Daniela Sanchez Bassères.

O adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), que representa mais de 90% dos tumores de pâncreas, é um tumor altamente agressivo e letal, apresentando taxa de sobrevida em 5 anos de menos de 10%. Esse prognóstico ruim se deve, entre outras coisas, à disseminação metastática precoce e extremamente agressiva deste tipo de tumor e à resistência à quimioterapia. Uma das características mais importantes para aquisição de capacidade mestastática e quimiorresistência é a aquisição e manutenção de um fenótipo tronco-tumoral pelas células tronco tumorais (CTTs), uma subpopulação de células tumorais que apresenta uma capacidade excepcional de iniciar a formação de tumores, sendo consideradas responsáveis pela disseminação tumoral, pelo crescimento de mestástases e pela resistência a terapias citotóxicas. Um dos problemas que limita avanços terapêuticos no PDAC é que os mecanismos responsáveis pela manutenção de subpopulações de CTTs capazes de disseminação metastática e quimioresistência ainda são pouco compreendidos. Considerando-se que a aquisição do fenótipo tronco-tumoral é um processo majoritariamente epigenético, nossa hipótese é que RNAs não codificadores longos (lncRNAs) são atores importantes na aquisição deste fenótipo em PDAC e podem, portanto, também servir de biomarcadores de prognóstico. Esta hipótese é embasada por relatos da literatura que demonstram que lncRNAs regulam a maquinaria epigenética e contribuem para a carcinogênese, incluindo vários relatos que enfatizam a importância dos lncRNAs na biologia das CTTs em diferentes tumores. Este projeto tem como objetivo a identificação e validação funcional de lncRNAs envolvidos no estabelecimento do fenótipo tronco-tumoral. Para tanto, inicialmente avaliaremos o perfil transcricional global de lncRNAs associado ao fenótipo tronco-tumoral através de dois modelos distintos: 1) análise transcritômica em um modelo de xenotumores derivados de pacientes representativo da heterogeneidade tumoral de PDAC; e 2) análise transcritômica correlacionada ao índice de stemness em pacientes de PDAC através da análise de dados públicos disponíveis no TCGA. Em seguida, validaremos a expressão diferencial dos lncRNAs identificados em modelos celulares de PDAC enriquecidos para a subpopulação de CTTs, seguido da identificação de vias enriquecidas associadas aos lncRNAs identificados através da análise de redes de co-expressão entre lncRNAs e genes codificadores. Finalmente, realizaremos ensaios funcionais para avaliar a ação dos lncRNAs candidatos no fenótipo tronco de células tumorais pancreáticas in vitro e avaliaremos seu potencial como biomarcador em biopsias líquidas de pacientes portadores de PDAC localizado e metastático. Este conhecimento, não só poderá contribuir com a identificação de novos biomarcadores que podem ser usados para prever prognóstico ou monitorar recidivas, mas também o conhecimento adquirido poderá fornecer pistas importantes para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas adjuvantes com potencial de melhorar significativamente o prognóstico dos pacientes portadores de PDAC.

O câncer de mama é a doença maligna mais comum que afeta as mulheres, sendo o subtipo triplo negativo (TN) considerado o de pior prognóstico com alta frequência de metástase. Sabe-se que as plaquetas possuem papel importante na metástase tumoral , que podem receber RNAs e proteínas de células tumorais que ocasionam uma modificação na funcionalidade das mesmas. Essas plaquetas educadas pelo tumor (TEPs) promovem a sobrevivência das células tumorais circulantes (CTCs) protegendo da vigilância imunológica, bem como influenciam na adesão celular, parada na vasculatura e permeabilidade vascular, contribuindo para disseminação metastática. A assinatura de miRNAs (pequenos RNAs não-codificantes) de TEPs tem sido apontada como ferramenta de biópsia líquida com potencial diagnóstico, prognóstico e terapêutico. Entretanto, a assinatura de miRNAs de TEPs em tumores TN, bem como a associação com CTCs e outras células ainda não foi elucidada. A hipótese é que o perfil de miRNAs das TEPs de pacientes com TN metastático contribui para disseminação tumoral. A expressão de miRNAs de plaquetas é anormal e específica para cada tumor. Os miRNAs de plaquetas teriam maior precisão e especificidade do que os marcadores convencionais de detecção tumoral e miRNAs circulantes no diagnóstico de tumor. Os miRNAs enriquecidos com plaquetas podem influenciar o tumor: regulando a proliferação, na metástase, resposta imune, trombose e terapia antitumoral [5,6]. Temos uma oportunidade única de combinar a expertise de centros de pesquisa de 2 regiões do país para elucidar o perfil molecular de TEPs em tumores TN através do sequenciamento NGS. Posteriormente, correlacionar a assinatura de miRNAs com o fenótipo invasivo e tronco das CTCs, caracterização fenotípica de TAMs e ativação do endotélio através de estudos funcionais. Esse conhecimento será importante para a identificação de alvos terapêuticos e biomarcadores, que vão melhorar a precisão diagnóstica e a predição prognóstica.

