Marcio de Castro Silva Filho.

Chamada CNPq N º 12/2016 - Bolsas de Produtividade
em Pesquisa - PQ

Nosso laboratório tem dedicado cerca de duas décadas de pesquisa e formação de recursos humanos no entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na localização subcelular de proteínas, notadamente na planta modelo Arabidopsis thaliana, bem como no entendimento da complexa relação planta-insetos-patógenos. No que concerne ao transporte de proteínas, nosso grupo tem se esforçado em caracterizar os mecanismos relacionados à especificidade de importação de proteínas em suas respectivas organelas, notadamente nos cloroplastos e mitocôndrias. Este trabalho permitiu a identificação de proteínas de duplo direcionamento a mais de uma organela, bem como caracterizar a evolução de proteínas de duplo direcionamento, conservação entre as plantas e os mecanismos moleculares envolvidos no destino das mesmas às suas organelas. Na linha de pesquisa relacionada à interação plantas-insetos-patógenos, nossa abordagem se dá principalmente com a cana-de-açúcar, notadamente na identificação e caracterização de genes responsivos ao ataque da broca (Diatraea saccharalis) bem como da presença de fungos oportunistas associados. Não obstante, temos particular interesse nos mecanismos adaptativos dos insetos, que permitem contornar as defesas das plantas. Neste projeto Temático, temos como objetivo avançar na caracterização das duas Linhas de Pesquisa, a partir de subprojetos originais e que irão contribuir para um melhor entendimento destas duas áreas da biologia de plantas. (AU)

As plantas evoluíram um amplo arranjo de mecanismos de defesa para se proteger da vasta gama de
patógenos e insetos herbívoros com que são confrontadas. Dentro destes mecanismos de defesa estão
as respostas induzidas que são ativadas sistemicamente nas plantas em resposta a infecção ou ataque
por insetos. Em seu habitat, as plantas são submetidas a múltiplos estresses bióticos e abióticos
simultâneos. Cada ataque ativa uma ou várias vias de sinalização para assegurar uma resposta
defensiva efetiva no tempo e no espaço. Portanto, as plantas precisam ser capazes de identificar e
priorizar cada via de sinalização a fim de montar a estratégia de defesa mais eficaz para minimizar
danos correntes e futuros e também para preservar o crescimento vegetativo e sucesso reprodutivo. As
plantas desenvolveram diferentes mecanismos para reduzir o ataque de insetos, incluindo compostos
protéicos de defesa, como os inibidores de proteinases (IPs). Os insetos, ao longo da evolução,
desenvolveram estratégias para superar as barreiras defensivas das plantas, permitindo a sua
alimentação e desenvolvimento, como a super expressão de genes de enzimas digestivas sensíveis e
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insensíveis aos IPs de plantas. Decifrar a interação planta-inseto em nível molecular é um dos assuntos
de maior interesse na pesquisa contemporânea em biologia de plantas sendo os mecanismos
adaptativos dos insetos de grande interesse nesses estudos. Essas informações nos permitem
entender toda a dinâmica da interação entre insetos e plantas e dessa forma abre caminhos e
perspectivas para um melhor controle biológico de pragas. Nosso grupo vem trabalhando nos últimos 10
anos nos estudos envolvendo a caracterização da interação planta-insetos herbívoros. Contribuições
significativas foram feitas na área tanto do ponto de vista de formação de recursos humanos quanto na
geração de trabalhos científicos divulgados nas principais revistas científicas da área. A continuidade
desta Linha de Pesquisa é o foco deste projeto. Na verdade, este projeto é constituído de 2 sub-projetos
voltados ao entendimento dos mecanismos adaptativos dos insetos às defesas das plantas cultivadas

