Adalberto Luiz Rosa.

A proteína engrailed 1 (EN1) pertence à classe de fatores de transcrição com domínio de ligação ao DNA (homeobox) e alterações em sua expressão levam a anormalidades em termos de desenvolvimento e ossificação do esterno, falanges e ossos do crânio. Considerando que En1 tem participação relevante na osteogênese, estabelecemos a hipótese de que essa proteína atua em mecanismos moleculares e celulares que impactam o crescimento esquelético, a regeneração óssea e a osseointegração de implantes de titânio (Ti). Trata-se de proposta original, uma vez que En1 ainda não foi explorada na regeneração óssea e no estabelecimento da interface osso-implante, especialmente com perda e ganho de função de En1 sintetizada por osteoblastos e osteócitos. Nesse contexto, o objetivo geral desse é estudo é investigar a participação de En1 na diferenciação de células ósseas, crescimento esquelético, regeneração óssea e osseointegração de implantes de Ti. O projeto é composto por quatro subprojetos que, no total, têm onze objetivos específicos, apresentados a seguir. Subprojeto 1: Caracterização da expressão e efeitos de En1 em células-tronco mesenquimais (MSCs) e na diferenciação de osteoblastos e osteócitos 1. Caracterizar a expressão de En1 em MSCs e na diferenciação de osteoblastos e osteócitos. 2. Investigar os efeitos do silenciamento e da superexpressão de En1 em MSCs e na diferenciação de osteoblastos e osteócitos. 3. Investigar os mecanismos celulares, com foco em fator de crescimento de fibroblastos, Wnt, fator de crescimento transformante beta e regulação epigenética, envolvidos nos efeitos de En1 em MSCs e na diferenciação de osteoblastos e osteócitos. Subprojeto 2: Avaliação da participação de En1 expressa por osteoblastos e osteócitos no crescimento esquelético de camundongos 4. Gerar duas linhagens de camundongos com deleção de En1 em osteoblastos e osteócitos. 5. Avaliar os efeitos da deleção de En1 em osteoblastos e osteócitos sobre o crescimento esquelético de camundongos. Subprojeto 3: Avaliação da participação de En1 expressa por osteoblastos e osteócitos na regeneração óssea 6. Avaliar a regeneração óssea em defeitos não-críticos de calvárias de camundongos com deleção de En1 em osteoblastos e osteócitos. 7. Investigar os efeitos de MSCs injetadas em defeitos críticos de calvárias de camundongos com deleção de En1 em osteoblastos e osteócitos. 8. Investigar os efeitos de MSCs com silenciamento e superexpressão de En1 injetadas em defeitos críticos de calvárias de camundongos. Subprojeto 4: Avaliação da participação de En1 expresso por osteoblastos e osteócitos na osseointegração de implantes de Ti 9. Caracterizar a expressão de En1 na diferenciação de osteoblastos e osteócitos crescidos sobre Ti com nanotopografia. 10. Investigar os efeitos do silenciamento e da superexpressão de En1 na diferenciação de osteoblastos e osteócitos crescidos sobre Ti com nanotopografia. 11. Avaliar a osseointegração de implantes de Ti com nanotopografia em camundongos com deleção de En1 em osteoblastos e osteócitos. Os quatro subprojetos abordarão desde a caracterização da expressão de En1 por células ósseas até sua participação em processos de osteogênese, utilizando ferramentas avançadas de biologia molecular e celular e geração de modelos animais geneticamente modificados. Nesse cenário, vislumbramos contribuir para o entendimento dos mecanismos moleculares e celulares envolvidos nos efeitos de En1 sobre o tecido ósseo e o estabelecimento de novos tratamentos para promover a regeneração óssea e a osseointegração em sítios desafiadores, com aplicações nas áreas de Cirurgia Buco-Maxilo-Facial, Periodontia, Implantodontia e Ortopedia.

A depressão é uma desordem mental crônica que afeta mais de 300 milhões de pessoas no mundo. Durante episódios de depressão, o indivíduo tem sentimentos de tristeza, irritabilidade e vazio, e perda de interesse em executar suas atividades. Também tem sido relacionada à depressão a redução da densidade mineral óssea, com aumento do risco de fraturas. Assim, os efeitos da depressão sobre osteoblastos, osteoclastos e principalmente sobre a interação entre essas células são relevantes, uma vez que podem prejudicar os resultados de tratamentos para reparar defeitos ósseos. Com base nisso, estabelecemos a hipótese de que o isolamento social, um modelo de depressão em ratos, impacta negativamente osteoblastos, osteoclastos, sua interação e reparo ósseo induzido por terapia celular. Para testar essa hipótese, os efeitos do isolamento social sobre diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais (MSCs), diferenciação osteoclástica de monócitos, interação osteoblasto-osteoclasto e reparo ósseo induzido por MSCs serão avaliados. Como não há estudos comparando os efeitos do isolamento social no tecido ósseo de ratos e ratas, esta avaliação será realizada e o gênero que apresentar maiores alterações do tecido ósseo será selecionado para a continuidade do desenvolvimento do projeto. O isolamento social será realizado mantendo 1 animal por caixa e animais controles serão mantidos 3 por caixa, por 10 semanas. Ao final de 10 semanas, os animais serão submetidos aos testes de preferência por sacarose e do nado forçado, e amostras de sangue serão coletadas para quantificações de cortisol, noradrenalina e serotonina por ELISA, parâmetros indicados para confirmar a eficácia desse modelo de depressão. Em seguida, o tecido ósseo de fêmures, vértebras e calvárias será submetido às análises microtomográfica e histológica. As etapas seguintes do projeto serão realizadas com animais do gênero no qual o tecido ósseo apresentar maiores alterações em função do isolamento social. MSCs e monócitos derivados da medula óssea desses animais serão cultivados em meio osteogênico e osteoclastogênico, respectivamente, e marcadores genotípicos e fenotípicos de osteoblastos e osteoclastos serão avaliados. A interação entre osteoblastos e osteoclastos será investigada em modelo de cocultura indireta. MSCs serão injetadas em defeitos criados em calvárias de ratos controles ou submetidos ao isolamento social e o tecido ósseo formado será avaliado por análises microtomográfica e histológica. Nossos resultados poderão contribuir para o desenvolvimento de novas terapias para tratar defeitos ósseos de pacientes acometidos por desordens mentais, com aplicações na cirurgia buco-maxilo-facial, implantodontia, periodontia e ortopedia, o que geraria melhora na qualidade de vida de uma parcela importante da população.