O câncer de pulmão é o tipo de câncer que apresenta o maior índice de mortalidade em todo o mundo. As alterações genéticas mais frequentes em câncer de pulmão são as mutações pontuais no oncogene que codifica a GTPase KRAS. Apesar destas mutações estarem diretamente ligadas à oncogênese, terapias que visam inibir diretamente a proteína Ras falharam em ensaios clínicos. Nesse sentido, para que novos e melhores alvos terapêuticos para o câncer de pulmão se tornem disponíveis, será preciso identificar as vias induzidas por KRAS, que estão diretamente envolvidas com a aquisição de propriedades malignas importantes. Uma das propriedades mais importantes na oncogênese é a aquisição de capacidade metastática tumoral. Desta forma, o objetivo deste projeto é identificar alvos terapêuticos que inibam as metástases tumorais induzidas pelo oncogene KRAS no pulmão. Com base em relatos recentes mostrando que a forma oncogênica de KRAS promove, não só a iniciação tumoral, mas também promove a aquisição de um fenótipo metastático, a hipótese deste projeto é que (1) a capacidade mestastática tumoral induzida por KRAS no pulmão é potencializada pela quinase IKKβ; e (2) que a inibição desta quinase reduzirá a capacidade invasiva celular e metastática tumoral. Esta hipótese foi formulada com base em estudos anteriores, os quais demonstraram que o principal substrato da IKKβ, o fator de transcrição NF-B, é ativado por KRAS em tumores pulmonares in situ de forma dependente da IKKβ, que o NF-B é capaz de promover metástase em diferentes modelos tumorais, e que a inibição da atividade da IKKβ com um inibidor farmacológico em um modelo animal de câncer de pulmão induzido por KRAS, diminui o crescimento tumoral e a progressão tumoral para graus histológicos mais avançados. A justificativa do projeto de pesquisa proposto é que espera-se elucidar os detalhes moleculares envolvidos na via controlada por KRAS que medeia a aquisição de capacidade invasiva e metastática. Além disso, espera-se que este projeto possa fornecer novas estratégias para o desenvolvimento de terapias antitumorais.

