Carlos Pelleschi Taborda.

A elaboração deste projeto surgiu naturalmente após a conclusão Projeto Temático 2016/08730-6 intitulado: Patogenicidade fúngica: Efeito do tabagismo, resposta imune e a modulação vacinal na paracoccidioidomicose e na histoplasmose. Aspectos importantes relacionados a fisiopatologia e controle das doenças fúngicas sistêmicas foram respondidos, entretanto novos questionamentos direcionados ao diagnóstico, imunidade inata e adaptativa e alternativas no tratamento/prevenção das infecções fúngicas foram identificados. De uma forma geral, estima-se que mais de mais de 150 milhões de casos graves de infecções fúngicas ocorrem em todo o mundo, resultando em aproximadamente 1,7 milhão de mortes por ano (Kainz et al., 2020). Estes números são subestimados considerando as doenças fúngicas sistêmicas no Brasil, onde não existe notificação compulsória. É essencial destacar que o tratamento com antifúngicos por tempo prolongado (comum entre as doenças fúngicas endêmicas) e o uso profilático de drogas antifúngicas em pacientes de alto risco (imunocomprometidos e transplantados) tem promovido o surgimento de fungos multirresistentes. As infecções fúngicas, apesar de silenciosas, já são uma ameaça global que está se tornando cada vez mais grave (Kainz et al., 2020). O Brasil ainda é marcado pela grave e profunda distorção econômica, social e educacional. Fatores logísticos e tecnológicos influenciam desde o acesso a um diagnóstico/acompanhamento laboratorial mais preciso até ao tratamento com antifúngicos mais eficazes. Associada estas distorções, a falta de implementação de sistema de notificação das doenças fúngicas tem impacto direto nas políticas públicas de controle destas doenças (Costa et al., 2019). Este projeto tem como foco o aprofundamento no estudo de questões envolvendo doenças fúngicas relevantes no Brasil: aspergilose, paracoccidioidomicose, histoplasmose, esporotricose e ptiríase versicolor. Propõem-se executar quatro linhas principais interligadas em questões que vão do diagnóstico ao tratamento, passando pela imunopatogenia.

Espécies do gênero Cryptococcus são uma das principais causas de infecções fúngicas invasivas e são responsáveis por 20 do total de infecções fúngicas causadas por fungos invasivos. Doenças criptocócicas afetam 194.000 pessoas em todo o mundo, com 147.000 mortes (75,8) anualmente. A principal apresentação clínica é a meningite criptocócica, embora a criptococose pulmonar também seja frequente, mas não tão letal. Disseminação da medula óssea e outros órgãos também é vista em pacientes imunocomprometidos. Cryptococcus neoformans foi recentemente classificado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como um patógeno crítico, indicando que esse patógeno fúngico requer a maior atenção do sistema de saúde para a pesquisa acadêmica e industrial. A taxa de mortalidade é de 100 em pacientes com meningite criptocócica sem o tratamento, que foi reduzida para 55 em 10 semanas e > 70 em um ano com monoterapia com fluconazol. A melhor terapia combinada atualmente disponível é Anfotericina B (AMB) com flucitosina, no entanto, a taxa de mortalidade reduziu em até 20 em países desenvolvidos e até 75 em países menos privilegiados. A recaída clínica/recorrência da doença é outra questão que aumenta a alta morbidade e mortalidade associadas à Criptococose. Esta proposta de projeto é focada na heterogeneidade fenotípica/populacional em C. neoformans. Heterorresistência, persistência antifúngica, biofilme, dormência e fenótipos viáveis, mas não cultiváveis (VBNC) são os resultados da heterogeneidade populacional em C. neoformans e são universalmente exibidos por todas as cepas estudadas de C. neoformans. A heterorresistência fornece uma tolerância temporária durante o tratamento com azóis, por aneuploidia cromossômica e formação de heterocromatina. O biofilme protege a população criptocócica de vários estresses, incluindo tratamento antifúngico. Os fenótipos de dormência e VBNC permitem que C. neoformans sobreviva no hospedeiro por anos durante a latência. Por fim, as células persistentes antifúngicas (AFPC) ajudam C. neoformans a tolerar quantidades muito altas de antifungicos que, de outra forma, seriam letais. O VBNCrypto visa entender as vantagens que os fenótipos VBNC e AFPC fornecem à população de leveduras durante as interações Cryptococcus-sistema imunológico e a progressão da doença no hospedeiro. Projeto Internacional com o Instituto Pasteur (França) - ANR x FAPESP.