Existem evidências de que condicionamentos de células-tronco mesenquimais (MSCs) aumentam sua eficácia nos procedimentos de medicina regenerativa. Estudos têm demonstrado que o emprego isolado de diferentes estratégias estimula a diferenciação celular e, em última análise, a formação tecidual. Entre elas, o aumento da expressão ou da exposição de MSCs a fatores de crescimento, modificações da superfície de cultivo e a terapia com fotobiomodulação (FBM). Nesse sentido, nossa hipótese é que a combinação desses estímulos resulta em efeito sinérgico sobre MSCs, capazes de regenerar o tecido ósseo. Portanto, o objetivo deste estudo é avaliar o efeito da terapia utilizando injeção local de MSCs triplamente condicionadas por (1) edição gênica para sobre-expressar BMP-9, (2) cultivo sobre superfícies com microtopografia e (3) FBM com laser sobre a regeneração óssea. Para isso, uma linhagem imortalizada de MSCs derivadas de medula óssea serão geneticamente editadas para sobre-expressar BMP-9 (MSCsBMP-9+) pelo sistema CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-associated protein 9). MSCsBMP-9+ cultivadas sobre superfícies com microtopografia serão avaliadas pela expressão proteica de BMP-9, expressão de genes da via das BMPs e da diferenciação osteoblástica. Essas células serão injetadas na concentração de 5104 células/50 mL de PBS em defeitos de calvária de ratos criados 2 semanas antes da injeção. A FBM será aplicada imediatamente, 48 e 96 h após a injeção (808 nm; 40 mW; 1,42 W/cm2; 4 J/cm2; 3 s; 0,12 J/ponto; 0,028 cm2) e em quatro pontos (um no centro e três equidistantes, ao redor do defeito). A formação óssea será avaliada por microtomografia computadorizada in vivo imediatamente, 2 e 4 semanas após a injeção e por análise histológica ao final de 4 semanas. Os dados quantitativos serão avaliados quanto à aderência à curva normal e homogeneidade de variâncias para selecionar os testes estatísticos adequados (nível de significância de 5). Os resultados desse estudo poderão contribuir para o estabelecimento de novos tratamentos, baseados em conceitos de terapia celular, para promover a regeneração óssea em sítios desafiadores, com aplicações nas áreas de Cirurgia Buco-Maxilo-Facial, Periodontia, Implantodontia e Ortopedia.

A terapia celular é uma das estratégias da medicina regenerativa que se mostra promissora para o tratamento de defeitos ósseos extensos utilizando, principalmente, células-tronco mesenquimais (MSCs, abreviação do Inglês, mesenchymal stem cells) e o estudo de moléculas que atuam nessas células para favorecer a regeneração óssea é relevante nesse contexto. Dentre essas moléculas, a proteína de matriz extracelular agrin, envolvida em vários processos biológicos, foi detectada em condrócitos e demonstrada sua participação no desenvolvimento do sistema esquelético. No entanto, até o momento, há pouca informação na literatura acerca dos efeitos de agrin na diferenciação osteoblástica de MSCs e na formação óssea por elas induzida, assim como das vias de sinalização celular envolvidas nesses efeitos. Portanto, os objetivos desse estudo são investigar: (1) in vitro, o efeito da sobre-expressão e do silenciamento de agrin por CRISPR/Cas9 sobre a diferenciação osteoblástica de MSCs, (2) in vitro, a participação das vias de sinalização de BMPs, Wnt, Notch e Hippo-Yap/Taz no efeito de agrin sobre a diferenciação osteoblástica de MSCs e (3) in vivo, o efeito de MSCs com sobre-expressão e silenciamento de agrin por CRISPR/Cas9 sobre a regeneração do tecido ósseo em defeitos criados em calvárias de camundongos. Os resultados desse estudo poderão gerar dados importantes acerca da função de agrin no tecido ósseo e para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas em situações clínicas que envolvem a regeneração óssea.

Vesículas extracelulares (VEs) têm sido relacionadas a uma ampla gama de funções em desenvolvimento na imunologia, angiogênese e biologia de células-tronco, bem como à diversas patologias. As VEs são organelas bioativas que podem transportar informações genéticas, lipídios, proteínas e ácidos nucléicos entre as células, influenciando assim sobre diversas funções moleculares, como na sinalização e regulação da expressão gênica das células-alvo. Uma classe especial de VEs chamadas Vesículas da Matriz (MVs) são protagonistas em uma das teorias mais aceitas para a formação dos primeiros cristais de hidroxiapatita e propagação mineral para a formação óssea em vertebrados. Porém, ainda existem impotantes lacunas nesta teoria que necessitam ser investigadas, como: Qual o papel efetivo das vesículas no processo? Qual o papel das proteínas/enzimas que as compõem? Como as interações entre o colágeno e as proteínas/enzimas presentes nas vesículas podem ser responsáveis pela nucleação e consequente propagação da mineralização? Como estas interações regulam o processo de mineralização mediado por MVs? Como o pH e fosfo-substratos influenciam na formação e propagação dos cristais de hidroxiapatita mediados por MVs? Mediante tais questionamentos, o presente projeto visa isolar VEs com qualidade e quantidade suficiente para entender a natureza das interações entre vesículas nativas e proteínas osteogênicas. Modelos de membrana como proteolipossomos e monocamadas de Langmuir enriquecidos com proteínas importantes no processo de mineralização servirão para determinar em detalhes os mecanismos de formação de apatita e a função dessas proteínas durante o processo. O projeto é inovador e interdisciplinar, tendo como proponente e colaboradores pesquisadores das áreas de bioquímica, físico-química, farmácia e odontologia. Desta forma, será abrangido desde o estado da arte biofísica (reologia, fluidez), metodologias de instrumentos (Microscopia de força atômica acoplada a espectroscopia Raman aumentada por ponta (AFM-Tip Enhanced Raman Spectroscopy), microscopia TEM, BAM, microanálises de raios-X por energia dispersiva, RAMAN e SPR), metodologias bioquímicas (isolamento e caracterização de VEs nativas, produção de proteínas recombinantes), biologia celular (condrócitos primários, osteoblastos e osteoclastos), até funções e aplicações das VEs in vitro e in vivo utilizando sistemas miméticos de proteolipossomos na área de regeneração óssea. Detalhes altamente resolvidos sobre a natureza das interações entre VEs nativas ou proteolipossomos com proteínas importantes no processo de biomineralização poderão ser obtidos. A proposta de pesquisa fornecerá informações detalhadas de capacidade de mineralização das VEs, detalhando sua capacidade de nucleação, propagação, regeneração e ainda degradação (reabsorção). Outro ponto muito forte da proposta de pesquisa é o desenvolvimento de abordagens metodológicas que podem ser generalizadas para investigações de VEs. Poucos laboratórios no mundo focam suas pesquisas no descobrimento das funções dessas vesículas, tornando a proposta de pesquisa muito original. Vesículas modelo e nativas apresentam um grande potencial biotecnológico e poderão ser utilizadas para selecionar inibidores com o intuito de prevenir a calcificação patológica, bem como propiciar a regeneração/reabsorção óssea.

