Carolina Demarchi Munhoz.

Este curso tem como objetivo criar plataformas digitais educativas sobre as Doenças Crônicas Não Transmissíveis (DCNT), principalmente as doenças do dia-a-dia, contrapondo aos mitos divulgados pelas mídias e veículos de comunicação

Com a comprovação dos efeitos protetores e antioxidantes do estrógeno (E2), o hormônio sexual feminino, em diversas patologias, incluindo o sistema nervoso central (SNC), tornou-se mandatório o maior entendimento de suas ações no organismo, incluindo em machos. Estudos clínicos e experimentais evidenciam tais ações do E2 no acidente vascular encefálico (AVE), a segunda maior causa de morte e incapacitação de adultos no mundo, gerando altos gastos para os sistemas de saúde e prejuízos no setor econômico, e atualmente um dos principais eventos associados à COVID-19. O E2 age em receptores nucleares clássicos (ERα ou ERβ) ou no receptor de estrógeno acoplado a proteína G (GPER), cuja ativação estimula vias de sinalização rápida relacionadas à sobrevivência celular e angiogênese. Pesquisas recentes, inclusive do nosso grupo, mostram que as células da glia (astrócitos e microglia) são importantes efetoras no contexto de hipóxia e isquemia cerebral e que o tratamento com G1, agonista GPER, atenua a morte celular induzida pela privação de glicose e oxigênio (PGO) in vitro e melhora os déficits motores induzidos pela oclusão da artéria cerebral média (MCAO) em ratos machos. Mostramos, também, que a ausência da sinalização GPER, previamente à PGO, aumenta a morte celular nestas condições, sugerindo que o bloqueio desta sinalização estaria relacionado ao pior prognóstico de lesões isquêmicas. Assim, este projeto visa elucidar se a manipulação do GPER astrocitário pode diminuir os déficits motores e cognitivos, a morte neuronal e aumentar a neurogênese e angiogênese em animais submetidos à MCAO. Utilizaremos ratos Wistar machos submetidos à MCAO e tratados com G1 sub-cronicamente após o insulto. Os animais terão os déficits neurológicos e cognitivos avaliados, assim como a ativação astrocitária, morte neuronal, neurogênese e angiogênese no encéfalo. Ainda, utilizaremos vetores virais para a superexpressão do GPER nos astrócitos durante o período de isquemia e reperfusão, além da manipulação farmacogenética deste tipo celular. Utilizando tais abordagens, visamos elucidar os possíveis mecanismos neuroprotetores conferidos pela ativação do GPER e sua repercussão nos danos celulares e comportamentais induzidos pela MCAO. Buscamos, assim, identificar novas vias de sinalização que podem estar envolvidas na angiogênese e quais estratégias podem ser utilizadas para um melhor prognóstico pós-AVE. Devido à relevância clínica e terapêutica do assunto, o potencial translacional desta proposta é evidente e esperamos que os resultados obtidos aqui possam nortear pesquisas envolvendo humanos. Portanto, a realização deste projeto permitirá não somente o avanço científico na área, mas também de potencializar a perspectiva de inovação tecnológica com a possibilidade, inclusive, da criação de novas moléculas com finalidade neuroprotetora. Em termos quantitativos, a execução deste projeto possibilitará formação de recursos humanos competitivos nacional e internacionalmente, a publicação de artigos científicos em revistas indexadas e de seletiva política editorial e finalmente, o fortalecimento e a ampliação da rede de colaborações entre a USP e outras instituições e universidades nacionais e internacionais e o estabelecimento de outros convênios bilaterais.

The amygdala is a vital brain area which mediates emotional behavior expression, including fear and anxiety. Electric stimulation of rat basolateral amygdaloid complex (BLA) leads to anxiety-like behavior and high anxiety-related behavior rats have higher BLA activity, confirmed by immediate early genes expression and electrophysiological records. Some studies have shown that acute psychological stress promotes not only long-lasting anxiety behavior in rodents but also dendritic branch remodeling in BLA. Our previous work showed that rats housed in enriched cages are resilient to acute restraint stress-induced anxiety and have less expression of the immediate early gene Egr-1, an indirect marker of neuronal activity, in the BLA. In addition to the protective role of environmental enrichment (EE) against the immediate effect of acute stress on anxiety, we have also seen that EE blunts the long-lasting anxiety and the long-term contextual fear extinction impairment triggered by the same stressor. The mPFC, through its widely-distributed outputs to multiple levels of fear and anxiety circuitry, is a crucial region to gate fear discrimination and threat assessment during both fear expression and suppression. In rodents, the prelimbic cortex (PL) activity facilitates the feeling of conditioned fear and avoidance, whereas the infralimbic cortex (IL) activity facilitates the extinction and suppression of avoidance behavior. The ventral hippocampus (vHPC) has also been implicated in this scenario. Studies in rodents have shown that anxiety-related behavior involves the vHPV, mPFC, and BLA and the high degree of interconnectivity in the BLA-vHPC-mPFC (PL/IL) suggests they function as a distributed network that supports anxiety/threat behavior in an interdependent manner. Considering the importance of each element of the BLA-vHPC-mPFC (PL/IL) intricate circuit for anxiety-related behavior, as well as the role of acute stress as a trigger for the long-lasting anxiety-related behavior, the primary aim of this project is to track the activity modulation of this circuit by the acute restraint stress in a transsynaptic approach. For that, we propose to inject the rabies construct SADΔG-GFP(EnvA) into each of these nuclei of VGlut2-ires-Cre x RφGT mice. Ten days after acute restraint stress, animals will perform the elevated-plus maze test (EPM) and the neuronal activation will be checked by c-Fos expression. Hypo- or hyperactivation of each part of this tripartite circuit will be modulated through injection of the Cre-inducible viral construct AAV-EF1a-DIO-hChR2(H134)-Eyfp or AAV-EF1a-DIO-eArch3.0-Eyfp