The Medical Research Council Centre for Medical Mycology (MRC CMM) is one of the world's largest Centres that studies medically important fungi, currently representing roughly 25 of UK scientists working in medical mycology. Our aim is to facilitate research and training, particularly in those areas of the world where fungal infections cause a huge burden on human health. We propose to establish the CMM South American Unit (CMM SAMERICA) to be located in São Paulo state, Brazil. The MRC CMM Principal Investigators (PIs) bring a unique breadth of expertise and interdisciplinarity that drives an integrated research programme comprised of fundamental molecular mycology, infection biology, fungal immunology and clinical mycology. This wide-ranging expertise enables the development of unique synergies, facilitating the simultaneous analysis of both the host and pathogen to determine their individual contributions to the pathogenesis of disease, and the translation of this fundamental science to the clinic. This expertise will be complemented by that of Brazilian medical mycologists studying local endemic fungal disease. In August 2017, the MRC CMM established the CMM AFRICA Unit at the University of Cape Town (UCT), South Africa. UCT is the leading university on the African continent and the CMM AFRICA Unit is based within the Institute of Infectious Disease and Molecular Medicine (IDM). The objectives of the CMM AFRICA Unit are to facilitate research and promote training in medical mycology in South Africa, and across the African continent. Similarly, the new CMM SAMERICA Unit will exploit local and UK-based funding streams to build capacity and increase knowledge in medical mycology in Brazil, and throughout South America.

Programa Fiocruz-Pasteur-USP 2022.

Projeto internacional: convênio entre FAPESP e Universidad de Antioquia/Colômbia.Coordenador Brasil: Carlos Pelleschi TabordaCoordenador Colômbia: Ángel González MarínEstudo visa avaliar e caracterizar, em nível funcional, genes relacionados à sobrevivência e replicação intracelular do patógeno fúngico Histoplasma capsulatum por meio do sistema de edição CRISPR-Cas9 e utilizando modelos in vitro e in vivo.

O grupo das micoses sistêmicas, que inclui a paracoccidioidomicose (PCM), criptococose e histoplasmose, entre outras, foi causa de óbito em 3.583 indivíduos entre 1996-2006 no Brasil. Destas, a PCM foi a mais importante com aproximadamente 51,2% dos casos, seguida pela histoplasmose com 4,8%, em pacientes não portadores do HIV. Ao considerar a AIDS como a causa básica de mortes e as micoses sistêmicas endêmicas como condições associadas, a histoplasmose aparece com 10,1 % e a PCM com 1,4%. A utilização de drogas antifúngicas é a melhor ferramenta atualmente disponível para o tratamento destas infecções. Entretanto, os pacientes são geralmente submetidos a longos períodos de tratamento, e recidivas e sequelas são freqüentes. Modelos vacinais desenvolvidos contra aspergilose, candidíase, criptococose, coccidioidomicose e histoplasmose foram descritos, no entanto, ainda não existe uma vacina que demonstra uma boa eficácia. Em relação a PCM, nosso grupo tem trabalhado no desenvolvimento de uma vacina peptídica (P10), originária de uma fração da glicoproteína imunodominante gp43 de Paracoccidioides brasiliensis. Contudo, uma mutação no gene da gp43 presente em Paracoccidioides lutzii inviabiliza o uso do P10 no controle da infecção por esta espécie. O presente projeto abordará a prospeção de epitopos com potencial vacinal e o desenvolvimento de estratégias na presença e naausência das principais drogas antifúngicas. Desta forma são esperados avanços na formulação de estratégia vacinal contra P lutzii, além de consolidar nosso conhecimento acerca da imunopatogenia desta micose de importância em saúde pública de nosso país.