Osteócitos são as células mais abundantes do tecido ósseo e essenciais para o funcionamento do esqueleto. Derivados da linhagem osteoprogenitora e com morfologia dendrítica, os osteócitos são envolvidos pela matriz mineralizada durante o processo de formação óssea. Uma de suas funções é regular a atividade de osteoblastos e osteoclastos através da secreção de fatores que modulam várias vias de sinalização, contribuindo assim para a homeostase óssea e também para a osseointegração de implantes de titânio (Ti). Dessa forma, o estudo de moléculas que possam favorecer estes processos se torna fundamental no contexto da biologia óssea. Nosso grupo de pesquisa mostrou que a proteína de matriz extracelular Agrin participa da diferenciação osteoblástica e que a superfície de Ti com nanotopografia possui efeito osteoindutivo. No entanto, a expressão de Agrin por osteócitos e sua participação na formação óssea e osseointegração de implantes de Ti com nanotopografia não foram ainda investigadas. Portanto, o objetivo desse estudo é investigar a expressão de Agrin por osteócitos e seus efeitos na diferenciação dessas células, na formação de tecido ósseo durante o desenvolvimento esquelético e na osseointegração de implantes de Ti com nanotopografia. Para isso, serão avaliados: 1) in vitro a participação do Agrin na diferenciação de osteócitos, utilizando células da linhagem osteocítica Ocy454, e o envolvimento das vias de sinalização de BMPs, Wnt, Notch e Hippo-Yap/Taz; 2) in vivo a participação do Agrin expresso por osteócitos na formação óssea durante o desenvolvimento esquelético, utilizando camundongos geneticamente modificados com deleção condicional da expressão de Agrin em osteócitos; 3) in vitro a participação do Agrin na interação entre células da linhagem osteocítica Ocy454 e Ti com nanotopografia, comparado ao Ti controle, e o envolvimento das vias de sinalização de BMPs, Wnt, Notch e Hippo-Yap/Taz.; e 4) in vivo a participação do Agrin expresso por osteócitos na osseointegração de implante de Ti com nanotopografia, comparado ao implante de Ti controle, utilizando implantes instalados na cavidade bucal de camundongos geneticamente modificados com deleção condicional da expressão de Agrin em osteócitos. Como o papel do Agrin na atividade de osteócitos e os mecanismos envolvidos ainda são desconhecidos, os resultados obtidos com a execução desse projeto serão cientíica e terapeuticamente importantes, pois a Agrin pode ser uma proteína alvo para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que envolvem a remodelação óssea mediada por osteócitos e que favoreçam os eventos relacionados ao processo de osseointegração.

Esse projeto visa o desenvolvimento de material biomimético do compósito P(VDF-TrFE)/BaTiO3 para fabricação de scaffold por eletrofiação e impressão tridimensional e avaliação das suas propriedades estruturais, mecânicas e físico-químicas. Seu uso na engenharia de tecido ósseo será investigado por meio de sua associação com células-tronco mesenquimais estimuladas por fotobiomodulação e implantação em defeitos de calvária de ratos. A formação óssea será avaliada por microtomografia e histologia.

A manutenção da osseointegração de implantes de titânio (Ti) baseia-se na remodelação óssea, que compreende um equilíbrio entre a formação de tecido ósseo por osteoblastos e a atividade de reabsorção desse tecido por osteoclastos. Nosso grupo mostrou que a superfície de Ti com nanotopografia obtida através de condicionamento químico com solução de H2SO4/H2O2é capaz de induzir a diferenciação osteoblástica tanto em condições osteogênicas como não-osteogênicas. No entanto, o efeito dessa superfície sobre a diferenciação e atividade de osteoclastos, e sobre a interação dos mesmos com células osteoblásticas ainda não foram investigados. Nesse contexto, nós elaboramos a hipótese de que a nanotopografia, além de favorecer a diferenciação osteoblástica, modula a interação osteoblasto/osteoclasto, inibindo a diferenciação osteoclástica. Portanto, o objetivo desse estudo é determinar a influência da superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti usinada (controle), sobre a interação entre células osteoblásticas e osteoclásticas. Para isso, avaliaremos: (1) o efeito da superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti controle, sobre a diferenciação osteoblástica e sobre a formação e a atividade osteoclástica em culturas isoladas de células da linhagem MC3T3-E1 e RAW 264.7, respectivamente, crescidas sobre essas superfícies; (2) o efeito de células osteoblásticas da linhagem MC3T3-E1 sobre a formação e atividade osteoclástica de células da linhagem RAW 264.7 crescidas sobre a superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti controle, em modelos de co-cultura indireta; (3) o efeito de células osteoclásticas da linhagem RAW 264.7 sobre a diferenciação osteoblástica de células da linhagem MC3T3-E1 crescidas sobre a superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti controle, em modelos de co-cultura indireta; (4) o efeito do meio condicionado por células osteoblásticas da linhagem MC3T3-E1 crescidas sobre a superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti controle, sobre a formação e atividade osteoclástica de células da linhagem RAW 264.7, e (5) o efeito do meio condicionado por células osteoclásticas da linhagem RAW 264.7 crescidas sobre a superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti controle, sobre a diferenciação osteoblástica de células da linhagem MC3T3-E1