Mutações pontuais que ativam o oncogene KRAS são muito frequentes em diversas neoplasias humanas, principalmente no carcinoma pancreático. Apesar destas mutações estarem ligadas à oncogênese, diferentes abordagens para inibir as proteínas Ras diretamente fracassaram na clínica. Portanto, para que melhores alvos terapêuticos para as neoplasias induzidas pela KRAS oncogênica se tornem disponíveis, será necessário identificar as moléculas efetoras da proteína KRAS, que são críticas para a oncogênese. Os RNAs não codificadores longos (lncRNAs) atuam regulando a expressão gênica através de mecanismos epigenéticos que afetam a estrutura da cromatina. Eles podem atuar como importantes mediadores do processo de surgimento e evolução do câncer, atuando como oncogenes ou genes supressores de tumor. Todavia, os lncRNAs envolvidos na transformação maligna induzida pela KRAS permanecem desconhecidos. O objetivo deste projeto é identificar lncRNAs que desempenham um papel importante no fenótipo maligno induzido pelo oncogene KRAS. Nossa hipótese pressupõe que a transformação celular pela KRAS altera o padrão de expressão de alguns lncRNAs, alterando assim, suas funções e contribuindo para a transformação maligna. Para testar esta hipótese, utilizaremos os dados já obtidos de hibridização de microarranjos de DNA para comparar o perfil de expressão de lncRNAs em linhagens primárias de pâncreas na presença/ausência da forma oncogênica da KRAS com o perfil de RNAseq de amostras clínicas de tumores pancreáticos. Esta análise permitirá identificar os lncRNAs mais relevantes para validação por qRT-PCR. Assim validaremos a expressão diferencial dos lncRNAs identificados, tanto nas linhagens primárias pancreáticas, quanto em linhagens tumorais de pâncreas, com ou sem inibição de KRAS por interferência de RNA (RNAi). Uma vez confirmada a regulação por KRAS, faremos a análise funcional de um lncRNA diferencialmente expresso, que será escolhido com base, tanto na correlação da sua expressão com a presença de mutações em KRAS em tumores pancreáticos, quanto na sua função predita ou descrita na literatura. Esta análise funcional será feita através da modulação da expressão do lncRNA escolhido nas células humanas de câncer de pâncreas dependentes da KRAS oncogênica, seguida de ensaios funcionais celulares in vitro em in vivo. Espera-se que este projeto contribua para um melhor entendimento dos mecanismos moleculares acionados pela oncoproteína KRAS no câncer de pâncreas, enquanto que, ao mesmo tempo, espera-se que ele forneça o conhecimento necessário para o desenvolvimento de novas terapias anti-tumorais.

O câncer de pulmão induzido por mutações oncogênicas na GTPase KRAS é uma doença muito frequente, para a qual não existem terapias efetivas. Apesar destas mutações estarem ligadas diretamente à oncogênese, diferentes abordagens para inibir as proteínas RAS diretamente não obtiveram sucesso. Portanto, para que melhores alvos terapêuticos para o câncer de pulmão se tornem disponíveis, será necessário identificar as vias sinalizadoras ativadas por KRAS que estão diretamente envolvidas com a aquisição de propriedades malignas importantes. Uma das propriedades mais importantes na oncogênese é o desenvolvimento e a manutenção de um fenótipo tronco tumoral pelas células iniciadoras de tumor (CITs). CITs são definidas como uma subpopulação de células tumorais capazes de se autorrenovar, iniciar tumores e sustentar o crescimento tumoral. Elas são também resistentes à quimio- e radioterapia e acredita-se que elas sejam responsáveis pela reincidência tumoral e pela disseminação metastática. O desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas dirigidas a estas células é imprescindível para melhorar a eficácia da terapia antitumoral. Uma vez que a KRAS está associada à manutenção e expansão do fenótipo tronco tumoral, o objetivo deste projeto é identificar novos alvos terapêuticos que contribuam para o fenótipo tronco tumoral induzido pelo oncogene KRAS no epitélio pulmonar. Com base neste objetivo, nós postulamos (1) que a quinase IKK promove o fenótipo tronco tumoral; e (2) que a inibição de IKK reduzirá a quantidade de CITs em linhagens celulares pulmonares com mutações em KRAS. Esta hipótese foi formulada com base em estudos recentes indicando que a inibição farmacológica da IKKβ reduz o número de CITs mamárias e de próstata e que a inibição da atividade da IKKβ com um inibidor farmacológico em um modelo animal de câncer de pulmão induzido por KRAS diminui o crescimento e a progressão tumoral para graus histológicos mais avançados. Para testar estas hipóteses, nós utilizaremos estratégias farmacológicas e genéticas para inibir a IKKβ e avaliaremos como esta inibição afeta o numero de CITs, a expressão de marcadores de CITs e a capacidade de CITs purificadas de formarem tumoresferas e se autorrenovarem in vitro. A justificativa que rege o projeto é que espera-se elucidar os mecanismos moleculares envolvidos na via controlada por KRAS que promove a manutenção e expansão das CITs, que, por sua vez, são importantes para a recidiva e disseminação tumorais. Espera-se também que este projeto vá contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento do câncer de pulmão e outras neoplasias com mutações oncogênicas em KRAS.