Chamada MCTI/ CNPq/MEC/CAPES N º 15/2011 - Editoração de Periódicos

Produtividade em Pesquisa - PQ - 2011

Várias pesquisas vêm sendo realizadas no intuito de conhecer e entender melhor os mecanismos co-evolutivos da interação planta e inseto. As plantas desenvolveram diferentes mecanismos para reduzir o ataque de insetos, incluindo respostas específicas que ativam diferentes vias metabólicas as quais alteram consideravelmente suas características químicas e físicas. Um dos mecanismos de defesa mais bem estudados é a produção de inibidores de proteinase (IP), que atuam inibindo a atividade proteolítica de enzimas digestivas intestinais dos insetos. Por outro lado, os insetos desenvolveram várias estratégias para superar as barreiras defensivas das plantas, permitindo a sua alimentação, desenvolvimento e reprodução em seus hospedeiros. No que se refere aos IP, uma das estratégias adaptativas mais fascinantes adotadas pelos insetos é a organização das proteinases em grandes famílias multigênicas. Esta adaptação evolutiva baseada na duplicação gênica e geração de novos variantes permitiu aos insetos sintetizarem novas proteinases que são insensíveis à ação dos IP. Recentemente, nosso laboratório realizou um estudo em maior profundidade sobre as bases genéticas da adaptação de S. frugiperda aos efeitos dos IP da soja. Os resultados mostraram que o genoma deste inseto é formado de dezenas de genes que codificam serino proteinases (SP), notadamente tripsinas e quimotripsinas. A expressão destes genes é controlada em função da presença de IP na dieta. Esta observação pode explicar em parte o polifagismo acentuado deste importante inseto-praga. Basicamente, duas hipóteses foram apresentadas visando explicar esta adaptação: um mecanismo do tipo shotgun (aumento geral na expressão dos genes que codificam as proteinases e um mecanismo do tipo feedback (aumento na expressão dos genes seria seguida de uma diminuição na expressão dos genes cujos produtos fossem sensíveis à ação dos IPs. Ainda associado ao mecanismo shotgun, nosso laboratório observou que as lagartas quando expostas aos IPs de soja mantém a expressão aumentada de todo o conjunto de proteinases até a fase de pupa Uma pergunta interessante é se este mecanismo adaptativo pode envolver um controle epigenético, ou seja, insetos expostos à presença dos inibidores manteriam elevada a expressão dos genes que codificam as proteinases nas gerações seguintes, mesmo na ausência dos IPs.

Edital MCT/CNPq 14/2010 - Universal - Faixa C - De R$ 50.000,01 a R$ 150.000,00

Programa Editorial / Edital MCT/CNPq-MEC/CAPES nº 68/2010 -
Editoração e Publicação de Periódicos Científicos Brasileiros

Em nosso laboratório estamos interessados em duas áreas principais de pesquisa: 1) transporte intracellular de proteínas e, 2) estudo da interação planta-insetos herbívoros. Estes temas têm sido desenvolvidos com sucesso ao longo dos anos aos quais o grupo teve reconhecimento nacional e internacional. Nossa contribuição para estas áreas pode ser constatada pela publicação de artigos em revistas internacionais de impacto além da atuação como [...] de importantes revistas científicas e também de agências de fomento nacionais e internacionais. Um projeto temático em andamento será englobado pelo Projeto BIOEN, baseado no estudo das interações cana-de-açúcar/insetos herbívoros. Portanto, todos os objetivos do projeto relacionado ao transporte intracelular de proteínas serão mantidos, embora não façam parte do Projeto BIOEN. A interação planta-inseto herbívoros é um sistema dinâmico, submetido a variações contínuas e alterações. As plantas desenvolveram diferentes mecanismos para reduzir o ataque de insetos, via ativação de respostas específicas que ativam cascatas metabólicas diferentes que alteram consideravelmente sua composição química e aspectos físicos. Por outro lado, os insetos desenvolveram várias estratégias para superar as barreiras produzidas pelas plantas, permitindo a sua alimentação, crescimento e reprodução nas plantas hospedeiras. Este projeto tem por objetivo responder importantes questões relacionadas à complexa interação entre a cana-de-açúcar e insetos herbívoros, utilizando-se de várias abordagens, que incluem: 1) caracterizar a resposta da cana às principais pragas da cultura; 2) entender os mecanismos adaptativos das pragas da cana; 3) analisar em larga escala a expressão de serino proteinases (SP) e inibi dores de proteinases (IP) de cana em resposta à herbivoria causada pela broca da cana (Diatraea saccharalis); 4) determinar a localização subcelular das SPs e IPs; 5) caracterizar as enzimas digestivas presentes na lagarta gigante Telchin licus (Drury) com o objetivo de bloquear sua atividade proteolítica com inibidores de proteinases e 6) usar Physcomitrella patens como um modelo para o entendimento das respostas da plantas a ferimentos e patógenos que infectam a cana após herbivoria. (AU)