A osteoporose é uma doença que compromete a resistência e a qualidade do tecido ósseo. Diferentes metodologias no campo da Odontologia têm sido utilizadas em busca do reparo ósseo frente a esta doença que pode predispor a doenças periodontais, acelerando a perda do osso alveolar. A laserterapia em baixa intensidade é uma técnica que vem sendo utilizada em busca da neoformação óssea. Diferentes tempos, número de aplicações, comprimentos de onda e densidades de energia tem sido estudadas. Outra metodologia é a regeneração tecidual guiada. Experimentos in vitro e in vivo tem demonstrado resultados favoráveis da utilização da membrana obtida pela associação do polímero de poli(vinilideno-trifluoretileno) e da cerâmica de titanato de bário (P(VDF-TrFE)/BT) quando comparada à membrana de politetrafluoretileno (PTFE). Assim, este estudo tem como objetivo avaliar in vivo a resposta do tecido ósseo à laserterapia de baixa intensidade quando associada aos dois tipos de membrana, PTFE e P(VDF-TrFE)/BT, em defeitos ósseos em calvárias de ratas com modelo experimental para a osteoporose. Ratas Wistar Hannover (300g) serão submetidas à simulação de cirurgia de ovariectomia bilateral (Grupo 1 - Sham; n=5) e à cirurgia de ovariectomia bilateral (n=35). Após 90 dias serão realizados defeitos ósseos (5 mm) na calvária de todos os animais e os animais ovariectomizados serão distribuídos em quatro grupos: Grupo 2 - sem membrana e sem aplicação de laser (n=5); Grupo 3 - membrana de P(VDF-TrFE)/BT (n=10); Grupo 4 - membrana de P(VDF-TrFE)/BT + aplicação de laser (n=10); Grupo 5 - membrana de PTFE + aplicação de laser (n=10). O laser a ser utilizado será o diodo arseneto de gálio-alumínio (AsGaAl), com comprimento de onda de 780 nm e densidade de energia ou fluência de 30J/cm2 (12 sessões). Ao final de trinta dias da confecção do defeito ósseo, os animais serão eutanasiados e serão realizados os seguintes ensaios: (1) análise tomográfica (micro-CT) dos defeitos previamente criados; (2) análise histológica com base em cortes histológicos não descalcificados; (3) PCR em tempo real para detecção de RNAm para os marcadores osteoblásticos fator de transcrição 2 com domínio Runt (RUNX2), fosfatase alcalina (ALP), sialoproteína óssea (BSP), osteocalcina (OC), osteopontina (OPN), osterix (OSX), ligante do receptor para a ativação do fator nuclear kappa B (RANKL) e osteoprotegerina (OPG); e para os marcadores osteoclásticos receptor para a ativação do fator nuclear kappa B (RANK), catepsina K, metaloproteinase-9 da matriz (MMP-9) e receptor para a calcitonina. Os testes estatísticos para analisar os resultados numéricos serão selecionados de acordo com a distribuição das amostras.

O osso é um tecido com grande capacidade de regeneração, mas em algumas situações a extensão da injúria impede o reparo do tecido. Nesse cenário, a terapia celular utilizando células-tronco mesenquimais (do Inglês, mesenchymal stem cells MSCs) tem atraído a atenção de diversos grupos de pesquisa por ser uma alternativa promissora em relação aos tratamentos existentes. No entanto, diversos aspectos moleculares, celulares e teciduais, ainda não abordados na literatura, necessitam ser investigados para tornar essa terapia um tratamento efetivo para a regeneração de defeitos ósseos em pacientes saudáveis ou acometidos por doenças sistêmicas que afetam o processo de reparo ósseo, como a osteoporose, a diabetes mellitus e a hipertensão. Nesse contexto, o presente projeto é composto por três subprojetos, cujos objetivos são: (1) investigar o potencial de MSCs derivadas de medula óssea (do Inglês, bone marrow BM-MSCs) e de tecido adiposo (do Inglês, adipose tissue AT-MSCs), tratadas com fator de crescimento do endotélio vascular A (do Inglês, vascular endothelial growth fator A VEGF-A) e/ou proteína óssea morfogenética 9 (do Inglês, bone morphogenetic protein 9 BMP-9) para regenerar o tecido ósseo; (2) investigar o potencial dessas MSCs modificadas geneticamente para sobre-expressar VEGF-A e/ou BMP-9 para regenerar o tecido ósseo e (3) avaliar a influência de BM-MSCs obtidas de ratos saudáveis sobre o potencial osteogênico de BM-MSCs obtidas de ratos osteoporóticos, diabéticos e hipertensos. Para o desenvolvimento dos subprojetos 1 e 2, BM-MSCs e AT-MSCs serão tratadas com VEGF-A e/ou BMP-9 ou modificadas geneticamente utilizando agrupados de curtas repetições palindrômicas regularmente interespaçadas (CRISPR-Cas9) para sobre-expressar VEGF-A e/ou BMP-9. Essas células serão caracterizadas in vitro quanto ao potencial angiogênico e osteogênico e à expressão gênica e proteica em larga escala. Para a regeneração do tecido ósseo, as BM-MSCs e AT-MSCs associadas ao VEGF-A e/ou BMP-9 ou modificadas para sobre-expressar VEGF-A e/ou BMP-9 serão injetadas diretamente em defeitos criados em calvárias de ratos. Inicialmente, o tempo de permanência das células nos defeitos ósseos será avaliado por luminescência, utilizando a injeção de células transfectadas com luciferase. Por até 4 semanas após a injeção de células, a progressão da formação de vasos sanguíneos e de tecido ósseo será avaliada por microtomografia computadorizada (micro-CT) in vivo. Ao final de 4 semanas, os animais serão eutanasiados e as amostras serão avaliadas por análise histológica. No subprojeto 3, será avaliada a influência de BM-MSCs obtidas de ratos saudáveis sobre a diferenciação osteoblástica de BM-MSCs obtidas de ratos osteoporóticos, diabéticos e hipertensos utilizando um modelo de co-cultura indireta. Trata-se de estudo in vitro, cujos resultados, poderão gerar desdobramentos durante o desenvolvimento do presente projeto, com vistas à aplicação das terapias abordadas nos subprojetos 1 e 2 para a investigação da regeneração óssea nos modelos de patologias abordados no subprojeto 3.

A doença periodontal e a osteoporose são doenças caracterizadas pela reabsorção óssea com uma alta prevalência a nível mundial. Pesquisas têm demonstrado associação entre estas duas doenças, por meio do aumento da perda de massa óssea sistêmica e desequilíbrio do sistema RANK-RANKL-OPG, desencadeando também a perda óssea alveolar. O chá verde é uma das bebidas mais comuns no mundo e de fácil acesso, havendo indícios de que a epigalocatequina-galato (EGCG), um flavonóide presente no seu extrato, poderia diminuir a perda óssea, em patologias como a osteoporose e a doença periodontal. Visando verificar seus possíveis efeitos e aplicá-los no tratamento e prevenção destas doenças, este projeto tem por objetivo avaliar por meio de parâmetros morfológicos, tomográficos, bioquímicos e moleculares, a influência do extrato de chá verde (GTE) na doença periodontal induzida por ligadura em ratas ovariectomizadas. Ratas Wistar serão ovariectomizadas e pareadas com controles sham. Imediatamente após a cirurgia, será realizada a administração por sonda gástrica de 50 mg/kg de extrato de chá verde (GTE) por 60 dias e indução da doença periodontal mediante ligadura 15 dias antes do sacrifício. Serão coletadas as mandíbulas e fêmures para análises histológica, microtomográfica e morfométrica. Além disso, as células osteoblásticas da mandíbula serão isoladas e cultivadas em meio osteogênico para a realização de ensaios bioquímicos e moleculares. As amostras serão divididas em 4 grupos: controle sham + doença periodontal (Cdp), ovariectomizado + doença periodontal (Odp), controle sham + doença periodontal + GTE (Cdp/gte) e ovariectomizado + doença periodontal + GTE (Odp/gte). Os resultados obtidos serão analisados por meio do software estatístico Sigma Plot com nível de significância em 5%.