Transtornos emocionais relacionados a sintomas de ansiedade são comuns dentre os relatados na clínica psiquiátrica e ganham importância em trabalhos científicos devotados ao estresse. Além dos sintomas persistentes de ansiedade, o prejuízo no processo de extinção do medo aprendido está em estrita associação com os sintomas apresentados por pacientes com o transtorno de estresse pós-traumático, uma das mais debilitantes patologias associadas ao estresse. A amígdala, mais precisamente o complexo basolateral (BLA), é uma estrutura encefálica essencial para manifestações comportamentais de caráter emocional, incluindo medo e ansiedade. Estudos apontam para a necessidade de compreender a relação entre estresse, hiperexcitabilidade dos neurônios do BLA e ansiedade, e como a sinalização intracelular mediada por receptores glicocorticoides (GR) influencia esses fenômenos e modula a extinção de memória de medo ao contexto. Considerando o papel dos glicocorticoides na resposta de estresse e seus efeitos rápidos e duradouros no sistema nervoso central, o estudo destes mecanismos mostra-se particularmente relevante para o entendimento de patologias relacionadas ao medo e à ansiedade. Com base no exposto, o objetivo desse projeto é, por meio de vetores virais, modular a atividade dos GR (HSV-GR e dnGR-HSV) e a excitabilidade neuronal no BLA (SK2-HSV) e verificar se tanto a ansiedade quanto o déficit de extinção da memória de medo persistentes desencadeados por estresse agudo são dependentes do aumento da excitabilidade neuronal no BLA e/ou da atividade nuclear de GR. Acreditamos que este projeto traz grandes avanços no entendimento de mecanismos de ação relevantes envolvidos nos transtornos associados ao estresse, podendo oferecer evidências estruturais e moleculares importantes na prevenção e no tratamento de tais males, como por exemplo, o transtorno de estresse pós-traumático.

A esclerose múltipla (EM) é uma doença crônica desmielinizante do Sistema Nervoso Central (SNC) mediada pelo sistema imune, caracterizada por inflamação e neurodegeneração. Como tratamento, são utilizadas altas doses de imunossupressores potentes como os glicocorticoides (GCs), tais como a metilprednisolona e dexametasona. A neuroinflamação é um achado importante na patogênese da EM contribuindo para a progressão da doença. Por sua vez, as células da glia (microglia e astrócitos) também possuem papel importante na progressão da doença. Apesar das mulheres serem mais afetadas que os homens, estas apresentam melhora do quadro clínico e das lesões desmielinizantes quando o estrógeno é administrado exogenamente em doses suprafisiológicas. Porém, a aplicação terapêutica deste hormônio é limitada devido às ações estrogênicas indesejáveis, tais como as de proliferação celular, pensadas ser mediadas principalmente pelos receptores nucleares ERa. Além disso, poucos estudos abordam os efeitos do estrógeno nas células gliais e nas células imunes ou investigam com quais vias o mesmo é capaz de interagir. Desta forma, o presente trabalho propõe investigar, primeiramente in vitro, o papel do G1, agonista de receptores não nulceares de estrógeno (GPER-1), na resposta inflamatória induzida por IFN-g e IL-17 em culturas primárias mistas (neurônios, oligodendrócitos e células da glia) provenientes do encéfalo de camundongos fêmeas neonatos C57BL/6 co-cultivadas com linfócitos T (linhagem D1110) e compará-lo aos efeitos gerados pela exposição à dexametasona, análogo sintético de GCs e fármaco de escolha para o tratamento da EM. Posteriormente, verificaremos a funcionalidade desses achados in vitro na progressão da Encefalomielite Aguda Experimental (EAE), modelo experimental da EM, in vivo. Sendo assim, este projeto visa trazer novas contribuições para a compreensão dos mecanismos moleculares envolvendo o estrógeno e os GCs na neuro-inflamação, além de introduzir futuras estratégias terapêuticas e maximizar os benefícios das já existentes envolvendo esses hormônios.

