em conexão com eventos relevantes à fisiopatologia da atersoclerose e resposta vascular à lesão. A hipótese central à nossa proposta é que a interação entre PDI e NAD(P)H oxidase constitui uma via integrativa de um acoplamento entre Estresse do RE - uma condição frequente na qual a PDI transloca-se para a membrana e pode ser super-expressa - com o estresse oxidativo ligado à ativação da oxidase. Tais investigações poderão ser uma abordagem totalmente inovadora para entender porque, como e onde ocorre estresse oxidativo no sistema vascular. Assim, além de protocolos visando a dissecar mecanismos básicos da interação PDI-NAD(P)H oxidase, nossa hipótese será também testada em diferentes modelos relevantes à patogênese e manifestações clínicas da aterosclerose, com ênfase no remodelamento vascular. Desta forma, serão investigadas as características do estresse oxidativo e do RE em modelos de shear stress oscilatório, resposta vascular à lesão e calcificação vascular e da valva aórtica. Além disso, serão conduizidos estudos com fagócitos.

A NADPH oxidase é uma das maiores determinantes do estado redox vascular através da geração primária de radical superóxido. Várias, embora não todas suas subunidades são análogas à oxidase responsável pela atividade microbicida dos neutrófilos. A oxidase fagocitária é uma enzima complexa com múltiplos componentes localizados no citosol e na membrana celular responsável pela geração de ânion superóxido pelos leucócitos. Este por sua vez, serve como precursor das espécies reativas do oxigênio (EROs) que participam do mecanismo de defesa do organismo e atuam também como segundo mensageiros de diferentes estímulos celulares como fatores de crescimento e angiotensina II. A NADPH oxidase vascular está envolvida em inúmeras doenças vasculares, porém, os mecanismos envolvidos no controle da atividade da NADPH oxidase permanecem desconhecidos. Estudos recentes sugerem que a presença de grupos tióis no estado reduzido é importante para o funcionamento da enzima (JANISZEWSKI et al., 2000). As tiol oxido redutases são enzimas capazes de reduzir grupos tióis (SH) envolvidas no controle do balanço celular redox. Desta forma, o objetivo do presente estudo é investigar o papel de tiol oxido redutases na manutenção do estado redox dos tióis da NADPH oxidase e, consequentemente, na manutenção da atividade desta enzima. Dentre os membros da família das tiol oxido redutases, destaca-se a isomerase de disuulfetos protéicos. Esta proteína multifuncional e abundante em vários tipos celulares é capaz de efetuar oxidação, redução ou isomerização de grupos tiol em membranas celulares. Nosso objetivo é entender o papel funcional e os mecanismos moleculares da interação entre a PDI e a oxidase vascular e leucocitária.

Os neutrófilos quando ativados produzem compostos altamente reativos utilizados na destruição de microorganismos invasores. Estes compostos são derivados do ânion superóxido produzido por uma enzima associada à membrana chamada NADPH oxidase. Esta enzima catalisa a redução do oxigênio em ânion superóxido utilizando NADPH. A NADPH oxidase é uma enzima complexa formada por componentes localizados no citosol (p47PHOX, p67PHOX e p40PHOX) e na membrana (gp91PHOX, p22PHOX). Quando a célula é ativada os componentes citosólicos migram para a membrana celular gerando a forma ativa da oxidase. Diversos estudos tem sido realizados na tentativa de entender os mecanismos envolvidos na ativação da NADPH oxidase. Recentemente demostramos que o p47PHOX fosforilado por proteína quinase C pode ativar a enzima em um sistema cell free recombinante. A ativação da NADPH oxidase pelo p47PHOX fosforilado no entanto, era incompleta sugerindo a participação de um outro componente para ativação máxima da enzima. A adição de ácido araquidônico em neutrófilos isolados aumenta a geração de ânion superóxido por estas células. O mecanismo de ação envolvido permanece desconhecido. Por outro lado, a geração de produtos oxidativos faz da NADPH oxidase uma enzima altamente regulada. Recentemente demonstramos que o p40PHOX fosforilado por proteína quinase C inibe a NADPH oxidase em sistemas cell free. O objetivo dete projeto é investigar o efeito da proteína dissulfeto isomerase na modulação da atividade da NADPH oxidase em sistemas cell free recombinante e em neutrófilos isolados na tentativa de elucidar o mecanismo de ação envolvido na ativação e desativação desta enzima.

Diversos estudos demonstram uma correlação entre ativação da NADPH oxidase e fosforilação por proteína quinase C do componente citosólico p47PHOX. Porém o mecanismo de ativação da NADPH oxidase permanece desconhecido. Neste estudo demonstramos ativação da NADPH oxidase por proteína quinase C em um sistema "cell free" constituído por citosol e membrana isolado de neutrófilos e também num sistema "cell free" chamado de recombinante em que o citosol foi substituído por proteínas recombinantes p47PHOX, p67PHOX e Rac2. Os resultados sugerem que estes componentes citosólicos são essenciais e suficientes para a ativação da NADPH oxidase. Utilizamos este sistema recombinante para investigar o papel da fosforilação de um componente citosólico p40PHOX sobre a tivação da NADPH oxidase. Para isso o p40PHOX foi clonado na forma wild type e na forma mutante para serinas fosforiladas pela proteina quinase C. Conclui-se que a fosforilação do p40pHOX por esta quinase inibe a ativação da NADPH oxidase no sistema "cell free" recombinante