Luciano Andrade Silva.

A ressincronização das ovulações tem sido uma alternativa eficaz para intensificar o uso da inseminação artificial em tempo-fixo (IATF), que é uma importante biotécnica reprodutiva usada para suprir o mercado com animais de qualidade e precocidade e, consequentemente, aumentar a produtividade dos rebanhos bovinos. Com o uso da ultrassonografia Doppler para identificar as fêmeas não-gestantes aos 20 dias após a IATF, foi desenvolvido um protocolo de ressincronização superprecoce, que é iniciado em todas as fêmeas 12-14 dias pós IATF. Nesse sentido, pela presente proposta pretende-se estudar duas estratégias para o início do protocolo de ressincronização superprecoce: através da aplicação de benzoato de estradiol (BE), que embora tenha sido considerada segura para novilhas de corte zebuínas, existem controvérsias quanto ao seu uso em fêmeas gestantes; e através da aplicação de progesterona injetável (P4i), que pode ser uma alternativa eficaz ao uso de BE, cujos efeitos sobre o ambiente uterino e a manutenção da gestação ainda não foram completamente esclarecidos. Assim, a hipótese central desta proposta é que tanto o BE quanto a P4i associados a um dispositivo intravaginal liberador de P4 podem ser eficazes para sincronizar a emergência da onda folicular em protocolos de ressincronização de ovulação superprecoce. Adicionalmente, propomos que fêmeas de grupos genéticos diferentes (zebuínas vs. taurinas) dependem de doses específicas de BE e/ou P4i para que sua dinâmica folicular seja manipulada sem prejudicar o estabelecimento e a manutenção da gestação. O objetivo principal é determinar doses de BE e P4i capazes de manipular eficientemente a dinâmica folicular sem prejudicar o estabelecimento e manutenção da gestação em estratégias de ressincronização de ovulação superprecoce em fêmeas bovinas zebuínas e taurinas usando a ultrassonografia Doppler para diagnóstico de gestação. Para isso os mesmos estudos serão feitos em fêmeas zebuínas e taurinas. No estudo 1, serão avaliados os efeitos de diferentes doses de P4i de longa ação (LA) sobre o desenvolvimento folicular e concentração circulante de gonadotrofinas. Com base nos resultados deste estudo, o estudo 2 será conduzido para avaliar os efeitos de P4i sobre a emergência da nova onda folicular e ovulação em novilhas submetidas à ressincronização superprecoce; Os estudos 3 e 4 serão conduzidos no intuito de avaliar o efeito de diferentes doses de BE sobre a função do corpo lúteo (CL) e a síntese de prostaglandina F2alfa e sobre a expressão de genes reguladores do ambiente uterino. Por fim, no estudo 5 será avaliada a eficiência reprodutiva de novilhas e vacas de corte zebuínas e taurinas submetidas à ressincronização superprecoce com P4i ou BE. Os estudos feitos em colaboração entre as equipes do RS e de SP possibilitarão um avanço no entendimento dos efeitos da P4i LA sobre a dinâmica folicular, a ovulação e a liberação de gonadotrofinas, bem como dos efeitos do E2 sobre a função do CL e o ambiente uterino de fêmeas que são submetidas à ressincronização superprecoce de ovulações. A colaboração das equipes, por meio do compartilhamento de resultados quanto às respostas de fêmeas zebuínas e taurinas aos diferentes tratamentos possibilitará mais avanços e embasamento para o estabelecimento da estratégia adequada a ser aplicada em cada rebanho, potencializando a eficiência reprodutiva dos animais.

Na produção animal, diferentes performances entre machos e fêmeas são comumente encontradas na produção em larga-escala. No lambari do rabo amarelo Astyanax altiparanae as fêmeas são maiores em comparação aos machos, o que causa crescimento diferente entre os sexos e, portanto, ao final da engorda os lotes apresentam heterogeneidade em peso e tamanho, o que não se adequa à indústria de abate e processamento de pescados. Previamente, foi constatado que as fêmeas triploides (com 75 cromossomos) são estéreis. Esta condição gera crescimento diferencial e melhor rendimento e qualidade de carcaça, portanto, o cultivo de fêmeas triploides estéreis é mais vantajoso, embora não haja ainda na literatura científica e tampouco produto comercial com essas características. Neste projeto, será estruturado a empresa PEIXETEC para desenvolver um conjunto de procedimentos avançados que, sinergicamente serão combinados de forma a obter proles 100% fêmeas estéreis. Primeiramente, fêmeas tetraploides (fêmeas XXXX) serão induzidas à reprodução sendo realizada a ginogênese meiótica. A progênie resultante será masculinizada com hormônios gerando então pseudo-machos tetraploides ("machos" XXXX), que são geneticamente funcionais e produzirão espermatozoides diplóides (XX). Esse pseudo-macho tetraploide, quando cruzado com uma fêmea comum diploide (XX), gerará uma progênie 100% fêmea e estéril. Essa progênie diferencial será muito importante para a piscicultura com vistas à produção comercial em larga-escala. O produto final deste projeto serão os alevinos fêmeas estéreis. A comercialização desses alevinos diferenciados será realizada através de "e-commerce", através de um site específico para a venda de peixes vivos. Os procedimentos são inovadores e importantes para o futuro desenvolvimento da indústria de abate e processamento, o que inclui a indústria de enlatados. Outras fontes de recursos serão obtidas para manter as atividades da PEIXETEC.