A esclerose múltipla (EM) é uma doença crônica desmielinizante do sistema nervoso central (SNC) mediada pelo sistema imune, caracterizada por inflamação e neurodegeneração, sendo sua incidência maior em mulheres do que em homens, entre 20 e 40 anos. A neuroinflamação é um achado importante na patogênese da EM contribuindo para a progressão da doença. As células da glia (microglia e astrócitos) são as principais mediadoras e efetoras da resposta inflamatória. Apesar das mulheres serem mais afetadas do que homens, o estrógeno (E2) quando administrado nas pacientes de forma exógena em doses fisiológicas e suprafisiológicas ocorre uma melhora no quadro clínico e nas lesões desmielinizantes. No entanto, poucos estudos abordam a função do E2 na sinalização mediada pelos astrócitos e microglia, na neuroinflamação e na resposta auto-imune. Assim, o presente trabalho propõe investigar a função do E2 e de seus receptores clássicos (ER) e não clássicos (GPER) na sinalização inflamatória desencadeada por LPS, IFN- e IL-17 em culturas primárias de microglia e astrócitos de camundongos neonatos fêmeas C57BL6 e posteriormente verificar a funcionalidade desses achados in vitro na progressão da Encefalomielite Aguda Experimental (EAE) em camundongos fêmeas C57BL6. Deste modo, este projeto traz novas contribuições para a compreensão dos mecanismos moleculares envolvendo o E2 na neuroinflamação, além de providenciar futuras estratégias terapêuticas envolvendo esse hormônio.

O enriquecimento ambiental (EE) é um modelo experimental capaz de aumentar os estímulos sensórios, motores e sociais de animais em relação aos animais criados em condições padrão. Dentre os benefícios conferidos pelo EE estão a melhora no aprendizado, na formação de memórias hipocampo-dependentes, no desempenho de tarefas motoras e a redução de manifestações comportamentais relacionadas à ansiedade. Neste último caso, o EE tem sido apontado como fator protetor contra distúrbios emocionais induzidos por estresse. Embora evidências sugiram que a neurogênese, reconfiguração sináptica e alterações na árvore dendrítica (principalmente no hipocampo e na amígdala) estejam envolvidas no estabelecimento de desordens afetivas relacionadas ao estresse, a relação entre o estresse, a ansiedade e o os mecanismos através dos quais o EE exerce seu papel protetor se mostra pouco conclusiva. Em relação ao estresse e seus efeitos sobre a ansiedade, diversos trabalhos apontam para a importância da sinalização via glicoreceptores (GR e MR) como fator chave para o entendimento desse processo. Dentre os elementos de sua via de sinalização encontram-se o NF-κB, a proteína de ligação ao elemento de resposta ao cAMP (CREB), o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e a e a proteína quinase AKT. Em estudo prévio (não publicado) realizado em nosso laboratório, mostramos que o hipocampo e o complexo basolateral da amígdala sofreram modificação no padrão de expressão dos GR e MR em animais estressados agudamente, e que essa alteração diferiu entre animais criados em ambiente enriquecido e animais criados em ambiente padrão, sugerindo uma modulação em âmbito molecular da sinalização por glicocorticóide. Assim, neste projeto, propomos analisar os mecanismos através dos quais o EE promove seu efeito protetor à ansiedade induzida por estresse. Enfocaremos nossa análise na modulação da expressão dos receptores MR e GR nas células do BLA e do hipocampo, bem como na ativação das vias AKT-CRE

Este projeto extende os estudos inicializados no Brasil e tem como objetivo avaliar algumas vias de sinalização intracelular, principalmente aquelas envolvidas na resposta inflamatória, como por exemplo a via de ativação do fator de transcrição NF-kappaB e manipulá-las geneticamente (com a utilização de vetores virais e superexpressão de proteínas ou pela deleção das mesmas utilizando a tecnica de RNAi) para tentar reverter os efeitos deletérios dos glicocorticóides no sistema nervoso central.