O osso é um tecido com grande capacidade de regeneração, mas em algumas situações a extensão da injúria impede o reparo do tecido. Nesse cenário, a terapia celular utilizando células-tronco tem atraído a atenção de diversos grupos de pesquisa por ser uma alternativa promissora em relação aos tratamentos existentes. No entanto, diversos aspectos moleculares, celulares e teciduais, ainda não abordados na literatura, necessitam ser investigados para tornar essa terapia um tratamento efetivo para a regeneração de defeitos ósseos. Sendo assim, os objetivos desse estudo são: (1) comparar o potencial para regenerar o tecido ósseo de células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas de medula óssea (CTMs-MO) e de tecido adiposo (CTMs-TA) por meio de injeção de células diretamente em defeitos criados em calvárias de ratos e (2) comparar a eficácia para regenerar o tecido ósseo de uma única injeção e de injeções repetidas de CTMs-MO ou CTMs-TA. Para isso, CTMs-MO e CTMs-TA serão obtidas de ratos e expandidas in vitro em meio de crescimento (condição não indutora de diferenciação celular) para que mantenham as características de células-tronco. Para a regeneração do tecido ósseo, as células serão injetadas (injeção única x injeções repetidas) diretamente em defeitos criados em calvárias de ratos. Os defeitos serão produzidos duas semanas antes da primeira injeção para mimetizar defeitos ósseos sem capacidade de auto-regeneração. Inicialmente, o tempo de permanência de CTMs-MO e CTMs-TA nos defeitos ósseos será avaliado por luminescência utilizando a injeção de células transfectadas com luciferase. Dessa forma, será possível determinar o intervalo entre as injeções repetidas. A primeira injeção de células será realizada duas semanas após a criação dos defeitos ósseos e nos animais que receberão injeções repetidas, as injeções adicionais serão aplicadas no intervalo determinado no ensaio de luminescência. Defeitos ósseos tratados com uma única injeção ou injeções repetidas do veículo utilizado (solução salina tamponada com fosfato) sem células serão também avaliados. Seis semanas após a primeira injeção, os animais serão mortos e o tecido ósseo neoformado será avaliado por microtomografia computadorizada, análise histológica, PCR em tempo real e análise do módulo de elasticidade e da dureza. Os dados serão submetidos ao teste de aderência à curva normal para determinar o teste estatístico adequado. Os resultados desse estudo poderão estabelecer novos parâmetros com relação às características de células candidatas ao uso em terapia celular e à injeção de células para regenerar tecido ósseo, visto que, até o momento, não há na literatura estudos avaliando o efeito de injeções repetidas.

O osso é um tecido com grande capacidade de regeneração, mas em algumas situações a extensão da injúria impede o reparo do tecido. Nesse cenário, a terapia celular tem atraído a atenção de diversos grupos de pesquisa por ser uma alternativa promissora em relação aos tratamentos existentes. No entanto, diversos aspectos moleculares, celulares e teciduais, ainda não abordados na literatura, necessitam ser investigados para tornar essa terapia um tratamento efetivo para a regeneração de defeitos ósseos. Sendo assim, os objetivos desse estudo são comparar as assinaturas moleculares e o potencial para regenerar o tecido ósseo de células-tronco mesenquimais (CTMs) e de osteoblastos. Para isso, CTMs serão obtidas de medula óssea (CTMs-MO) e de tecido adiposo (CTMs-TA) de ratos, expandidas in vitro e mantidas com características de CTMs ou diferenciadas em osteoblastos (OBs-MO e OBs-TA, respectivamente). As CTMs serão identificadas por imunofenotipagem por citometria de fluxo para os marcadores CD29, CD31, CD34, CD45, CD90 e CD106. A diferenciação osteoblástica será confirmada por avaliação da expressão gênica de Runx2, fosfatase alcalina e osteocalcina por PCR em tempo real. As assinaturas moleculares de CTMs-MO, CTMs-TA, OBs-MO e OBs-TA serão avaliada por análises em larga escala das expressões gênica (microarray) e proteica (proteômica). Para a regeneração do tecido ósseo, as células serão injetadas (injeção única x injeções repetidas) diretamente em defeitos criados em calvárias de ratos duas semanas antes da primeira injeção para mimetizar defeito ósseo sem capacidade de auto-regeneração. Inicialmente, o tempo de permanência de CTMs-MO, CTMs-TA, OBs-MO e OBs-TA nos defeitos ósseos será avaliado por bioluminescência utilizando a injeção de células transfectadas com luciferase. Dessa forma, será possível determinar o intervalo entre as injeções repetidas. Duas semanas após a criação dos defeitos ósseos, será realizada a primeira injeção de células e as injeções adicionais serão aplicadas no intervalo determinado no experimento anterior. Defeitos ósseos tratados com uma única injeção de células e com o veículo utilizado (solução salina tamponada com fosfato) sem células serão também avaliados. Seis semanas após a primeira injeção, os animais serão mortos e o tecido ósseo neoformado será avaliado por microtomografia computadorizada, análise histológica, PCR em tempo real e análise do módulo de elasticidade e da dureza. Os dados serão submetidos ao teste de aderência à curva normal para determinar o teste estatístico adequado. Os resultados desse estudo poderão estabelecer novos parâmetros com relação às características de células candidatas ao uso em terapia celular e à injeção de células para regenerar tecido ósseo, visto que, até o momento, não há na literatura estudos avaliando o efeito de injeções repetidas.