A endotoxemia é uma consequência frequente de doenças gastrointestinais em equinos e leva à ativação da cascata inflamatória, incluindo a liberação de citocinas pró-inflamatórias, a partir do reconhecimento de patógenos e de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPS), por meio de receptores de reconhecimento padrão (PRR), que detectam um ligante específico, como o lipopolissacarídeo (LPS), principal endotoxina relacionada a esse quadro inflamatório em equinos. Estudos relataram efeitos da cólica materna sobre o feto equino e associaram abortos com os sinais de endotoxemia em éguas em terço final de gestação, o que sugere a influência dessa síndrome sistêmica sobre o feto equino. Níveis elevados de endotoxinas e citocinas inflamatórias foram demonstrados no líquido amniótico de mulheres com ruptura de membrana e trabalho de parto prematuro. A unidade fetoplacentária é um sistema dinâmico de trocas entre os fluidos materno e fetal. Na medicina humana, a amniocentese é amplamente utilizada para análise da viabilidade fetal. Entretanto, em equinos, a fisiologia dos fluidos fetais e sua composição química é pouco compreendida e poucos estudos foram desenvolvidos com essa finalidade, em especial com éguas prenhes enfermas. Este trabalho tem por objetivo determinar e quantificar mediadores inflamatórios, atividade do fator nuclear NFº-B e expressão gênica do receptor TLR-4 no sangue, líquido peritoneal e líquido amniótico de éguas em terço final de gestação, durante endotoxemia sistêmica materna, induzida por LPS intraperitoneal, a fim de compreender a fisiopatologia da endotoxemia em éguas gestantes e sua influência sobre o feto. Da mesma forma, em casos de abdômen agudo com indicação cirúrgica, faz-se necessária a realização de procedimentos anestésicos emergenciais em éguas gestantes, já com alterações sistêmicas oriundas da afecção envolvida. Nesses casos, a monitoração fetal durante a anestesia geral inalatória é raramente realizada e, atualmente, há diversas opiniões sobre qual método seria o mais indicado para este acompanhamento. Na medicina humana, na maioria das vezes, não se realiza a monitoração fetal adequada, mas preconiza-se o monitoramento através de ultrassonografia e a presença de uma equipe obstétrica de prontidão para intervir quando identificarem sofrimento fetal. Atualmente, o principal parâmetro para se avaliar o sofrimento fetal é a frequência cardíaca, que está diretamente correlacionada ao débito cardíaco fetal e pode ser facilmente avaliada pelo ultrassom ou por eletrocardiograma materno fetal. Este projeto idealiza submeter éguas sadias, em terço final de gestação, à anestesia geral inalatória e realizar avaliações comparativas de ultrassonografia abdominal, eletrocardiograma materno fetal, doppler de artéria umbilical e hemogasometria seriada do líquido aminiótico, a fim de predizer o melhor método de monitorização fetal, correlacionando tais dados aos da monitoração materna, de forma a garantir uma anestesia segura tanto para a égua, quanto para o feto.

Objetivos: 1) Criar um protocolo de tratamento hormonal de três manejos que visa sincronizar a onda de crescimento folicular e induzir a ovulação em tempo fixo, sem necessidade de detecção do cio ou de exames ultrassonográficos periódicos em éguas. 2) Estabelecer um protocolo eficiente de sincronização do estro e indução da ovulação em éguas. 3) Padronizar qual a dose de progesterona será suficiente para que ocorra atresia folicular. 4) Avaliar a necessidade de ablação folicular no início do protocolo juntamente com o tratamento hormonal para que ocorra o início de uma nova onda de crescimento folicular. 5) Determinar qual o momento ideal para a retirada do implante de progesterona e para a aplicação de uma segunda dose de prostaglandina. 6) Determinar qual o momento ideal da indução da ovulação com a utilização de GnRH e hCG após retirada do implante de progesterona.
Projeto de mestrado da aluna Ana Paula Reway no Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal ? FZEA ? USP.