A ouabaína é descrita como sendo um novo hormônio presente no sistema nervoso periférico e central. A enzima Na,K-ATPase possui função importante na manutenção do equilíbrio iônico e volume celular. Uma disfunção na sua atividade, ou por redução do suprimento energético ou pela presença de altas concentrações de inibidores endógenos parece que ocorre no sistema nervoso central na vigência de certas condições patológicas. Estudos sugerem que a enzima Na,K-ATPase além das suas propriedades relacionadas ao transporte de íons, também desempenha uma função importante na modulação da expressão gênica e do crescimento celular. Esta ação é mediada pela ouabaína endógena e encontra-se relacionada com a ativação da Src quinase e MAP quinase, com conseqüente aumento na produção de radicais livres e do Ca2+, o qual ativa o fator de transcrição NF- B. Este fator está envolvido na resposta de defesa celular, é modulado por vários estímulos, e responsável pela regulação da expressão de inúmeros genes, dentre eles, genes pró-inflamatórios. O neurotransmissor excitatório glutamato, presente em todo SNC e implicado em processos neurodegenerativos, ativa o fator NF- B em neurônios via receptores glutamatérgicos ionotrópicos. A participação do NO na ativação do NF- B foi explorada em diversos tipos celulares, sendo reportado como ativador em alguns estudos e, em outros como supressor. Além disso, espécies reativas de oxigênio (ROS) ativam este mesmo fator através do aumento dos níveis intracelulares de Ca2+. Este projeto tem como objetivo estudar as alterações induzidas pela ouabaína na expressão de certos genes através da modulação do NF- B em cultura de células primárias (glia e neurônio) de hipocampo de rato. Neste projeto pretendemos ainda determinar a interação entre a via do glutamato-NMDA-NO com a da Src-Ras-MAP quinase na sinalização pela ouabaína, uma vez que estas vias parecem atuar no SNC de forma deletéria, potencializando e até mesmo desencadeando excitotoxicidade.

Os efeitos deletérios do estresse no sistema nervoso central (SNC) envolvem a participação do neurotransmissor glutamato, a ativação dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) e níveis aumentados de espécies reativas de oxigênio e radicais livres, como o óxido nítrico (NO) e citocinas pró-inflamatórias como o fator de necrose tumoral (TNF- ). Os glicocorticóides (GCs), hormônios liberados em situações de estresse, apesar de serem largamente usados como compostos anti-inflamatórios, podem aumentar a inflamação no SNC em algumas circunstâncias. O NF-kB, que é inibido por GCs, é um fator de transcrição envolvido na resposta de defesa celular e é responsável pela regulação da expressão de inúmeros genes, principalmente aqueles associados à resposta inflamatória. Esse fator é ativado por vários estímulos, entre eles o LPS, e a via Glutamato-NMDA-NO participa da sua ativação. Neste estudo, procuramos caracterizar a participação dessa via nos efeitos induzidos por estresse crônico (previsível e/ou imprevisível) na atividade da enzima Na+,K+-ATPase e na ativação do fator de transcrição NF- B induzida por LPS no SNC de ratos. Também investigamos a participação desses hormônios nos efeitos induzidos pelo LPS na expressão gênica relacionada à ativação do NF- B em córtex frontal e hipocampo de ratos.

Existe um grande interesse no estudo dos efeitos da exposição ao estresse, uma vez que diferentes tipos de estresse, psicológico ou fisiológico, têm sido identificados como causa de doenças psiquiátricas como depressão, ansiedade e esquizofrenia bem como predisposição para o abuso de drogas. Estas alterações parecem estar associadas aos fenômenos adaptativos desencadeados pelo estresse junto ao sistema nervoso central. Estudos da literatura sugerem que uma parte destas ações envolvem alterações associadas com o receptor do glutamato sub-tipo NMDA e com modificações da expressão e/ou atividade da enzima Na+,K+-ATPase no sistema nervoso central. Estudos realizados pelo Dr. Scavone em colaboração com o laboratório do Dr. James Andrew Nathanson demonstraram que a bomba de sódio é regulada pela via glutamato-NO/CO- GMPc-PKG no sistema nervoso central. Além disso, dados recentes demonstraram que o tratamento crônico com a Fencanfamina, assim como, animais de 24 meses de idade apresentam alterações adaptativas junto ao sistema glutamato-GMPc-PKG e Na,K-ATPase no sistema nervoso central e periférico (dois trabalhos submetidos a publicação). Portanto, parece lógico sugerir que o estresse induz alterações nos efeitos modulatórios do glutamato na via NO - GMPc - PKG - Na+,K+-ATPase. A caracterização destas alterações podem contribuir para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a gênese de várias doenças psiquiátricas e neurológicas degenerativas. O presente projeto tem como objetivo estudar as alterações induzidas pelo estresse (agudo ou prolongado) nos efeitos modulatórios do glutamato na via NO - GMPc- Na+,K+-ATPase do sistema nervoso central. Para tanto serão avaliados os seguintes parâmetros: a atividade das enzimas Na+,K+-ATPase, NOS constitutiva e induzida, bem como os níveis de GMP cíclico em cerebelo e estriado de ratos.