O câncer de pulmão é o líder em mortalidade devido ao câncer no mundo e no Brasil. Esta alta taxa de mortalidade se deve, não só a sua alta incidência, mas também à ausência de tratamentos eficazes. Os mecanismos moleculares mais frequentes que desencadeiam o câncer de pulmão são as mutações no gene que codifica a GTPase KRAS, que resultam na sua ativação constitutiva. Como a inibição direta da atividade biológica da KRAS falhou em ensaios clínicos, componentes das vias de sinalização dependentes de KRAS vem sendo estudados como alvos terapêuticos indiretos para o tratamento de neoplasias induzidas pela forma oncogênica desta GTPase. O nosso grupo demonstrou recentemente que um dos componentes importantes das vias desencadeadas por KRAS é a quinase Aurora A (AURKA). A AURKA promove as propriedades oncogênicas de células pulmonares transformadas por KRAS e sua inibição reduz estas propriedades de forma dependente da presença de KRAS oncogênica. Entretanto o papel desta quinase para a formação e manutenção de tumores, bem como para a aquisição de um fenótipo invasivo permanece pouco explorada. Dessa forma, o objetivo desse projeto é determinar o papel da quinase Aurora A para o fenótipo tronco-tumoral das células iniciadoras de tumor. O modelo das células iniciadoras de tumor (CITs) propõe que as células tumorais teriam uma organização hierárquica, na qual CITs tumorigênicas ?se diferenciam? em células não tumorigênicas. Desta forma, CITs são definidas como células capazes de se autorrenovar, iniciar tumores e sustentar o crescimento tumoral. Elas são também resistentes à quimio- e radioterapia convencionais e acredita-se que elas sejam responsáveis pela disseminação tumoral e pelo crescimento de mestástases. O desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas dirigidas a estas populações raras de células é imprescindível para melhorar a eficácia da terapia anti-tumoral. KRAS está associada à manutenção e expansão do fenótipo tronco-tumoral em células murinas, e o ?knockdown? de AURKA reduz a capacidade de migração de CITs de câncer de cólon in vitro. Portanto, a hipótese desse projeto é que (1) a AURKA é importante para manutenção de um fenótipo tronco-tumoral em CITs transformadas por KRAS e (2) que a inibição da expressão ou atividade desta quinase diminuirá a população de CITs. Para testar esta hipótese nós iremos primeiramente avaliar, em linhagens pulmonares transformadas pela forma oncogênica da KRAS, como a inibição da expressão ou atividade da AURKA afeta a capacidade de formação de tumoresferas em suspensão, um ensaio in vitro que enriquece para CITs e se correlaciona com a capacidade de formar tumores in vivo. Em seguida, determinaremos quais os marcadores de célula tronco conhecidos que estão enriquecidos na população de CITs. Além disso, avaliaremos, tanto nas linhagens parentais quanto em CITs purificadas, como a inibição da expressão ou atividade da AURKA afeta a expressão destes marcadores de células tronco. Finalmente avaliaremos como a inibição da AURKA em CITs purificadas afeta a capacidade migratória e invasiva destas células, bem como a capacidade de formar tumoresferas em passagens seriadas. Esperamos que este projeto vá demonstrar um papel relevante da AURKA para a manutenção e função das CITs pulmonares com mutações em KRAS. Este resultado seria importante para o desenvolvimento da AURKA como um alvo terapêutico relevante para o câncer de pulmão induzido por KRAS, podendo resultar em novas terapias mais eficientes e com menor risco de recidivas, uma vez que as CITs são consideradas responsáveis pela recorrência tumoral.