Coordenadora: Profa. Leila Maria Lopes Bezerra (UERJ)
Vice-coordenadora: Profa. Eliana Barreto Berger (UFRJ)
Membro do comitê gestor:Carlos Pelleschi Taborda (USP)
As infecções fúngicas, objeto desta proposta, são doenças negligenciadas e/ou emergentes no Brasil e nos demais países da América Latina. Dentre estas infecções serão focalizadas: Paracoccidioidomicose, Esporotricose, Cromoblastomicose, Histoplasmose e Scedosporiose/Mucormicose. Revendo o conceito de doenças negligenciadas, este aplica-se efetivamente para as infecções fúngicas (micoses) que, apesar da sua importância e emergência entre as doenças infecciosas, ainda hoje são subnotificadas e, portanto, subestimadas. Algumas destas micoses são doenças graves (ex: paracoccidioidomicose, histoplasmose) ou mesmo incapacitantes (ex: cromoblastomicose) variando desde infecções subcutâneas a infecções sistêmicas. Algumas destas micoses, prevalentes em regiões tropicais e sub-tropicais, atingem especialmente a população rural ou residentes em áreas de baixa condição sócio-econômica e/ou de precárias condições sanitárias. Existe uma enorme lacuna de informações relativa a este grupo de doenças, em especial, destacamos os protocolos de diagnóstico e alternativas de tratamento, o que gera uma carência de políticas de controle epidemiológico. Outrossim, o limitado espectro de drogas antifúngicas disponíveis e a crescente resistência a drogas de uso corrente são fatores que, associados à emergência de novas espécies patogênicas, devem ser considerados como fatores relevantes que justificam a criação de um novo INCT neste tema estratégico para o Brasil. Neste sentido, o INCT de ?Infecções Fúngicas Emergentes? tem como metas de curto prazo a identificação, para cada patologia, de padrões moleculares associados à virulência de espécies emergentes no Brasil e seus distintos genótipos, o mapeamento estrutural e molecular das principais moléculas identificadas e a avaliação de seu papel nos mecanismos de virulência ou na modulação da resposta imune do hospedeiro. A médio prazo, visamos selecionar moléculas com potencial vacinal e/ou com potencial para o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas, visando alternativas para o tratamento e controle das infecções fúngicas emergentes que serão abordadas neste INCT. Em paralelo, serão testadas novas drogas antifúngicas (peptídeos e produtos naturais) em modelos animais previamente estabelecidos. Para atingir estas metas serão utilizadas ferramentas moleculares como proteômica, genômica e transcriptômica, além de modelos ?in vitro? e ?in vivo? de interação fungo-hospedeiro. A rede de laboratórios e núcleos de pesquisa envolvidos na proposta deste novo INCT conta com plataformas multidisciplinares e a aplicação de tecnologias de ponta na fronteira da Microbiologia (Micologia Médica e Veterinária) e da Imunologia. Destacamos que contamos com a participação de 48 (quarenta e oito) pesquisadores, de 11 (onze) instituições brasileiras das regiões Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste, associados à formação de recursos humanos em 11 (onze) cursos de pós-graduação de excelência (níveis 7, 6 e 5), englobando a participação de jovens pesquisadores e 4 (quatro) cursos de pós-graduação novos ou em consolidação (níveis 3 e 4) que serão impactados positivamente por esta rede de pesquisa. Por fim, podemos salientar a forte cooperação internacional com a participação de instituições e pesquisadores dos EUA, Reino Unido, França, Holanda, Áustria, México e Venezuela.