A identificação do estado gestacional mais precocemente aos métodos atuais realizados por volta do 30o dia pós-inseminação permite uma redução no intervalo de inseminações, o que pode resultar em menor período para concepção e maior rentabilidade ao sistema de produção pecuário. A tese central do projeto é que biomarcadores no sangue estimulados pelo concepto são detectáveis no início da gestação. Isto pode permitir o desenvolvimento de um método precoce e inovador de diagnóstico da gestação em bovinos. Assim, tem-se como objetivo principal desenvolver um método de diagnóstico através da quantificação da abundância de genes estimulados por IFN-tau (ISGs) já conhecidos ou por novos marcadores aliado a uma identificação precoce dos animais não-gestantes pela avaliação da função luteal. Para isso, no Estudo 1 novos marcadores do estado gestacional poderão ser identificados através do estudo transcriptômico das células imunes no dia 14 e 18 pós-inseminação. Pretende-se caracterizar a abundância de ISGs já conhecidos e de novos transcritos estimulados pela presença do concepto, no sangue total, nas células imunes polimorfonucleares (PMNs) e em células imunes do leite entre os dias 12 e 20 de gestação em vacas de corte e leite. A luteólise será detectada por ultrassonografia Doppler através das mudanças no tamanho e vascularização do corpo lúteo (CL) e pelas concentrações circulantes de progesterona (P4) para detecção de vacas com CL não-funcional. Para mensuração das concentrações de P4 objetiva-se desenvolver e validar um ensaio imunoenzimático com alta sensibilidade e especificidade para evitar o uso de radioisótopos. No Estudo 2 será determinado a acurácia de métodos de diagnóstico da gestação realizados antes do dia 20 pós-IA, e baseados no uso isolado ou combinado da expressão de ISGs e da funcionalidade luteal (pela concentração de P4 ou ultrassonografia Doppler). Diante dos resultados obtidos, será avaliado nos Estudos 3 e 4 o impacto produtivo e econômico da utilização dos métodos propostos para identificar vacas de corte e leite não gestantes e propor um protocolo de re-inseminação precoce. Os novos conhecimentos e métodos inovadores aqui propostos embasarão o desenvolvimento de tecnologias para a pecuária de leite e corte. A exequibilidade será garantida pelo trabalho integrado de especialistas em cada etapa analítica e pela infraestrutura das instituições envolvidas.

Este projeto tem o objetivo de estudar as alterações morfológicas, vasculares e hormonais relativas ao corpo lúteo (CL) ao longo dos primeiros 35 dias da gestação de clones bovinos, comparando três tipos de apresentações gestacionais observadas após TE de embriões produzidos por SCNT com gestações de embriões naturalmente produzidos com a utilização de GnRH e hCG após retirada do implante de progesterona. Hipóteses: 1) O grupo controle e o grupo clone EPVECL (EP: embryo proper, VE: vesícula embrionária e CL: corpo lúteo) apresentação maiores concentrações ao longo do período estudado quando comparados aos grupos clone VECL e clone CL. 2) A morfometria do CL do grupo EPVECL e do grupo controle terá maior número e proporção de células luteínicas grandes do que os outros grupos. 3) O grupo controle e o grupo clone EPVECL apresentação corpos lúteos mais vascularizados e maior produção de P4 quando comparados aos grupos clone VECL e clone CL.
Projeto de mestrado da aluna Bárbara Monteiro da Silva Marques Alves no Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal ? FZEA ? USP.

Este projeto tem como objetivo geral caracterizar vias moleculares relacionadas ao desenvolvimento endometrial, placentário e luteal em três apresentações de prenhez de embriões clonados por SCNT no D35 da gestação em vacas receptoras Nelore. Os objetivos específicos são distinguir os aspectos macroscópicos e microscópicos das três apresentações. Os aspectos macroscópicos serão analisados ante mortem e post mortem por ultrassonografia e visualização dos tecidos após o abate. O perfil transcricional e proteico será traçado após a coleta dos tecidos. O segundo objetivo específico é traçar o perfil hormonal de P4 e IFN-τ a partir da TE até o dia do abate. As hipóteses desse projeto de pesquisa são: (1) Os grupos controle e o clone EPVECL possuem concentrações séricas fisiológicas de P4. Gestações anembrionárias e aquelas somente com CL persistente (grupos VECL e CL) apresentam menores concentrações de P4 no sangue materno, (2) a produção de IFN-τ é diminuída e/ou retardada nas gestações de clone quando comparadas às gestações de embriões naturalmente produzidos, (3) as alterações na produção de P4 e de IFN-τ levam a irregularidades na regulação hormonal, síntese e metabolização de eicosanoides pelo endométrio, regulação hormonal e angiogênese placentária e na esteroidogênese luteal, (4) o remodelamento endometrial e placentário será tardio no grupo VECL quando comparado ao grupo EPVECL, (5) as vias metabólicas relacionadas ao sistema imune, produção de histotrofo, regulação hormonal, angiogênese e esteroidogênese estarão diferencialmente expressas entre os grupos experimentais. Projeto de doutorado da aluna Estela Rose Araújo no Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal ? FZEA ? USP.