O câncer de pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo e cerca de 30% de todos os casos de câncer de pulmão são causados por mutações pontuais no oncogene que codifica a GTPase KRAS. Apesar de essas mutações estarem causalmente ligadas ao desenvolvimento do câncer de pulmão, até hoje todas as tentativas feitas para se inibir a atividade biológica dessa proteína falharam clinicamente. Nesse sentido, para que novos e melhores alvos terapêuticos para o câncer de pulmão se tornem disponíveis, será necessário identificar as vias sinalizadoras ativadas pela proteína KRAS, que são críticas para a oncogênese. Nós identificamos previamente que as quinases Aurora A (AURKA) e Aurora B (AURKB) são efetores de KRAS oncogênica, necessários ao crescimento, viabilidade e oncogenicidade in vitro mediada por mutações em KRAS e pudemos assim caracterizar AURKA e AURKB como potenciais alvos terapêuticos no câncer de pulmão induzido por KRAS. Entretanto, para que essas quinases possam ser, de fato, utilizadas como alvos terapêuticos promissores em neoplasias mediadas por KRAS, será necessário avaliar se os efeitos observados in vitro se repetem in vivo. Além disso, será importante entender os mecanismos pelos quais as quinases Aurora contribuem para a perda de viabilidade celular, como seu efeito sobre a proliferação e sobrevida celulares. Finalmente, como a maioria dos tumores pulmonares são metastáticos, é importante avaliar como estas quinases contribuem também para a malignidade celular. Assim, o objetivo deste projeto é caracterizar o papel de AURKA e AURKB na tumorigenicidade mediada por KRAS in vivo. Também será nosso objetivo avaliar se estas quinases contribuem para a proliferação e morte celulares, bem como para propriedades celulares relacionadas à malignidade tumoral como migração e invasão. Espera-se, com este trabalho, entender melhor o mecanismo pelo qual AURKA e AURKB atuam na gênese e manutenção do fenótipo maligno, provendo o conhecimento necessário para o desenvolvimento de novas estratégias farmacológicas que melhorarão o sucesso terapêutico para pacientes com câncer de pulmão. A justificativa que rege o programa de pesquisa aqui proposto é que se espera que ele vá fornecer um melhor entendimento dos mecanismos moleculares acionados pela KRAS no câncer de pulmão, enquanto que, ao mesmo tempo, espera-se que este projeto vá fornecer a fundamentação experimental para o desenvolvimento de novos fármacos alvo-dirigidos para o tratamento do câncer de pulmão induzido por KRAS.

As alterações genéticas mais frequentes em tumores de pulmão são mutações pontuais que ativam o oncogene K-Ras. Apesar destas mutações estarem ligadas diretamente à oncogênese, diferentes abordagens para inibir a proteína Ras diretamente não obtiveram sucesso. Portanto, para que melhores alvos terapêuticos para o câncer de pulmão se tornem disponíveis, será necessário identificar as vias sinalizadoras ativadas por K-Ras que estão diretamente envolvidas com a aquisição de propriedades malignas importantes. Uma das propriedades mais importantes na oncogênese é a aquisição de capacidade angiogênica tumoral. Desta forma, o objetivo deste projeto é identificar alvos terapêuticos que inibam a angiogênese tumoral induzida pelo oncogene K-Ras no pulmão. Com base no conhecimento de que Ras promove angiogênese tumoral através da indução de interleucina 8 (IL-8), a hipótese deste projeto é que (1) a indução de IL-8 por K-Ras (e seus efeitos pró-angiogênicos) é mediada pela quinase IKKbeta e (2) que a inibição da quinase IKKbeta, reduzirá a capacidade angiogênica tumoral in vitro e consequentemente o crescimento tumoral in vivo. Esta hipótese foi formulada com base em estudos anteriores mostrando que o principal substrato da IKKbeta, o fator de transcrição NF-κB, é capaz de promover angiogênese e metástase em alguns modelos tumorais, que K-Ras ativa o NF-κB de forma dependente da IKKbeta, e que a inibição da atividade da IKKbeta com um inibidor farmacológico em células pulmonares transformadas por K-Ras reduz a expressão de IL-8. A justificativa que rege o projeto de pesquisa aqui proposto é que espera-se elucidar o mecanismo molecular envolvido na via controlada por K-Ras que medeia a indução de IL-8, angiogênese e progressão tumoral. Além disso, esperamos validar novas estratégias para o desenvolvimento de terapias antitumorais.

