Rodrigo da Silva Galhardo.

O CEPID B3 é uma rede com pólos de pesquisa sediados em São Paulo (IQ-USP, ICB-USP), Campinas (IB-UNICAMP, IAC), Ribeirão Preto (FCFRP-USP, FMRP-USP) e Rio Claro (UNESP) que colaborará na realização de pesquisas básicas de ponta sobre os mecanismos moleculares de importância primordial para a reprodução bacteriana, o comportamento multicelular, a competição, a colonização e as interações de bactérias com seus hospedeiros eucarióticos e bacteriófagos. Os conhecimentos adquiridos serão utilizados na busca e desenvolvimento de novos inibidores químicos e biológicos do crescimento bacteriano.

Proteus mirabilis é um patógeno bacteriano envolvido principalmente em infecções no trato urinário. Essa espécie bacteriana é frequentemente portadora de elementos conjugativos integrativos (ICEs) da família SXT/R391. Estes são responsáveis pela dispersão de genes de resistência a antimicrobianos. Estes elementos são grandes e carregam, além de genes de resistência e daqueles responsáveis pelo seu processo de excisão e conjugação, genes cuja função ainda não é conhecida. Recentemente, identificamos em um isolado clínico brasileiro um elemento desta família denominado ICEPmiJpn1, originalmente identificado no Japão, e posteriormente encontrado em isolados clínicos e ambientais em diversas localidades ao redor do globo. Demonstramos recentemente que o ICEPmiJpn1 confere a capacidade de mutagênese induzida por danos no DNA a isolados clínicos de P. mirabilis, através dos genes rumAB ali presentes. Além disso, verificamos que estes genes influenciam na transmissão deste elemento móvel. Neste projeto, continuaremos a caracterização do papel de rumAB na biologia destes elementos e na resposta de P. mirabilis a agentes antimicrobianos. Dada a regulação das funções conjugativas destes elementos após danos no DNA, avaliaremos o impacto dos ICEs sobre a resposta a danos do hospedeiro através de transcriptômica. A função do sistema toxina-antitoxina hipAB contido no ICE também será avaliada, com relação ao seu possível envolvimento na formação de células persistentes.

A população mundial está ficando cada vez mais velha. Infelizmente, esse aumento da expectativa de vida é geralmente associado às chamadas doenças vasculares relacionadas à idade, como demência, infarto cardíaco e acidente vascular cerebral, que comprometem profundamente a qualidade de vida dos idosos. Os distúrbios relacionados à idade são geralmente vistos como um mal necessário. Nosso projeto desafia esse dogma, pois propomos que os distúrbios relacionados à idade acima mencionados, apesar de seus diversos perfis de sintomas, compartilhem o envelhecimento vascular como denominador comum. Além disso, o envelhecimento vascular é causado por acumulação pelo acúmulo de danos no DNA não reparados e disfunção mitocondrial na parede do vaso, que aumentam com a idade. Esses eventos interagem e induzem progressiva senescência, inflamação e perda de função da parede do vaso, que eventualmente se manifestam como disfunção cardiovascular ou neurodegeneração, duas características muito importantes do envelhecimento. Várias das doenças humanas predominantes, como obesidade, diabetes e doenças cardiovasculares, estão diretamente relacionadas a essa cadeia de eventos celulares e fisiológicos que fazem parte e aceleram o processo de envelhecimento. Este projeto reúne especialistas em reparo de danos ao DNA, disfunção mitocondrial, inflamação e doenças cardiovasculares para implantar e compartilhar conhecimento e know-how para desvendar esse eixo comum de doenças. Para isso, eles combinarão tecnologias de ponta (por exemplo, scRNASEq, MitoNGS. CRISPR-Cas, organóides, plataforma de funcionalidade MacroScreen, imagem (intravital ou multiespectral) com modelos celulares e animais exclusivos, deficientes em processos que levam ao fenótipos de envelhecimento acelerado. As ideias obtidas neste projeto serão aproveitadas para o desenho de novos biomarcadores (metabólicos) do envelhecimento vascular e para novas medidas terapêuticas para reverter esse eixo deletério. Visando um mecanismo comum único no envelhecimento vascular, esperamos que este projeto ajude a reduzir essas doenças relacionadas à idade, melhorando a qualidade de vida dos idosos e trazendo ao alcance a visão do envelhecimento saudável. Entre as hipóteses levantadas para explicar os processos de envelhecimento, o acúmulo de danos não reparados ao DNA durante a vida é uma das principais explicações. Em uma segunda parte do projeto, investigaremos vários aspectos dos mecanismos de reparo do DNA e como o dano não reparado podem causar morte ou instabilidade genômica (incluindo mutagênese). Na maioria dos nossos estudos, usaremos células humanas com deficiências nos processos de reparo do DNA, derivadas principalmente de pacientes com xeroderma pigmentoso (XP) e síndrome de Cockayne (CS). As células desses pacientes serão empregadas para investigar a mutagênese por agentes danosos ao DNA, incluindo UVA e UVB. Também serão identificadas mutações em pacientes brasileiros com XP, com o objetivo de conhecer a distribuição dessas mutações no país. Além disso, a ação genotóxica de certas drogas quimioterapêuticas nos leva a investigar mecanismos de resistência das células tumorais aos tratamentos. Um trabalho pioneiro para investigar como os parasitas intracelulares afetam o metabolismo do genoma das células hospedeiras, incluindo o reparo do DNA, terá foco o parasita Trypanosoma cruzi e o vírus sincicial respiratório humano. Finalmente, os processos de reparo do DNA são extremamente conservados, existindo em praticamente todas as formas de vida. Os processos biológicos de defesa contra danos ao DNA em procariontes também serão estudados em bactérias modelo. As respostas a danos no DNA também serão estudadas em amostras do continente Antártico, para entender respostas em ambientes extremos. Esperamos que esses estudos mais gerais nos ajudem a contribuir para a compreensão do processo de envelhe