Este projeto tem como objetivo estudar as alterações morfológicas e vasculares relativas ao endométrio e mesométrio ao longo dos primeiros 35 dias da gestação de clones bovinos, comparando três tipos de apresentações gestacionais observadas após TE de embriões produzidos por SCNT com gestações de embriões naturalmente produzidos. Hipóteses: 1) Os grupos controle e clone EPVEVL (EP: embryo proper, VE: vesícula embrionária e CL: corpo lúteo) apresentam menor vascularização endometrial e mesometrial comparado com aos grupos clone VECL e clone CL; 2) Os grupos controle e clone EPVECL (EP: embryo proper, VE: vesícula embrionária e CL: corpo lúteo) apresentam maior concentração de progesterona no sangue, resultando em uma morfometria endometrial com maior quantidade de glândulas e vasos sanguíneos no endométrio quando comparados com os grupos clone VECL e clone CL.
Projeto de mestrado do aluno Marcelo de Luna Freire Oliveira no Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal ? FZEA ? USP.

Objetivos: 1) Estudar as interações entre: a. Tamanho e vascularização do folículo pré-ovulatório x tamanho e vascularização do corpo lúteo. b. Tamanho e vascularização do corpo lúteo x fertilidade. 2) Comparar os resultados obtidos do grupo de vacas em lactação e de novilhas. 3) Propiciar um método não invasivo de análise ultrassonográfica para prever o sucesso de uma futura gestação. Hipóteses: 1) Um folículo pré-ovulatório maior e mais vascularizado resulta na formação de um corpo lúteo maior e mais vascularizado. 2) Vacas que apresentam folículos pré-ovulatórios maiores geram corpos lúteos maiores e mais vascularizados, sendo as taxas de gestação resultantes significativamente maiores que em animais que apresentam uma situação oposta.
Projeto de iniciação científica do aluno Mauricio Guilherme da Silva ? PIBIC ? FZEA ? USP.

Objetivos: 1) Descrever o crescimento folicular de éguas submetidas ao protocolo hormonal descrito. 2) Determinar qual o momento ideal para a retirada do implante de progesterona e para a aplicação de uma segunda dose de prostaglandina. 3) Determinar qual o momento ideal da indução da ovulação com a utilização de GnRH e hCG após retirada do implante de progesterona. Hipóteses: 1) Em torno de 80% das éguas sincronizadas apresentam folículo dominante com diâmetro superior a 35 mm e ecotextura uterina elevada quatro dias após a retirada do implante intravaginal de progesterona. 2) O protocolo de sincronização do estro e indução de ovulação em éguas proposto apresenta uma eficiência de no mínimo 70%.
Projeto de iniciação científica da aluna Marília Alves Ferreira ? Santander ? FZEA ? USP.

O uso de técnicas de reprodução assistida é uma alternativa para solucionar problemas reprodutivos em espécies domésticas e em humanos. Todavia, existe a preocupação de que o cultivo in vitro de gametas e embriões possa gerar mudanças epigenéticas as quais podem levar à maior pré-disposição a problemas cardíacos, reprodutivos ou desenvolvimento de tumores na vida adulta. Alterações epigenéticas são reguladas por metilação do DNA, por modificações pós-traducionais de histonas ou por microRNAs (miRNA). Os miRNAs são RNAs não codificadores de proteínas que regulam a expressão gênica durante diferentes processos de diferenciação tecidual. Recentemente, vesículas secretadas por células, chamadas de exossomos e microvesículas, foram encontradas em diferentes fluídos corporais contendo material bioativo incluindo miRNAs. Estas vesículas são consideradas uma nova classe de comunicação celular com possíveis implicações em diferentes processos fisiológicos. Entretanto o seu papel na aquisição de competência dos gametas e no desenvolvimento embrionário ainda é amplamente desconhecido. A hipótese que será testada é que vesículas contendo miRNAs secretadas por células do trato reprodutivo feminino modulam mudanças epigenéticas durante o cultivo in vitro de gametas e embriões. Para testar esta hipótese vesículas serão isoladas a partir de líquido folicular ou meio de cultura de células do oviduto e adicionadas nos meios de cultura de oócitos e embriões. O primeiro objetivo é determinar a relação entre miRNAs e mudanças epigenéticas adquiridas durante a maturação de oócitos e o desenvolvimento embrionário em bovinos. O segundo objetivo é determinar os efeitos exercidos por vesículas secretadas por células do sistema reprodutivo nas taxas de maturação oocitária, fertilização e clivagem embrionária in vitro. O terceiro objetivo é determinar a função das vesículas extracelulares e miRNAs na maturação de oócitos e produção de embriões bovinos em alta e baixa tensão de oxigênio. Os resultados desse projeto ajudarão a estabelecer o papel de vesículas secretadas por células do sistema reprodutivo na determinação das características epigenéticas adquiridas durante o cultivo in vitro de oócitos e embriões. Os resultados obtidos nesse projeto permitirão o desenvolvimento de protocolos mais similares à condição fisiológica para a produção in vitro de embriões, com grande impacto na indústria de reprodução assistida em bovinos e em humanos.

A produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos é uma biotecnologia amplamente difundida no Brasil. Todavia o sistema de produção in vitro, embora viável tecnicamente, ainda provoca alterações celulares e moleculares nos oócitos e embriões, resultando em uma eficiência abaixo da desejável, com taxas que variam de 30 a 50% na produção embrionária. Assim, gerar metodologias que levem à maior conversão de oócitos a embriões e compreender os mecanismos que determinam a competência oocitária é de interesse estratégico para o mercado nacional de produção in vitro de embriões. O microambiente folicular e o metabolismo da célula oocitária são fundamentais para determinar a aquisição da competência pelo oócito. Experimentos avaliando rotas intracelulares ou intercelulares durante a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário serão conduzidas com objetivos finais de investigar mecanismos associados com a competência oocitária e de gerar incremento nas taxas de PIVE bovinos. A primeira estratégia de pesquisa terá foco no metabolismo oxidativo de lipídeos e atividade mitocondrial. Estudos prévios conduzidos por nosso grupo de pesquisas demonstraram deficiência em relação à migração e quantidade de mitocôndrias ativas e gotas lipídicas durante a maturação in vitro (MIV) comparado ao processo in vivo. Considerando que as mitocôndrias oocitárias são responsáveis pelo aporte energético até o estádio de blastocisto, e que a oxidação dos ácidos graxos nas mitocôndrias é o principal mecanismo celular responsável pelo fornecimento energético para o desenvolvimento oocitário e embrionário, a atividade de mitocôndrias e gotas lipídicas é determinante para o sucesso da PIVE. Há relatos de que substâncias moduladoras da beta-oxidação, como a L-carnitina e o bezafibrato, possam estimular o processo oxidativo e levar a incremento nas taxas da produção de embriões. Portanto, esta linha de experimentação visa comparar a atividade mitocondrial e o metabolismo lipídico entre a produção in vivo de embriões e a PIVE, bem como determinar o efeito da adição de moduladores da oxidação mitocondrial (L-carnitina e bezafibrato) durante a MIV nas taxas de produção in vitro. Para esse fim, (1) serão avaliadas tanto o comportamento lipídico e mitocondrial e a beta-oxidação, quanto fatores de estresse celular durante a maturação e desenvolvimento embrionário em sistemas in vivo e in vitro. A segunda e terceira estratégias de pesquisa terão foco nas rotas extracelulares de comunicação entre células do microambiente folicular. Será investigada a hipótese que proteínas presentes em vesículas secretadas por células (VSC) foliculares e presentes no líquido folicular (LF) e miRNAs presentes nas células do cumulus modulam a qualidade oocitária. Para este fim, (2) será feita a identificação e quantificação de proteínas no LF presentes em VSCs (microvesículas e exossomos) relacionando-as à competência oocitária; e (3) determinação do perfil dos miRNAs das células do cumulus correlacionando-os com a competência oocitária. Para os miRNAs relacionados ao potencial de desenvolvimento oocitário, testes funcionais serão realizados através da adição de replicadores (miRNA mimics) ou inibidores (miRNA inhibitors) destes miRNAs alvos, e posterior avaliação do efeito nas taxas de PIVE. A partir dos resultados deste projeto espera-se compreender os efeitos dos sistemas in vitro sobre a beta-oxidação e metabolismo lipídico-mitocondrial, bem como esclarecer os mecanismos de comunicação intercelular dentro no folículo ovariano, caracterizar o perfil de miRNAs nas células do cumulus, e identificar possíveis miRNAs e proteínas biomarcadores de qualidade oocitária. Ainda, espera-se desenvolver novas ferramentas para intensificar a produção in vitro de embriões bovinos, através do incremento na produção embrionária pela adição de moduladores da oxidação mitocondrial que não aumentem o estres