Mutações pontuais que ativam o oncogene K-Ras são muito frequentes em diversas neoplasias humanas, principalmente no carcinoma hepatocelular. Apesar destas mutações estarem ligadas à oncogênese, diferentes abordagens para inibir as proteínas Ras diretamente fracassaram na clínica. Portanto, para que melhores alvos terapêuticos para as neoplasias induzidas pela K-Ras oncogênica se tornem disponíveis, será necessário identificar as moléculas efetoras da proteína K-Ras, que são críticas para a oncogênese. Os RNAs não codificadores (ncRNAs) podem atuar como importantes mediadores do processo de surgimento e evolução do câncer, atuando como oncogenes ou genes supressores de tumor através de modificações transcricionais. Todavia, os ncRNAs envolvidos na transformação maligna pela K-Ras permanecem desconhecidos. O objetivo deste projeto é identificar ncRNAs que desempenham um papel importante no fenótipo maligno induzido pelo oncogene K-Ras. Nossa hipótese pressupõe que a transformação celular pela K-Ras altera o padrão de expressão de ncRNAs, alterando assim, sua função de controle gênico pós-transcricional. Para testar esta hipótese, utilizaremos dos dados já obtidos de hibridização de microarranjos de DNA para comparar o perfil de expressão de ncRNAs em linhagens primárias de pâncreas na presença/ausência da forma oncogênica da K-Ras. A confirmação da expressão diferencial será feita através de qRT-PCR em linhagens tumorais de pâncreas, com ou sem inibição de K-Ras por interferência de RNA (RNAi). A validação funcional dos ncRNAs diferencialmente expressos será feita através da modulação da expressão de dos alvos identificados nas células humanas de câncer de pâncreas dependentes da K-Ras oncogênica seguidas de ensaios funcionais celulares. Espera-se que este projeto contribua para um melhor entendimento dos mecanismos moleculares acionados pela oncoproteína K-Ras, enquanto que, ao mesmo tempo, espera-se que forneça o conhecimento necessário para o desenvolvimento de novas terapias anti-tumorais.

As alterações genéticas mais frequentes em tumores de pulmão são mutações de ponto que ativam o oncogene K-Ras. Apesar destas mutações estarem causalmente ligadas à oncogênese, diferentes abordagens para inibir as proteínas Ras diretamente fracassaram na clínica. Portanto, para que melhores alvos terapêuticos para o câncer de pulmão se tornem disponíveis, será necessário identificar as moléculas efetoras da proteína K-Ras, que são críticas para a oncogênese. Uma classe de moléculas que emergiu recentemente como importantes mediadores do processo de surgimento e evolução do câncer são os microRNAs (miRNAs). Todavia, os miRNAs envolvidos na transformação maligna pela K-Ras permanecem desconhecidos. O objetivo deste projeto é identificar miRNAs que desempenham um papel importante no fenótipo maligno induzido pelo oncogene K-Ras. Nossa hipótese pressupõe que a transformação celular pela K-Ras altera o padrão de expressão de miRNAs, alterando assim, sua função de controle gênico pós-transcricional. Para testar esta hipótese, utilizaremos a abordagem de hibridização de microarranjos de DNA para comparar o perfil de expressão de miRNAs em linhagens primárias pulmonares na presença/ausência da forma oncogênica da K-Ras. A confirmação da expressão diferencial será feita através de qRT-PCR em linhagens tumorais de pulmão, com ou sem inibição de K-Ras por interferência de RNA (RNAi). A validação funcional dos miRNAs diferencialmente expressos será feita através da modulação da expressão de um miRNA identificado nas células humanas de câncer de pulmão dependentes da K-Ras oncogênica seguidas de ensaios funcionais celulares. Espera-se que este projeto contribua para um melhor entendimento dos mecanismos moleculares acionados pela oncoproteína K-Ras, enquanto que, ao mesmo tempo, espera-se que forneça o conhecimento necessário para o desenvolvimento de novas terapias anti-tumorais para o câncer de pulmão.