O grupo das micoses sistêmicas, que inclui a paracoccidioidomicose (PCM), criptococose e histoplasmose, entre outras, foi causa de óbito em 3.583 indivíduos entre 1996-2006 no Brasil. Destas, a PCM foi a mais importante com aproximadamente 51,2% dos casos seguida pela histoplasmose com 4,8% em pacientes não portadores do HIV. Ao considerar a AIDS como a causa básica de mortes e as micoses sistêmicas endêmicas como condições associadas, a histoplasmose aparece com 10,1 % e a PCM com 1,4%. A utilização de drogas antifúngicas é a melhor ferramenta atualmente disponível para o tratamento destas infecções. Entretanto, os pacientes são geralmente submetidos a longos períodos de tratamento, e recidivas e sequelas são freqüentes. Modelos vacinais desenvolvidos contra aspergilose, candidíase, criptococose, coccidioidomicose e histoplasmose foram descritos, entanto, ainda não existe uma vacina eficaz. Em relação PCM, nosso grupo tem trabalhado no desenvolvimento de uma vacina peptídica (P10), originária de uma fração da glicoproteína imunodominante gp43 de Paracoccidioides brasiliensis. Contudo, uma mutação no gene da gp43 presente em Paracoccidioides lutzii inviabiliza o uso do P10 no controle da infecção por esta espécie. O presente projeto propõe várias abordagens para viabilizar uma estratégia de imunização na PCM: um núcleo de pesquisa terá ênfase no estudo de aspectos específicos da resposta imune, como o desempenho de neutrófilos, macrófagos, linfócitos TCD4+/CD8+, e células NK 1.1 no modelo experimental de infecção por leveduras e conídios das duas espécies de Paracoccidioides e vacinação com P10 profilática/terapêutica, em linhagens de camundongos com diferentes perfis de susceptibilidade. Um segundo subprojeto abordará o desenvolvimento de vacinas e imunização passiva com anticorpos, enfocando os efeitos citotóxicos e imuno-estimuladores do P10 em pacientes com PCM, a caracterização da atividade moduladora de células dendríticas de camundongos infectados com isolados virulentos de Paracoccidioides spp. na presença/ausência de drogas antifúngicas, avaliar o desempenho de antígenos e anticorpos contra P. lutzii com o objetivo de desenvolvimento de vacina, e identificar epitopo(s) para desenvolvimento de vacina a partir do antígeno M recombinante de Histoplasma capsulatum. O terceiro subprojeto será voltado para estudo da patogenicidade a partir da padronização de novos modelos experimentais alternativos de PCM (o lepidóptero Galleria Mellonela), em consonância com a demanda da sociedade civil pela diminuição do uso de modelos animais em experimentação. O 4º subprojeto abordará a influência do P10 na formação de biofilme em Paracoccidioides spp, uma vez que um dos maiores desafios na terapêutica de infecções fúngicas se deve à resistência aos antifúngicos que esta estrutura promove no parasita. Finalmente, a última abordagem será em relação ao papel do tabagismo como fator de patogenicidade no desenvolvimento da forma crônica da PCM, visto que virtualmente 100% dos pacientes com esta forma são tabagistas. Desta forma são esperados avanços na formulação de estratégia vacinal contra não só a PCM mas também histoplasmose, além de consolidar nosso conhecimento acerca da imunopatogenia destas micoses de importância em saúde pública de nosso país.

O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM). O antígeno imunodominante de P. brasiliensis é a glicoproteína gp43, que é reconhecida por aproximadamente 100% dos soros de pacientes com PCM, tornando-a uma importante ferramenta para o diagnóstico da doença. O peptídeo P10 é um dos epitopos da gp43, e estudos mostraram que este pode atuar como vacina contra a PCM em camundongos. Recentemente, a análise comparativa dos polimorfismos compartilhados entre isolados atípicos de P. brasiliensis, sugeriram a criação de uma nova espécie dentro do gênero, Paracoccidioides lutzii, que no Brasil é endêmico da regiões Norte e Centro-Oeste. O fato de isolados P. lutzii pertencerem a grupo filogenético distintos sugere que as abordagens para identificação do fungo, diagnóstico sorológico e desenvolvimento de vacinas baseados somente na gp43 e no seu epitopo imunoprotetor P10, podem não ser efetivas para todos os isolados. Recentemente, foi demonstrado que em isolados de P. lutzii, a região correspondente ao P10 de P. brasiliensis, apresenta importante mutação no core do peptídeo que praticamente extingue a capacidade protetora. Neste contexto, o presente projeto visa ampliar os estudos de caracterização de P. lutzii e identificar diferentes alvos para utilização no desenvolvimento de uma vacina terapêutica.