Existem questionamentos quanto à fonte de melatonina que promove sua ação no desenvolvimento folicular. Durante muitos anos foi assumido que a melatonina observada no fluido folicular era derivada da circulação periférica, porém ainda no século passado já existiam sugestões circunstanciadas de que o ovário seria capaz de sintetizar melatonina, visto que havia sido constada a presença desse hormônio e de seus precursores (serotonina e N-acetilserotonina), assim como a presença de atividade das enzimas envolvidas em sua síntese (AA-NAT e ASMT) em extratos ovarianos de ratos e humanos. Recentemente foi demonstrado que os ovócitos de ratas são capazes de sintetizar melatonina e que há expressão do gene da Asmt, tanto em células do cumulus, como em ovócitos oriundos de ovários de ratas em diferentes estágios de maturação ovocitária (FAPESP 2009/02513-0). Partindo desse princípio, a presente pesquisa investigará quais seriam os possíveis agentes indutores dessa produção local. A nossa hipótese é de que as gonadotrofinas estejam estimulando a referida síntese. Dessa forma, a presente pesquisa testará a hipótese de que a adição de gonadotrofinas no meio de cultivo para maturação in vitro será capaz de induzir a atividade das enzimas responsáveis pela síntese (TPH, AA-NAT e ASMT) de melatonina em complexos cumulus-ovócitos de ratas. Os resultados obtidos a partir de uma pesquisa anterior (FAPESP 2009/02513-0) sugerem que a expressão gênica dos receptores para melatonina (MT1 e MT2) nos complexos cumulus-ovócitos de ratas possa ser um indicativo de que o mecanismo de ação da melatonina na maturação ovocitária seja direto, via receptor. Considerando essa prerrogativa, a presente proposta também terá como objetivo de responder a seguinte pergunta: Qual é o efeito da melatonina sobre a maturação in vitro em ratas traduzida pela expressão de proteínas componentes do Fator Promotor da Maturação (MPF)?. Embora existam vários estudos demonstrando o efeito benéfico da melatonina sobre o processo de maturação ovocitária em diferentes espécies, a literatura carece de pesquisas sobre as ações da melatonina na maturação in vitro na espécie equina. Existem limitações quanto às condições de cultivo in vitro para maturação dos ovócitos, pois embora várias condições de cultivo in vitro tenham sido testadas, nenhuma delas tem melhorado efetivamente a competência de desenvolvimento dos ovócitos de equinos. Dessa forma, a proposta de testar o papel fisiológico da melatonina no processo de maturação ovocitária em éguas. O projeto tem a proposta de: a) investigar a o efeito da adição das gonadotrofinas no meio de cultivo para maturação ovocitária sobre a atividade das enzimas envolvidas na síntese de melatonina em complexos cumulus-ovócitos oriundos de ovários imaturos de ratas (experimento 1); b) investigar o efeito da adição da melatonina no meio de cultivo para maturação ovocitária sobre a expressão das proteínas do Fator Promotor da Maturação (MPF) em complexos cumulus-ovócitos oriundos de ovários imaturos de ratas (experimento 2); c) investigar o efeito da adição de melatonina no meio de cultivo para maturação ovocitária sobre as taxas de maturação dos ovócitos de éguas (experimento 3); d) verificar a expressão dos genes dos receptores para melatonina, dos genes das gonadotrofinas e dos genes envolvidos no processo de apoptose em ovócitos de éguas maturados in vitro com ou sem melatonina (experimento 3). O projeto terá duração de vinte e quatro meses e será desenvolvido no Laboratório de Teriogenologia Dr. O.J. Ginther da FZEA em Pirassununga-SP (experimento 3) e no Laboratório de Neurobiologia do Departamento de Fisiologia e Biofísica do ICB/USP, em São Paulo-SP (experimentos 1 e 2).

Hipóteses: 1) Prenhezes complicadas no último trimestre da gestação apresentam expressão anormal de fatores relacionados ao desenvolvimento vascular; 2) Nível baixo de oxigênio é o fator que desencadeia a expressão anormal de fatores relacionados ao desenvolvimento vascular e pode ser mensurado no fluido alantoideano; 3) sVEGFR-1 sequestra o VEGF causando incompleto desenvolvimento e remodelamento da placenta e consequentemente as patologias observadas na placenta e no feto; 4) Os efeitos maternos sistêmicos da expressão anormal de fatores de crescimento relacionados ao desenvolvimento vascular pela placenta não são observados na vaca devido ao tipo de placenta, synepiteliocorial, em contraste com a placentação hemocorial na mulher o qual é vulnerável à pré-eclâmpsia. 
Projeto de mestrado da estudante Izabelle Balbi Jardim no Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal ? FZEA ? USP.