O câncer de pulmão é o câncer que mais mata no mundo. As alterações genéticas mais frequentes em tumores de pulmão são mutações pontuais que ativam o oncogene K-Ras. Apesar destas mutações estarem causalmente ligadas à oncogênese, diferentes abordagens para inibir as proteínas Ras diretamente fracassaram na clínica. Portanto, para que melhores alvos terapêuticos para o câncer de pulmão se tornem disponíveis, será necessário identificar as vias sinalizadoras ativadas pela proteína K-Ras, que são críticas para a oncogênese. O objetivo deste projeto é identificar novos alvos terapêuticos na oncogênese pulmonar induzida pela K-Ras. A hipótese deste projeto é que (1) a K-Ras oncogênica leva à ativação da quinase mitótica Aurora A e (2) que a quinase Aurora A é um alvo terapêutico relevante no câncer de pulmão induzido pelo oncogene K-Ras. Esta hipótese foi formulada com base em estudos anteriores mostrando que a quinase Aurora A fosforila diretamente componentes das vias efetoras de Ras, que a Aurora A coopera com a Ras oncogênica na transformação maligna e que a inibição farmacológica da Aurora A em células humanas (algumas das quais portadoras de mutações oncogênicas no gene da K-Ras) reduz o comportamento maligno celular. Para testar esta hipótese, nós perseguiremos os seguintes objetivos específicos: (1) determinar como a indução ou inibição da expressão da K-Ras oncogênica em células pulmonares afeta a expressão e atividade da quinase Aurora A; e (2) determinar como a inibição da expressão da quinase Aurora A por interferência de RNA em células pulmonares mutantes para a K-Ras afeta as propriedades oncogênicas celulares. Espera-se que a nossa contribuição seja a identificação de alvos moleculares da K-Ras no pulmão, que não apenas contribuam para o processo oncogênico, mas também que sejam terapeuticamente relevantes. Esta contribuição é importante porque se espera que ela forneça o conhecimento necessário para o desenvolvimento de novas estratégias farmacológicas q

Existe uma lacuna fundamental no nosso entendimento de como a forma oncogênica da GTPase K-Ras desencadeia a transformação neoplástica no pulmão. A falta deste conhecimento impede avanços terapêuticos para os 20-50% de pacientes de câncer de pulmão associado a mutações oncogênicas na K-Ras. Com base em dados recentes que mostram que a ativação do fator de transcrição NF-κB pela K-Ras é um evento importante no processo oncogênico, o objetivo geral deste projeto é identificar e testar novos alvos terapêuticos na via de ativação do NF-κB pela K-Ras. A hipótese central deste projeto é que a ativação do NF-κB pela K-Ras envolve dois alvos terapêuticos importantes: a quinase IKKβ e as quinases Aurora. Para testar esta hipótese, nós vamos usar interferência de RNA para inibir a expressão da IKKβ ou quinases Aurora A e B, após o que, nós iremos avaliar alterações nas propriedades oncogênias celulares, incluindo a habilidade de formar de tumores xenográficos e a habilidade de formar metástases pulmonares in vivo. Além disso, nós usaremos um modelo animal de câncer de pulmão induzido pela K-Ras para avaliar como a inibição farmacológica destas quinases afeta o crescimento dos tumores pulmonares e a sobrevida dos animais. Esta abordagem é inovadora porque ela tem como meta, não só elucidar o papel da IKKβ e quinases Aurora na oncogênese induzida pela K-Ras, mas também testar pré-clinicamente a inibição da atividade destas quinases no tratamento dos tumores pulmonares. Espera-se que a nossa conribuição seja a identificação de alvos da K-Ras, que não apenas contribuam para o processo oncogênico, mas também que sejam terapeuticamente relevantes. Esta contribuição é importante porque espera-se que ela forneça o conhecimento necessário para o desenvolvimento de novas estratégias farmacológicas que contribuirão para um melhor sucesso terapêutico para pacientes com câncer de pulmão.

Human CD34 (hCD34) represents an important marker which is clinically used to enrich for hematopoietic stem cells (HSCs). However, little is known about the mechanisms regulating its expression. Using transgenic mice carrying hCD34 PAC constructs we identified a novel Downstream Regulatory Element (DRE), located 44.5 kb downstream from the promoter, which is required for hCD34 expression in long-term (LT) HSCs. The DRE interacts with the hCD34 promoter through Runx binding sites. Mutagenesis of those sites lead to decreased hCD34 expression in LT-HSCs. Conditional deletion of Runx1 in hCD34 transgenic mice carrying the DRE as the sole 3? regulatory element, led to complete loss of hCD34 expression. These experiments provide novel mechanistic insights into the regulation of hCD34 in vivo in LT-HSCs, therefore increasing our understanding of stem cell gene regulation