A engenharia de tecidos é uma ciência interdisciplinar baseada na combinação de arcabouços, células e fatores de crescimento com o objetivo de desenvolver novos tecidos. Estratégias envolvendo engenharia de tecidos como terapia para o tratamento de defeitos ósseos produzidos por trauma, processo infeccioso ou patológico são de grande interesse nas áreas de cirurgia buco-maxilo facial e ortopedia. Resultados preliminares mostraram o alto potencial osteogênico do Bio-sca, um arcabouço poroso desenvolvido a partir do Biosilicato®, sugerindo que esse biomaterial pode ser adequado para o uso em engenharia de tecido ósseo. Assim, os objetivos do nosso estudo são: (1) avaliar in vitro as respostas de células-tronco mesenquimais (CTM) e osteoblastos em estágios iniciais de diferenciação crescidos sobre o Bio-sca e (2) avaliar in vivo o efeito da associação entre CTM ou osteoblastos em estágios iniciais de diferenciação e o Bio-sca sobre o reparo de defeitos ósseos criados em calvárias de ratos. Para isso, CTM e osteoblastos em estágios iniciais de diferenciação obtidos de medula óssea de ratos serão caracterizados quanto à expressão de marcadores de superfície (CD13, CD29, CD31, CD44, CD73, CD90, CD105, CD166, CD14, CD34 e CD45) por citometria de fluxo e à expressão de um painel de genes indicativos da diferenciação osteoblástica, fosfatase alcalina (ALP), runt-related transcription factor 2 (RUNX2), osterix (OSX) colágeno do tipo I (COL I), proteína morfogenética óssea tipo 2 (BMP-2), sialoproteína óssea (BSP), osteopontina (OPN) e osteocalcina (OC) será por PCR em tempo real. Em seguida, serão avaliadas a proliferação celular, atividade de ALP, formação de matriz mineralizada e expressão das proteínas Runx2 e ALP e a expressão dos mesmos genes citados acima das CTM e osteoblastos em estágios iniciais de diferenciação, crescidos sobre Bio-sca e Bioglass® 45S5 (controle). Para as avaliações in vivo, defeitos ósseos criados em calvária de ratos receberão quatro tipos de tratamento, Bio-sca carreado com CTM, Bio-sca carreado com osteoblastos em estágios iniciais de diferenciação, Bio-sca sem células e sem tratamento, e as amostras serão submetidas a análises tomográfica e histomorfométrica. Nossos resultados contribuirão para um avanço em termos de pesquisa translacional em engenharia de tecido ósseo e poderão estabelecer novos tratamentos para o reparo de defeitos ósseos.

Atualmente, as células mesenquimais de diversas origens são consideradas fontes para substituição de tecidos. Estas células têm potencial osteogênico e podem ser elegíveis para o reparo e manutenção do tecido ósseo, sendo muito atrativas para a engenharia tecidual. Entretanto, mudanças no seu comportamento podem ser causadas por fatores como a osteoporose, afetando a sua habilidade de auto-renovação e diferenciação. Sendo assim, o objetivo do presente projeto é comparar a expressão gênica de células mesenquimais provenientes da medula óssea diferenciadas em células osteoblásticas com o de células osteoblásticas provenientes da calvária de ratas submetidas à condição de osteoporose. Serão utilizadas 18 ratas Wistar divididas em grupos controle e tratado (indução da osteoporose). As ratas do grupo tratado serão submetidas à ovariectomia bilateral através de protocolo adequado e após 150 dias da cirurgia, as ratas de ambos os grupos serão sacrificadas para coleta dos fêmures e de fragmentos da calvária. Os experimentos serão realizados em triplicata e a partir dos materiais coletados, serão isoladas as células mesenquimais da medula óssea e as células osteoblásticas da calvária e colocadas em garrafas com meio de cultura suplementado (osteogênico) para proliferação e posterior plaqueamento em placas de 24 poços (n=5) para avaliação dos seguintes parâmetros: proliferação e viabilidade celular, quantidade de proteína total e atividade de fosfatase alcalina (ALP), detecção e quantificação de nódulos mineralizados e análise da expressão de proteínas associadas à osteogênese por meio de imunofluorescência e PCR em tempo real. Além disso, será realizada a avaliação do perfil transcricional (RNAm e microRNAs) e construção de redes gênicas. Os dados dos ensaios bioquímicos serão analisados com o auxílio de programas de estatística para pd0.05 assim como programas de bioinformática especializados serão utilizados para avaliar os dados do perfil transcricional.

A engenharia de tecido ósseo, associando células-tronco mesenquimais (CTMs) a biomateriais, tem sido proposta como tratamento potencial para o reparo de defeitos ósseos, constituindo uma abordagem nova na área da medicina regenerativa e de amplo interesse para as áreas de cirurgia buco-maxilo-facial e ortopedia, principalmente em situações de não-união de fraturas. Além da utilização de CTMs bem caracterizadas, a seleção do mecanismo utilizado para acondicioná-las nos sítios de defeitos ósseos é fator chave para o sucesso do tratamento. Nesse cenário, os biomateriais, entre os quais os vidros bioativos (e.g.: Biosilicato®) e os compósitos de polímero/cerâmica (e.g.: P(VDF-TrFE)/BT), representam uma alternativa viável para serem empregados como carreadores de células em procedimentos de engenharia de tecido ósseo. Como a osteoporose aumenta dramaticamente o risco de ocorrência de fraturas ósseas, estratégias envolvendo engenharia de tecido ósseo deveriam focar, além do tratamento de defeitos de ossos normais, também ossos osteoporóticos nos quais o processo de reparo é sabidamente deficiente. Assim, os objetivos desse estudo são: (1) caracterizar in vitro as CTMs derivadas de medula óssea e de tecido adiposo de ratos normais durante os processos de diferenciação osteoblástica e adipocítica quanto à expressão de marcadores de superfície de CTMs, proliferação e viabilidade celulares, formação de matriz extracelular mineralizada, formação de acúmulo lipídico e expressão gênica (análise de microarray) e proteica (análise proteômica), em larga escala e temporal, em culturas crescidas em condições osteogênicas e adipogênicas; (2) avaliar in vivo o efeito da engenharia de tecido ósseo, utilizando CTMs derivadas de medula óssea e de tecido adiposo associadas aos biomateriais Biosilicato® e P(VDF-TrFE)/BT, no reparo de defeitos de ossos normais e osteoporóticos, utilizando o modelo de defeito ósseo criado em calvária de ratas, por meio de análises tomográfica e histológica. Nossos resultados, em conjunto, representarão um avanço em termos de pesquisa translacional em engenharia de tecido ósseo e poderão influenciar diretamente a rotina de trabalho nas clínicas odontológica e médica, em especial aquelas ligadas ao Sistema Único de Saúde, por estabelecer novas terapias para o reparo de não-união de fraturas que poderão beneficiar tanto pacientes normais quanto pacientes osteoporóticos.