As micoses endêmicas apresentam distribuição geográfica definida e ocorrem onde as condições ambientais e fatores geo-climáticos propiciam a existência dos agentes na natureza. A paracoccidioidomicose (PCM) é uma infecção fúngica sistêmica, endêmica, sendo a mais prevalente na América Latina. O agente etiológico da PCM é o fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis que apresenta distribuição heterogênea e cujo habitat é o solo. A infecção se dá por inalação dos propágulos fúngicos causando lesões granulomatosas nos pulmões que podem se disseminar via hematogênica e/ou linfática. Apesar do expressivo avanço em diversas áreas do conhecimento, a micose descrita por Adolpho Lutz em 1908 ainda demonstra taxas elevadas de mortalidade e morbidade e baixa visibilidade, configurando-se como oitava causa de mortalidade por doença predominantemente crônica ou repetitiva, entre as doenças infecciosas e parasitárias. O diagnóstico da PCM é realizado por meio de exame direto a fresco e com corantes, exame histopatológico em biópsias dos tecidos afetados e cultivo com subsequente isolamento e identificação do fungo, incluindo a reversão da fase filamentosa a 25ºC para a leveduriforme a 37ºC. Entretanto, o crescimento desse fungo é lento, podendo demorar de 15 a 30 dias, e as reações sorológicas contribuem para o auxílio diagnóstico rápido, simples e de baixo custo, além de apresentar valor prognóstico e auxiliar no monitoramento da eficácia terapêutica. Em nosso meio é grande a diversidade de metodologias e antígenos empregados no diagnóstico sorológico da PCM, devido à ausência de kits comerciais disponíveis para esse fim. Sendo assim, cada laboratório desenvolveu sua própria metodologia que vem contribuindo muito ao auxílio diagnóstico dessa micose. Entretanto, as diferenças nos isolados utilizados, meios de cultura e tempo de cultivo podem resultar em resultados discrepantes. Este estudo tem como objetivo avaliar essa diversidade metodológica e verificar os resultados obtido

A maioria dos fungos causadores de micoses no homem e nos animais foram descritos no início do século XIX e até o presente momento, não existe uma estratégia 100% eficaz na prevenção. A utilização de drogas antifúngicas é a melhor ferramenta atualmente disponível, entretanto, os pacientes são submetidos a um longo período de tratamento e as recedivas são comuns. Modelos vacinais densenvolvidos contra candidíase, criptococose, coccidioidomicose, aspergillose e histoplasmose foram descritos, entanto, ainda não exista uma vacina eficaz. Em relação à paracoccidioidomicose (PCM), nosso grupo tem trabalhado no desenvolvimento de uma vacina peptídica (P10), originária de uma fração da proteína imunodominante gp43 do fungo Paracoccidioides brasiliensis (Pb). Os ensaios iniciais foram direcionados no modelo experimental murino utilizando-se a fase de levedura do fungo no momento da infecção. Nesse modelo, pode-se reduzir a carga fúngica nos pulmões, a disseminação do fungo e a prevenção de recidivas. A imunização com P10 gerou no hospedeiro uma resposta imunológica de memória que se reativa durante uma nova exposição ao fungo. A forma clínica mais comum da PCM é a crônica, que afeta de 80 a 90% dos pacientes, levando a formação de fibrose e diminuindo a função pulmonar dos doentes. A partir dos dados clínicos, resolvemos investigar a utilização do P10 no modelo vacinal em camundongos utilizando-se como inoculo o conidio fungico administrado pela via intranasal. Esse modelo simula a forma crônica semelhante àquela apresentada pelos pacientes e já foi descrito, com sucesso, por pesquisadores colombianos. A nossa proposta busca uma validação da vacina baseada no peptídeo P10 no modelo da PCM crônica induzida por conídios.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica, causada pelo fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis. Geograficamente, limita-se a América Latina com as áreas endêmicas estendendo desde o México até a Argentina, constituindo em uma das micoses profundas que mais predominam na região, afetando principalmente trabalhadores rurais. No período de 1996 a 2006 as micoses sistêmicas foram responsáveis 3.583 óbitos sendo a paracoccidioidomicose citada em aproximadamente 51.2% dos óbitos registrados neste período, ocupando a 10º posição entre as doenças infecto-parasitárias com alta mortalidade. Na tentativa de se idenficar os epítopos peptídicos envolvidos na reatividade imunológica, bem como as seqüências que são importantes na fisiopatologia do fungo, o gene da gp43 foi clonado, seqüenciado e expresso. Um trecho específico da gp43, que possui 15 aminoácidos (denominado de P10) é reconhecido pelos linfócitos T. Camundongos de linhagens isogênicas, nos quais foi injetado o P10, desenvolveram uma infecção pulmonar 200 vezes menos intensa que os animais-controle, não-imunizado. As células dendríticas têm sido utilizadas em protocolos vacinais contra várias doenças infecciosas. A eficácia das células dendríticas, como iniciadoras de resposta imune, também é alvo de estudos. Nos últimos 15 anos, células dendríticas têm aumentado o interesse dos cientistas e médicos, pois essas são importantes adjuvantes para vacinas que previnem infecções microbianas e para o tratamento do câncer. E hoje em dia, entender como manipular células dendríticas pode ser considerado um instrumento essencial no progresso de pesquisa com vacinas.