Proteus mirabilis é uma bactéria causadora de infecções urinárias associadas a catéteres (CAUTIs) que tem sua importância clínica associada a cateterizações prolongadas. Pela sua natureza sensível à beta-lactâmicos, o surgimento de resistência a esta classe de antibióticos levou à identificação dos elementos conjugativos integrativos (ICEs) da família SXT/R391, que carregavam tais genes de resistência. 
Os ICEs possuem genes que regulam o próprio mecanismo de transferência, e também diversos outros genes conservados de funções desconhecidas ou aparentemente não essenciais ao processo de transferência. Dentre esses genes conservados se encontra o operon rumAB que é homólogo de umuDC de E. coli que codifica uma DNA polimerase da família Y, caracterizada pela elevada taxa de erro. A regulação da expressão de rumAB está sob controle da resposta SOS, o mesmo acontecendo com as funções conjugativas do ICE. Essa resposta é induzida quando há danos no DNA, causados, por exemplo, pela exposição à antibióticos. Por induzir as polimerases translesão, a resposta SOS leva ao aumento transiente da taxa de mutação. As mutações no cromossomo, por sua vez, podem levar ao surgimento de resistência a certos antimicrobianos como fosfomicina e ciprofloxacina.
No genoma de P. mirabilis, não há homólogos destas polimerases translesão, a não ser naquelas linhagens que albergam o ICE SXT/R391, que tem consigo o rumAB. Sendo assim, neste projeto, além de identificar possíveis genes de resistência carregados por estes elementos em isolados clínicos brasileiros, realizaremos análises funcionais da polimerase translesão rumAB, nos processos de mutagênese e na manutenção e conjugação dos ICEs.

A resposta SOS é o paradigma de resposta celular aos danos no DNA em procariotos. Muitas funções celulares são reguladas por esta resposta, incluindo mecanismos de reparo de DNA, vias mutagênicas de síntese translesão, e vias que controlam a divisão celular. Mais recentemente, grande atenção vem sendo dispensada ao estudo do envolvimento do SOS na resposta bacteriana a agentes antimicrobianos, especialmente no papel desta resposta na gênese de mutações de resistência. Neste contexto, buscaremos compreender como a resposta SOS modula a fisiologia celular em resposta a uma das classes de agentes antimicrobianos mais importantes da atualidade, as quinolonas, como a ciprofloxacina. Estes antibióticos são reconhecidos indutores de danos no DNA, por inibirem a atividade de DNA girase e topoisomerase. Iremos investigar através de varreduras genéticas genes que afetam a indução da resposta SOS por ciprofloxacina em Pseudomonas aeruginosa. Também iremos caracterizar o transcriptoma de P. aeruginosa em resposta à ciprofloxacina, e o efeito da combinação desta droga com amicacina, recentemente descrita por nosso grupo como inibidora da indução da reposta SOS por ciprofloxacina. Por último, iremos investigar DNA polimerases reguladas pela resposta SOS presentes em transposons conjugativos comumente encontrados no patógeno Proteus mirabilis, estudando seu papel na mutagênese induzida pela exposição a agentes genotóxicos e antibióticos e na transmissão deste elemento por conjugação.

Pseudomonas aeruginosa is an important opportunistic pathogen. Antimicrobial resistance in P. aeruginosa is a world-wide health concern. In this project, we will approach the problem of antimicrobial resistance in this bacterium in two different ways. First, we want to understand the nature of the induced mutagenesis mechanisms that operate in cells challenged with antimicrobials, by dissecting the roles of error-prone DNA polymerases in this process and by analyzing the mechanism of SOS induction by beta-lactam antibiotics. Second, we will try to understand the molecular mechanism of the differential regulation of the pyocin genes by different drug classes, a problematic issue due to antagonistic interactions between drugs, which could reduce treatment efficacy. Moreover, we will search for better combined treatments, looking for synergistic interactions between different anti-Pseudomonas drugs. Altogether, the results of this project might help us to find better treatments, as well as identify targets for drug design that might increase treatment efficacy or reduce the risk of resistance development.

Estudar os mecanismos através dos quais as bactérias modulam seu metabolismo de DNA, ora favorecendo a defesa da integridade genética, ora gerando variabilidade que serve de matéria prima para a seleção natural e evolução, é de suma importância para vários aspectos da Microbiologia, tais como a resistência à antibióticos, a variação antigência e a manipulação de microorganismos para processos biotecnólogicos. O objetivo deste projeto é investigar a fundo alguns aspectos da mutagênese bacteriana no modelo de Caulobacter crescentus, utilizando abordagens de bioquímica, genética molecular e genômica. Pretende-se estudar a regulação da expressão das DNA polimerases de baixa fidelidade em resposta a diferentes estresses ambientais, tais como danos no DNA, exposição à antibióticos e entrada na fase estacionária. A modulação da atividade da DNA polimerase DinB através de interações com outras proteínas, também será investigada. Ensaios in vivo serão desenvolvidos para analisar o envolvimento de tais enzimas na mutagênese espontânea e induzida por estresses. Utilizando o sequenciamento genômico de regiões selecionadas, será também investigado o efeito localizado da mutagênese em regiões compartimentalizadas do cromossomo bacteriano. Os resultados obtidos irão ajudar a compreender melhor a regulação da mutagênese e seu efeito no genoma bacteriano.