Objetivos: 1) Investigar os mecanismos que controlam o parto de vacas gestantes de embriões clonados por SCNT e naturalmente produzidos. 1.	Estudar as alterações morfológicas e vasculares da placenta durante o terço final da gestação por meio da ultrassonografia em modo B e Doppler e por histomorfometria de placentônios coletados imediatamente e após o parto. 2) Descrever as alterações de concentração de cortisol, progesterona (P4), um metabólito de prostaglandina F2α (PGFM), estradiol (E2), estrona e sulfato de estrona no sangue materno durante o terço final da gestação. 3) 	Quantificar a expressão relativa dos genes NR3C1, PTGS2, HSD3B1, CYP17A1, CYP19A1, Star e PGR em placentônios coletados imediatamente e após o parto. 4) 	Estudar por imuno-histoquímica e western-blotting a localização e quantidade das proteínas COX2, PR, GR, CYP17, CYP19, 3ßHSD e CD45 em placentônios coletados imediatamente e após o parto. 5) 	Comparar os resultados obtidos nas análises propostas entre vacas gestantes de embriões clonados por SCNT e naturalmente produzidos.
Projeto de doutorado do estudante Fábio Luís Valério Pinaffi no Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal ? FZEA ? USP.

Objetivos: 1) Padronizar e validar o uso do hemogasômetro portátil humano (i-Stat, Abbott) para avaliações de fluido alantoideano bovino entre os dias 150 e 270 da prenhez. 2) Comparar os valores da análise de pO2 e pH obtidos pelo hemogasômetro com os valores obtidos pelo sensor de detecção de oxigênio (Neofox Phase Measurement System) e pH-metro laboratorial, em análises realizadas com sangue e fluido alantoideano. 3) Comparar os valores da análise de Na+, K+ e Ca++ obtidos pelo hemogasômetro com os valores por fotometria de chama com sangue e fluido alantoideano. 
Projeto de iniciação científica do estudante Marcelo de Luna Freire Oliveira ? PIBIC ? FZEA ? USP.

Objetivos: 1) Descrever a curva de concentração plasmática de arginina, nitrito e nitrato, a fim de se compreender melhor a biodisponibilização deste aminoácido e seus metabólitos na corrente sanguínea da égua. 2) Determinar o momento de máxima concentração plasmática de arginina após administração e sua meia vida da arginina em equinos. 3) Determinar o protocolo de suplementação mais adequado para a espécie equina.
Projeto de estágio dos estudantes Pedro Henrique Salles Brito e Marília Alves Ferreira no Laboratório de Teriogenologia Dr. O. J. Ginther ? ZMV ? FZEA ? USP.

Objetivos: 1) Determinar por espectrometria de massas os perfis lipídicos das membranas plasmáticas das subpopulações espermáticas separadas pelo Equipure®; 2) Correlacionar os diferentes perfis lipídicos espermáticos com características seminais pós-descongelação.
Projeto de Iniciação Científica do estudante Pedro Henrique Salles Brito.

Objetivos: 1) Estudar as correlações entre: o	Tamanho e vascularização do folículo pré-ovulatório x tamanho e vascularização do corpo lúteo; Tamanho e vascularização do corpo lúteo x fertilidade; 	Tamanho e vascularização do corpo lúteo x produção de progesterona. 2) Propiciar um método para prever o sucesso de uma futura gestação.
Hipóteses: 1) Um folículo pré-ovulatório maior e mais vascularizado resulta na formação de um corpo lúteo maior e mais vascularizado; 2) O corpo lúteo maior e mais vascularizado tem uma maior capacidade de produção de progesterona e, consequentemente, maior possibilidade de manter uma gestação.

Prolactin (PRL) is a polypeptide hormone secreted by the anterior pituitary by lactotropic cells and has specialized roles in mammalian female reproduction. Although PRL is primarily produced by the anterior pituitary, it has been detected in several extrapituitary sites, including the mammary gland and the uterus. Prolactin is believed to be the most important constituent of the luteotropic complex in rodents and carnivores. In sows, PRL stimulates progesterone production of luteal cells and may be involved in the beginning of the luteal phase. In ewes, PRL does not appear to be necessary for luteal function, but acts in consonance with LH for maintenance of the CL and thereby contributes to the luteotropic complex. In cows, LH is the dominant luteotropic factor, whereas PRL has little or no luteotropic activity. However, binding sites for PRL are present in the CL of cows. In mares, there has been no direct indication that the PRL is involved in luteal function, but specific receptors in the CL for equine PRL have been reported. The PRL receptors were uniformly distributed in the mature luteal tissue, suggesting a capacity for PRL synthesis by luteal cells and a direct influence of PRL on CL function in mares.
Financiado pela Eutheria Foundation, Cross Plains, WI.
Colaborador: Dr. OJ Ginther, University of Wisconsin-Madison, USA.
Projeto de Mestrado do estudante Fábio Luis Valério Pinaffi.