Chamada Produtividade em Pesquisa

As células eucarióticas estão organizadas em um complexo sistema de endomembranas responsável pela formação de estruturas subcelulares ou organelas, que são especializadas em diversas funções biológicas. A biogênese das organelas bem como a regulação das reações bioquímicas envolve um intenso tráfego intracelular de proteínas. Dentro de uma organela, as reações bioquímicas também requerem uma localização precisa das mesmas de forma a assegurar o funcionamento adequado de todo o processo. Portanto, a organização do tráfego intracelular e a localização correta das proteínas formam uma das bases do funcionamento da célula eucariótica. O conhecimento da localização das proteínas dentro dos micro ambientes celulares é crítico para o entendimento de suas funções e interações. Portanto, a elucidação dos mecanismos regulatórios envolvidos na localização das proteínas dentro das células tem uma grande importância no entendimento dos princípios básicos da vida.
O sequenciamento de genomas de 840 organismos (dados de Julho de 2008), incluindo Arquea, Bactéria e Eukarya, além dos quase 4000 projetos de sequenciamento em andamento (http://www.genomesonline.org/gold.cgi) geraram um número extraordinário de seqüências em Banco de Dados públicos e privados. Com esta explosão de informações um dos principais desafios da biologia moderna é entender a expressão, regulação e principalmente, a função das proteínas de um organismo. Estas informações auxiliarão no entendimento dos complexos processos biológicos. A identificação dos grupos de proteínas em várias organelas é um dos passos iniciais no entendimento dos processos biológicos a nível celular. Estudos envolvendo a predição da localização subcelular de proteínas (Nair & Rost, 2005) ou análises globais da localização de proteínas em diferentes organismos (Cutler et al., 2000; Huh et al., 2003) têm permitido avanços importantes no entendimento da função das proteínas em larga escala. Entretanto, trata-se de uma primeira etapa em todo o processo, sendo que o conhecimento dos mecanismos regulatórios deve ser executado individualmente para cada proteína. Esta é, portanto, a abordagem proposta neste projeto. São apresentados dois subprojetos relacionados ao transporte intracelular de proteínas. 
Sub-projeto 1: Biossíntese de tiamina em plantas: reconstrução da história evolutiva e caracterização funcional de proteínas desta via biossintética em Arabidopsis thaliana
Sub-projeto 2: Caracterização do mecanismo de direcionamento das FtsHs às membranas dos tilacóides em plantas

Edital MCT/CNPq 14/2008 - Universal - Faixa B - De R$ 20.001,00 a R$ 50.000,00

As sequências de direcionamento têm um papel fundamental na localização subcelular das proteínas nos organismos eucariotos, notadamente no transporte para as mitocôndrias, cloroplastos e retículo endoplasmático. Nestes casos, estas sequências ou "unidades funcionais" asseguram a correta distribuição das proteínas aos respectivos destinos via uma complexa rede de interação com fatores citossólicos e receptores específicos localizados nas membranas das organelas. Nosso grupo tem caracterizado diversas sequências de direcionamento e identificados os determinantes responsáveis pela correta distribuição das proteínas em seus compartimentos subcelulares. Neste novo trabalho procedeu-se um estudo nos quais Códigos Matemáticos utilizados na Teoria de Comunicação foram empregados no estudo do fluxo da informação nas células: DNA, RNA, Proteínas e sua localização subcelular. Como ambas situações (Teoria de Comunicação e Fluxo da Informação Biológica) envolvem transporte de informação, acreditamos ser possível encontrar polinômios capazes de descrever os dois processos. Os resultados obtidos mostram que é possível reproduzir matematicamente dez sequências de direcionamento através de um código corretor de erros. Mostramos que certas sequências de direcionamento podem ser identificadas através de uma estrutura algébrica de anel e de um correspondente polinômio primitivo. Como consequência, o polinômio gerador do código é especificado. Esse polinômio satisfaz a propriedade de dividir o polinômio xn-1 (n-ésima raiz da unidade), identificando assim, a característica de ciclicidade na formação destas sequências, contrariando a possível hipótese de que as sequências de direcionamento sejam geradas aleatoriamente. (AU)

Chamada PDJ

Nossa proposta integra especialistas reconhecidos em vários dos processos associados à temática e a importante participação da Fermentec. Esta equipe multidisciplinar irá realizar uma caracterização molecular detalhada das linhagens desenvolvidas pela empresa a fim de entender o processo adaptativo das leveduras à condições de estresse (alto teor alcoólico e tratamento nos fermentadores). Além disso, serão realizados trabalhos no sentido de melhorar ainda mais o desempenho das atuais cepas para permitir a fermentação em níveis ainda superiores de etanol. Os resultados decorrentes deste trabalho podem abrir novas perspectivas e ganhos significativos no processo, tornando o país ainda mais competitivo no cenário internacional.