A incidência de micoses sistêmicas e oportunistas vem aumentando progressivamente e está associada ao aparecimento de isolados resistentes aos antifúngicos e principalmente em indivíduos imunosuprimidos. Fungos antes considerados de baixa capacidade de invasão e colonização como por exemplo o gênero Scedosporium, atualmente encontra-se incluído na classificação de fungos emergentes. A dificuldade no tratamento destas infecções levou, nas últimas décadas, a uma intensa busca sobre os mecanismos de patogênese utilizados por fungos. O reconhecimento do fungo pela célula hospedeira parece ser um processo multifatorial com a participação de vários grupamentos celulares e a interação destes grupamentos com os seus ligantes/receptores na célula hospedeira. A parede celular é de importância vital para a célula fúngica, determinando a sua forma, protegendo-a contra danos mecânicos e funcionando como uma barreira filtrante para moléculas. Apresenta na sua porção mais externa, moléculas glicosiladas que estão envolvidas em importantes funções biológicas relacionadas com a patogenicidade e virulência, além de ser uma fonte significante de antígenos. Este projeto tem como objetivos purificar e caracterizar bioquimicamente glicoconjugados presentes na parede de fungos assim como verificar função na resposta imune celular e humoral.

Projeto: VACINAS CONTRA PARACOCCIDIOIDOMICOSE: MODELO EXPERIMENTAL UTILIZANDO CAMUNDONGOS BALB/c PROTEGIDOS POR VETORES DE EXPRESSÃO CONTENDO SEQUÊNCIAS PARA P10, HSP60 E IL-12
Objetivos:
1- Construção de vetores com potencial de proteção contra PCM (Paracoccidioidomicose) a partir de sequências contidas no P. brasiliensis, peptídeo P10 e HSP60, e de interleucina-12 de camundongo.
2- Padronização de número de dosagens e concentração de vetor que proporcionem proteção adequada contra a PCM, sem causar efeitos inflamatórios indesejáveis aos animais imunizados.
3- Determinação de conjunto de vetores que, atuando conjuntamente, sejam mais eficazes, quando comparados ao nível de proteção obtida por um vetor isolado.

Título: Âncora de GPI na paracoccidioidomicose: função biológica na patogenecidade do fungo.
Objetivos:
1- Produzir anticorpos monoclonais contra âncoras GPI de P. brasiliensis
2-Avaliar a função das âncoras GPI na patogenicidade

Projeto: Mecanismo de ação dos anticorpos na paracoccidioidimicose
Objetivos:
1-Produzir anticorpos monoclonais, direcionados especificamente contra antígenos de superfície.
2-Investigar a associação dos anticorpos na proteção ou na exacerbação da PCM através da imunização passiva de camundongos susceptíveis e resistentes a PCM.
4-Analisar "in vivo" a capacidade dos anticorpos em reduzir ou aumentar a carga fúngica em camundongos infectados por diferentes vias (intravenoso, intratraqueal e intraperitoneal).
5-Estudar o impacto na relação entre dose de anticorpos x carga fúngica.
6-Verificar a função dos anticorpos durante a fagocitose mediada por macrófagos peritoneais e alveolares e determinar o envolvimento dos anticorpos na ativação de mecanismos intracelulares para destruição do fungo.
7-Correlacionar os anticorpos com a resposta imune celular, através da análise do recrutamento de células ao foco infeccioso na presença e na ausência de anticorpos, assim como na ativação das mesmas (produção de citocinas e quimiocinas).