A engenharia de tecidos é uma ciência interdisciplinar baseada na combinação de arcabouços, células e fatores de crescimento com o objetivo de desenvolver novos tecidos. Estratégias envolvendo engenharia de tecidos como terapia para o tratamento de defeitos ósseos produzidos por trauma, processo infeccioso ou patológico são de grande interesse nas áreas de cirurgia buco-maxilo facial e ortopedia. Resultados preliminares mostraram o alto potencial osteogênico do Bio-sca, um arcabouço poroso desenvolvido a partir do Biosilicato®, sugerindo que esse biomaterial pode ser adequado para o uso em engenharia de tecido ósseo. Assim, os objetivos do nosso estudo são: (1) avaliar in vitro as respostas de células-tronco mesenquimais (CTM) e osteoblastos em estágios iniciais de diferenciação crescidos sobre o Bio-sca e (2) avaliar in vivo o efeito da associação entre CTM ou osteoblastos em estágios iniciais de diferenciação e o Bio-sca sobre o reparo de defeitos ósseos criados em calvárias de ratos. Para isso, CTM e osteoblastos em estágios iniciais de diferenciação obtidos de medula óssea de ratos serão caracterizados quanto à expressão de marcadores de superfície (CD13, CD29, CD31, CD44, CD73, CD90, CD105 e CD166, CD14, CD34, CD45) por citometria de fluxo e à expressão de um painel de genes indicativos da diferenciação osteoblástica, fosfatase alcalina (ALP), runt-related transcription factor 2 (RUNX2), osterix (OSX) colágeno do tipo I (COL I), proteína morfogenética óssea tipo 2 (BMP-2), sialoproteína óssea (BSP), osteopontina (OPN) e osteocalcina (OC) será por PCR em tempo real. Em seguida, serão avaliadas a proliferação celular, atividade de ALP, formação de matriz mineralizada e expressão das proteínas Runx2 e ALP e a expressão dos mesmos genes citados acima das CTM e osteoblastos em estágios iniciais de diferenciação, crescidos sobre Bio-sca e Bioglass® 45S5 (controle). Para as avaliações in vivo, defeitos ósseos criados em calvária de ratos receberão quatro tipos de trat

Estudos iniciais de nosso grupo de pesquisa mostraram que a simples adsorção de GDF-5 sobre nanotopografias de titânio (Ti), obtidas por condicionamento com ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio, altera parâmetros importantes do desenvolvimento do fenótipo osteogênico in vitro, resultando em aumento da atividade de fosfatase alcalina (ALP) e em acúmulos maiores de cálcio em formações de matriz mineralizada de culturas primárias de células osteoblásticas. Visando aprofundar os conhecimentos sobre a relevância da funcionalização de GDF-5 sobre nanotopografia de Ti, o presente projeto tem como objetivos: 1) avaliar os efeitos da pós-adsorção de proteínas principais do plasma- albumina, fibrinogênio e fibronectina, em nanotopografia de Ti com GDF-5 disponibilizado por simples adsorção, sobre a mineralização de culturas primárias de células osteogênicas; 2) considerando que o processo de adsorção resulta em formação de filme inomogêneo de GDF-5 sobre nanotopografias de Ti, avaliar a resposta de culturas primárias de células osteogênicas quando crescidas sobre filmes finos, homogêneos, de GDF-5 obtidos pelo método layer-by-layer, em comparação àqueles obtidos por simples adsorção, em relação à expressão de marcadores da diferenciação osteoblástica por reação em cadeia da polimerase em tempo real (real time PCR), atividade de ALP e formação de matriz mineralizada; 3) baseados nos resultados obtidos nos experimentos in vitro, avaliar, em tíbia de coelhos, a formação óssea adjacente a implantes de Ti com superfície nanoestruturada e funcionalizada com GDF-5.

O carcinoma espinocelular (CEC) representa a neoplasia maligna mais prevalente das estruturas bucais, podendo invadir e destruir o tecido ósseo devido ao aumento da atividade osteoclástica. A expressão da proteína matricelular osteopontina (OPN) tem sido relacionada à maior agressividade de neoplasias por favorecer fenômenos celulares de adesão, proliferação e invasão. No tecido ósseo, a OPN representa a proteína mais abundante da matriz não colágena, concentrada nas interfaces ósseas (linhas de cimentação e lâminas limitantes), sendo essencial para a adesão e atividades de osteoblastos e osteoclastos. O presente estudo tem como objetivo avaliar a expressão de osteopontina em sistemas de coculturas de células osteoblásticas e epiteliais neoplásicas humanas e seus efeitos sobre o fenótipo neoplásico e ativação osteoclástica. Serão avaliados: 1) perfil de expressão de OPN em coculturas de células osteoblásticas e epiteliais neoplásicas humanas; 2) efeito da OPN de culturas osteoblásticas sobre o genótipo e fenótipo de células epiteliais neoplásicas humanas e 3) o efeito da OPN secretada em coculturas sobre a ativação osteoclástica.

O tecido ósseo tem a função de sustentar e proteger os demais tecidos do organismo, necessitando de resistência adequada sem peso excessivo. Para atingir a eficiência necessária, dispõe de complexos mecanismos de remodelação e reparação, orquestrados por hormônios e citocinas inter-relacionados com o sistema imune, estudados pelo campo da osteoimunologia. Recentemente tem crescido o estudo de processos de inflamação estéril, sobretudo em fatores denominados DAMPs, e com isso o interesse no envolvimento destes processos na biologia óssea. DAMPs são padrões moleculares associados a dano tecidual, liberados por diferentes células quando acometidas por diferentes tipos de estresse e processos necróticos, capazes de ativar receptores do sistema imune de forma similar a padrões bacterianos. Um dos DAMPs mais estudados, o HMGB1, já teve seus efeitos em células ósseas caracterizados, sugerindo papel desta classe de mediadores nos processos de remodelação óssea. Sugerimos então o estudo de outra classe de mediadores também considerados DAMPs, potencialmente envolvidos no processo: as heat shock proteins. Heat shock proteins são mediadores produzidos por células após estímulos de estresse, tais como choque térmico, alterações de pH, entre outros. Níveis elevados destas proteínas também foram encontrados no fluido gengival de pacientes submetidos a tratamento ortodôntico, sugerindo que estresse mecânico pode também desencadear sua expressão. Além de auxiliar o dobramento de novas proteínas, HSPs são importantes na sobrevida de células após eventos de estresse, e tem sido descritas também como DAMPs quando liberadas ao meio extracelular, atuando de forma similar ao HMGB1. Considerado o exposto, os objetivos deste trabalho são caracterizar a produção e atividade de heat shock proteins em osteoblastos in vitro; e analisar a expressão destas proteínas na movimentação ortodôntica humana e experimental, buscando indícios para futuramente estudar estresses mecânico em osteoblastos in

As proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs) são citocinas pertencentes à família do fator de crescimento transformante beta (TGF-beta) e estão envolvidas em diversos processos biológicos, incluindo a diferenciação osteoblástica e a formação óssea, eventos diretamente relacionados ao processo de osseointegração de implantes de titânio (Ti). Sabe-se que superfícies de Ti com nanotopografia favorecem a mineralização da matriz extracelular; no entanto, os mecanismos celulares envolvidos não são completamente entendidos. Neste contexto, nós elaboramos a hipótese de que as BMPs endógenas, especificamente as BMP-2/4, sabidamente osteogênicas, exercem função importante nas respostas de osteoblastos a superfícies de Ti nanoestruturadas. Previamente ao teste da hipótese, células pré-osteoblásticas da linhagem MC3T3-E1 serão cultivadas para avaliar: (1) a expressão gênica e proteica das BMP-2/4 em culturas crescidas sobre poliestireno, por Real-time PCR e ELISA; (2) a eficácia dos silenciadores (shRNA) para BMPR1A, Smad-4, Smad-6, Smurf-1 e Smurf 2 em silenciar a expressão das respectivas proteínas, todas envolvidas nas vias de sinalização das BMP-2/4, em culturas crescidas sobre poliestireno, por Western blot; e (3) o efeito dos silenciadores sobre as vias de sinalização das BMP-2/4 e sobre a expressão do fenótipo osteoblástico em culturas crescidas sobre poliestireno, por PCR-array e Western blot. Em seguida a hipótese será testada por avaliar: (1) o efeito da nanotopografia de superfície de Ti, comparada à superfície de Ti com microtopografia (controle), sobre a síntese de BMP-2/4 em culturas crescidas sobre essas superfícies, por Real-time PCR e ELISA; e (2) o efeito dos silenciadores sobre as vias de sinalização das BMP-2/4 e sobre a expressão do fenótipo osteoblástico em culturas crescidas sobre superfície de Ti com nanotopografia comparada à superfície de Ti controle, por PCR-array e Western blot. Os resultados desse estudo podem contribuir para o entendimento dos mecanis

O estabelecimento dos princípios biológicos da engenharia de tecidos tem contribuído para o desenvolvimento de membranas a serem aplicadas neste tipo de terapia que, em odontologia, tem sido empregada em situações clínicas diversas como tratamentos com implantes dentários, aumento de rebordo alveolar e reparo de defeitos ósseos de origem traumática e patológica. Nosso grupo de pesquisa realizou experimentos in vitro comparando a membrana obtida pela associação do polímero de poli(vinilideno-trifluoretileno) e da cerâmica de titanato de bário (P(VDF-TrFE)/BT) à membrana de politetrafluoretileno (PTFE). Os resultados mostraram que a maioria dos parâmetros avaliados, todos envolvidos em regeneração tecidual, exibe valores favoráveis à membrana de P(VDF-TrFE)/BT para as diferentes linhagens celulares estudadas (osteoblastos, fibroblastos e queratinócitos). Neste contexto, o objetivo do presente projeto é avaliar in vivo a resposta do tecido ósseo à membrana de P(VDF-TrFE)/BT e compará-la à membrana de PTFE (controle) . Para isso, serão criados defeitos ósseos (5 mm de diâmetro) em calvária de ratos Wistar machos (peso 200-250 g), distribuídos em três grupos com relação à utilização ou não de membranas nos defeitos ósseos: (1) membrana de P(VDF-TrFE)/BT; (2) membrana de PTFE; (3) nenhum tipo de membrana. Ao final de 4 e 8 semanas os animais serão sacrificados e serão realizados os seguintes ensaios: (1) análise tomográfica (micro-CT) dos defeitos previamente criados; (2) análises histológica e histomorfometria com base em cortes histológicos não-descalcificados; (3) PCR em tempo real para detecção de RNAm para os marcadores ósseos, runt-related transcription fator 2 (RUNX2), fosfatase alcalina (ALP), sialoproteína óssea (BSP), osteocalcina (OC), osteoprotegerina (OPG), receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) e receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANK). Estes marcadores ósseos serão também detectados em amostras de tecido ósseo retirad

Implantes de titânio têm sido extensivamente utilizados na Ortopedia e na Odontologia, principalmente como substituto de elementos dentários ausentes. O titânio é um implante metálico de escolha devido a sua alta biocompatibilidade e resistência à corrosão, e também porque não provoca reações imunológicas ao mesmo tempo em que promove a osseointegração. A biocompatibilidade do implante depende da resposta celular em contato com a sua superfície; sendo assim, mudanças nesta superfície podem provocar impactos benéficos na osseointegração através de alterações nas interações com as células presentes no local do implante, como por exemplo, células osteoblásticas. O objetivo do presente projeto é caracterizar o comportamento de células osteoblásticas humanas provenientes da crista óssea alveolar em contato com diferentes superfícies de titânio: controle (polido),com nanotopografia, com micro + nanotopografia e microtopografia rugosa. Os ensaios bioquímicos a serem realizados serão proliferação e viabilidade celular, quantidade de proteína total e atividade de fosfatase alcalina, além da detecção e quantificação de nódulos mineralizados, com a utilização do teste estatístico de variância ANOVA (5% significância). Também será realizada a identificação de genes induzidos e reprimidos nas células em contato com as diferentes superfícies de titânio por meio do método de oligoarray utilizando lâminas Agilent formato 4 x 44 K e análise do miRNA. Os dados serão analisados com o auxílio de programas de bioinformática especializados como SAM (significance analysis of microarrays), Cluster-TreeView e GeneNetwork e a plataforma de bioinformática GeneSpring (Agilent). A partir destes dados de níveis de transcrição reconstruiremos redes de interação gênica para finalmente avaliarmos em conjunto o papel de cada um em resposta ao contato com a superfície de titânio.

Na área de Implantodontia um dos fenômenos mais intensamente investigado é a osseointegração de implantes, o objetivo sendo sempre o de acelerar e/ou incrementar esse processo, visando uma reabilitação rápida e eficiente de pacientes edentados. O tratamento do titânio (Ti) com a oxidação por ácido sulfúrico e água oxigenada resulta em uma superfície nanotexturizada que estimula a osteogênese, como revelado in vitro por aumento na expressão de proteínas específicas e na formação de matriz mineralizada. Portanto, esse tratamento tem potencial para estimular a osseointegração de implantes de Ti. Assim sendo, o objetivo geral desse estudo será avaliar in vivo a resposta do tecido ósseo aos implantes de Ti com superfícies nanotexturizadas. Para tanto, após a inserção de implantes de Ti em tíbias de coelhos por 6 semanas, serão avaliados os seguintes parâmetros: a formação de tecido ósseo ao redor dos implantes por microtomografia, a porcentagem de contato osso-implante (BIC do Inglês bone-to-implant contact), o torque de remoção dos implantes e a expressão de genes marcadores do fenótipo osteoblástico em fragmentos de tecido ósseo próximos à superfície dos implantes.