Edital MCT/CNPq/CTAgro/CTBio nº 39/2007- Tecnologias de Vanguarda para a Produção de Etanol e Biodiesel

Este laboratório tem como uma das suas principais linhas de pesquisa estudos visando o entendimento dos mecanismos responsáveis pela localização de proteínas dentro das células de plantas, especialmente as proteínas direcionadas às mitocôndrias e cloroplastos. Nesta proposta, pretende-se avançar na caracterização dos mecanismos regulatórios envolvidos na localização intracelular de diferentes proteínas, integrando também uma abordagem evolutiva. Quatro subprojetos são apresentados. O primeiro deles refere-se à identificação de proteínas que interagem com a proteína THI1 de Arabidopsis thaliana, via técnica do duplo-híbrido, e que participem da biossíntese de tiamina. Além disso, pretende-se identificar proteínas responsáveis pelo controle do duplo direcionamento desta proteína, já que foi mostrado por este grupo que esta proteína é direcionada simultaneamente às mitocôndrias e cloroplastos via um mecanismo de regulação pós-transcricional. O segundo subprojeto tem como objetivo realizar um estudo sobre a biossíntese da tiamina em plantas. Estudos preliminares realizados por este grupo envolvendo técnicas de bioinformática e filogenia molecular sugerem que a biossíntese de tiamina em plantas possa envolver outros compartimentos subcelulares, contrariando trabalhos prévios que sugerem a ocorrência apenas nos plastídios. Portanto, nesta proposta serão adicionadas a esta análise de bioinformática, experimentos de complementação funcional em leveduras de genes da biossíntese de tiamina e a posterior determinação da localização subcelular de todas as proteínas envolvidas no processo, via fusão com a proteína fluorescente verde GFP. O terceiro projeto visa entender um dos mais fascinantes mecanismos de regulação gênica descritos recentemente: os riboswitches. A presença de estruturas no mRNA capazes de interagir diretamente com moléculas interferindo na tradução tem despertado o interesse de vários grupos em todo o mundo. No caso de um dos genes envolvidos na biossíntese da tiamina, thic de Arabidopsis thaliana, foi mostrado que ele apresenta uma estrutura em aptâmero capaz de se ligar a tiamina pirofosfato (TPP) e tiamina, regulando sua expressão. Pretende-se verificar experimentalmente se a ocorrência deste aptâmero interfere na expressão do gene thic e na sua localização subcelular. Além disso, será realizado um estudo in silico em todos os genes cujos produtos estejam envolvidos na biossíntese de tiamina a fim de identificar a ocorrência de aptâmeros e, em caso positivo, verificar experimentalmente a sua função. O quarto subprojeto envolve a caracterização do mecanismo responsável pela localização de uma metaloprotease da membrana do tilacóide, a FtsH-p1. Membros desta família foram descritos como pertencentes ao sistema Tat (twin-arginine translocation system) para inserção na membrana do tilacóide. Em um trabalho prévio deste grupo, foi mostrado que um membro desta família não apresenta o clássico motivo RR responsável pela sua inserção na membrana. Portanto, pretende-se caracterizar o mecanismo responsável pela localização de proteína, pois trata-se provavelmente de um mecanismo distinto do que se tem descrito na literatura. (AU)

Chamada PQ 10/2005

A busca por promotores induzidos por insetos herbívoros é um dos pontos principais da biotecnologia vegetal moderna uma vez que permite a expressão de proteínas heterólogas com atividade inseticida apenas em situações onde ocorre o ataque das pragas. Praticamente todos os promotores utilizados na expressão heteróloga de genes na cultura da cana de açúcar são patenteados, principalmente pelo USDA (Departamento de Agricultura dos Estados Unidos). Recentemente, foram analisados diferentes genes da cana-de-açúcar que são ativados por insetos herbívoros. A partir das sequências destes genes, foi isolado e caracterizado o promotor do gene da heveína em cana de açúcar que é regulado positivamente pela presença de insetos herbívoros, notadamente a broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis), principal praga da cultura. Plantas de cana transformadas com o gene repórter gusA sob o controle deste promotor não expressaram o gene na ausência da praga. (AU)

Estudar a via de sinalização em Spodoptera frugiperda relacionada à adaptação de insetos aos inibidores de proteinases de soja. 2- Analisar a expressão de genes em larga-escala (macro-arrays) em cana-de-açúcar em resposta à principal praga da cultura, a broca da cana Diatraea saccharalis. (AU)