This project is based on the hypothesis that the transcription factor NF-kappaB plays a crucial role in K-Ras-induced lung cancer formation and progression. I proposed to test this hypothesis in genetically engineered mouse models using sophisticated new tools to evaluate lung cancer development and treatment in situ (which means in real lung tumors in mice as opposed to cells in culture or xenografts). Questions to be answered by the development of this project include the following: 1) Do lung tumors still form if NFkappaB function is impaired? If they still form, do they grow and progress normally? 2) Does inhibition of NFkappaB activity in formed lung tumors affect their growth pattern alone or in combination with standard chemotherapy? This is an important project for the following reasons: 1) It is one of the first proposed studies to evaluate the role NFkappaB plays in cancer development in situ (it is certainly the first one in lung cancer), 2) it provides a lung cancer model for pre-clinical testing of a newly developed drug (NFkappaB inhibitor), that could have direct implications for lung cancer therapy and 3) it will provide new information about the molecular events involved in the lung cancer causing mechanism that could provide new targets for therapy design.

Aberrant FLT3 signaling accounts for 30% of all cases of acute myeloid leukemia and intensive efforts have been made to understand how FLT3 can transform normal cells into leukemic cells. Aberrant FLT3 signaling was known to play a role in leukemogenesis by stimulating proliferation and survival of leukemic cells through well studied signaling pathways. Nonetheless, nobody understood well how FLT3 could lead to the differentiation block seen in leukemic blasts (a hallmark of leukemia). This project aimed at dissecting the mechanism by which FLT3 can account for the differentiation block of leukemic cells.

This project's goal was to better understand the role C/EBPalpha plays in lung development and maturation, as well as in lung cancer. The results showed, for the first time, that C/EBPalpha is absolutely required for the lung maturation in the perinatal period required for the transition to air breathing. In addition, C/EBPalpha regulates lung cellular differentiation, proliferation and survival in vivo (in normal epithelial lung cells in the mouse lung).C/EBPalpha affects differentiation and proliferation/survival in lung cells, at least in part, by up-regulating HNF3beta, a transcription factor involved in foregut development, that also displays tumor suppressive properties in lung cells. The implication of C/EBPalpha?s role in lung cancer opens up novel possibilities for lung cancer therapy design

There are still many genes involved in the pathophysiology of cancer that are unknown.
Research consortiums such as the NCI cancer genome project and the Brazilian cancer genome project were producing databases of information to be used by researchers for the discovery of important unknown cancer mediators. The discovery of novel cancer mediators has obvious implications in the development of better screening methods and better therapies for cancer. This project consisted of in sillico cloning followed by experimental and functional validation with routine molecular biology techniques.

During my graduate research I worked primarily identifying and characterizing mutations in cytoskeletal proteins of the red cell that led to severe anemia in patients (hereditary elliptocytosis/spherocytosis). This work is important because it improves our understanding of the cytoskeletal protein associations required for proper red cell morphology and function. In addition, identification of the molecular defects associated with each anemia subtype helps in genetic counseling of patients (particularly when the anemia is severe enough to require frequent blood transfusions) and provides a starting point towards the development of gene therapy for these conditions.

During oxidative stress in the presence of calcium, the inner mitochondrial membrane suffers a permeability transition, which results in loss of mitochondrial calcium and mitochondrial swelling. In 1994 the mechanism mediating this permeability transition was poorly understood. Understanding of this mechanism at the molecular level was highly relevant because this phenomenon is directly associated with cell survival. Previous work from Dr. Vercesi?s laboratory showed that permeabilization might involve thiol cross-linking of membrane proteins. In this study we used the thiol compound DIDS and showed that DIDS in the presence of calcium is able to trigger the formation of mitochondrial protein aggregates and trigger the mitochondrial permeability transition in the absence of oxidative stress, confirming the theory that mitochondrial permeabilization is indeed caused by thiol cross-linking of mitochondrial membrane proteins as opposed to other kinds of oxidative damage such as lipid peroxidation or nucleotide oxidation.