O primeiro objetivo deste projeto visa desenvolver uma metodologia para avaliar precocemente a vascularização do complexo uterino-placentário-fetal com o uso da ultrassonografia Doppler (técnica não-invasiva) predizendo a evolução da gestação de clones bovinos por SCNT. Os custos da clonagem em bovinos poderão ser reduzidos pela terminação precoce da gestação em receptoras diagnosticadas como susceptíveis ao abortamento. As receptoras poderão ser reutilizadas. Além disso, essas avaliações proporcionarão um estudo descritivo detalhado por ultrassonografia Doppler de todas as alterações vasculares observadas no útero, embrião, placenta e feto durante toda a gestação de clones por SCNT comparada à de embriões naturalmente produzidos. 
O segundo objetivo deste projeto visa estudar as alterações patológicas vasculares observadas durante o último trimestre da gestação de clones. Prenhezes de clones estão associadas a patologias como a síndrome ?large offspring?, hidroalantose, placentomegalia e edema em diferentes partes do fetal. A taxa de crescimento fetal se eleva no último trimestre com paralelo incremento nas funções placentárias. A placenta de clones provavelmente não é, desde as fases iniciais de sua formação, desenvolvida adequadamente para se adequar às exigências fetais no final da gestação. Este estudo investigará se a produção desequilibrada ou descontrolada de fatores relacionados ao desenvolvimento vascular está presente nos distúrbios da gestação de clones, o que sugeriria similar fisiopatologia com a pré-eclâmpsia na mulher. A pré-eclâmpsia atinge em torno de 3-5% de todos os nascimentos no mundo. O aumento descontrolado da expressão gênica de fatores relacionados à angiogênese eleva a produção de sVEGFR-1 e este, quando liberado no sistema sangüíneo da mulher, causa instabilidade vascular e distúrbios sistêmicos, inicialmente a hipertensão e proteinúria. Provavelmente a diferença no tipo de placenta entre humanos (hemochorial) e bovinos (synepiteliochori

Nossos estudos prévios usando ultrassonografia Doppler em novilhas prenhes por inseminação artificial demonstraram que a perfusão uterina aumentou no corno uterino ipsilateral ao embrião do dia 18 aos 40 da gestação. A perfusão no corno oposto ao embrião manteve-se baixa até o dia 32, quando então iniciou seu aumento. A hipótese que o aumento da perfusão vascular endometrial em novilhas é mediada pelo concepto foi confirmada (Silva & Ginther 2010). Além disso, alterações na perfusão vascular endometrial também têm sido descritas em éguas (Silva et al. 2005; Silva & Ginther 2006). O processo pelo qual os vasos sanguíneos se multiplicam (angiogênese) é regulado pela produção tecidual do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e de seus receptores (VEGFR-1 e VEGFR-2) (Ferrara 2003), sendo sugerido que a presença do concepto tem um papel importante na regulação de expressão desses fatores (pesquisa em andamento).
Em clones por SCNT, elevadas taxas de perda de gestação são observadas até o Dia 30 (Wells et al. 1999; Edwards et al. 2003; Wells et al. 2004; Campbell et al. 2007; Merighe 2007). Placentação anormal com reduzido número de placentomas e inadequada vascularização do saco alantóide tem sido uma observação comum durante o primeiro trimestre de perdas gestacionais de clones por SCNT (Wells et al. 1999; Hill et al. 2000). Um dos períodos importantes de perda embrionária em clones ocorre em torno da implantação. A taxa de sobrevivência após TE até o Dia 30 é em torno de 30% (Merighe 2007). Essas perdas podem estar relacionadas com uma ineficiente sinalização do embrião para o reconhecimento materno da gestação, à falha do embrião na estimulação do remodelamento vascular e estrutural uterino e à aspectos imunológicos. Um segundo período crítico ocorre entre os Dias 30 e 60 da gestação. Aproximadamente 40% dos conceptos que sobreviveram até o Dia 30 morrerão neste curto período (Merighe 2007) onde placentas hipoplásicas com cotilédones rudimentares são observ

Objetivos: 1)	avaliar a quantidade total de mtdna em ovócitos de éguas novas e idosas, antes e após maturação in vivo, 2)	verificar se há aumento da quantidade de mtdna em ovócitos durante a maturação folicular in vivo em éguas, 3)	determinar se a coloração por brilliant cresyl blue (corante usado para determinar a atividade intracelular de G6PDH) em ovócitos está relacionada com o desenvolvimento folicular e com a idade da égua, e 4)	determinar se a coloração por BCB tem correlação com a quantidade de mtDNA de ovócitos equinos.
Projeto de Doutorado do estudante Reno Roldi de Araújo.