Maria Regina D'Imperio Lima.

O objetivo geral deste projeto é investigar se o uso de dieta cetogênica contribui para o agravamento da COVID-19 e, em caso afirmativo, avaliar o efeito de tratamentos que reduzam o dano tecidual e o infiltrado neutrofílico a fim de melhorar a evolução clínica da doença

A compreensão dos mecanismos imunes do hospedeiro durante a infecção pelo Plasmodium é essencial para melhorar a prevenção da malária. Em regiões endêmicas, uma mesma pessoa pode ser infectada simultaneamente por diferentes espécies ou cepas de uma mesma espécie de Plasmodium, um fenômeno chamado superinfecção. Crianças mais novas semi-imunes podem se proteger contra a superinfecção. Foi descrito na malária experimental murina que a presença de parasitos na fase sanguínea do ciclo pode inibir o desenvolvimento de uma infecção secundária da fase hepática. Essa proteção é dependente da parasitemia e do hormônio regulador do ferro, a hepcidina. Os níveis de hepcidina aumentam no fígado durante a fase sanguínea da malária causada por Plasmodium chabaudi ou Plasmodium berghei. Esse aumento leva a uma diminuição da disponibilidade de ferro nos hepaócitos, inibindo o desenvolvimento das formas hepáticas do P. berghei. Além disso, a infecção da fase sanguínea causa intensa inflamação e necrose no fígado, o que pode proteger contra uma infecção subsequente de esporozoítos. Nós mostramos recentemente que a IL-1alfa é produzida em altos níveis no fígado durante a infecção sanguínea do P.chabaudi e que essa citocina é essencial para o recrutamento inflamatório de células, produção de citocinas pró-inflamatórias e desenvolvimento de necrose hepática. O objetivo do presente projeto é avaliar a influência que a IL-1 alfa produzida no fígado durante a infecção da fase sanguínea do Plasmodium pode ter em uma infecção secundária da fase hepática e o seu papel na proteção contra a superinfecção.

As células mortas em decorrência do dano tecidual são rapidamente fagocitadas, mas antes de desaparecerem, alertam as células ao redor para que sejam ativados os programas de reparo. O reconhecimento pelo sistema imune inato do dano celular contribui para o desenvolvimento de processos inflamatórios e respostas imunes de reparo tecidual, mas também pode determinar o agravamento das lesões nos tecidos danificados. Em alguns casos, a morte celular descontrolada pode desencadear um processo destrutivo em cascata que acaba por amplificar as lesões teciduais e piorar o prognóstico da doença. O objetivo geral deste projeto é caracterizar os receptores de sinais de dano celular que estão envolvidos na progressão das formas graves de malária e tuberculose experimentais, visando interferir nestas vias de sinalização a fim de melhorar o prognóstico das doenças. Estas doenças infecciosas encontram-se entre as mais prevalentes na espécie humana, sendo conjuntamente responsáveis por mais de 1 milhão de mortes anuais mundialmente. Pretende-se ainda avaliar a importância dos sinais de dano no desenvolvimento da resposta imune adquirida durante estas doenças infecciosas. Este estudo pode trazer um conhecimento essencial para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas que possam ser aplicadas, em conjunto com aquelas já utilizadas, no tratamento das formas graves de malária e tuberculose, assim como de outras doenças infecciosas ou não que se caracterizam por lesões teciduais extensas. Além disso, este estudo pode desvendar novos mecanismos moleculares envolvidos no reconhecimento de dano celular e, consequentemente, ampliar a compreensão e as perspectivas de intervenção relativas a esses processos.

Estabelecer uma cooperação internacional para estudar por microscopia intravital a resposta imune no baço e no fígado de camundongos infectados com o plasmódio.

Introdução: A ativação exacerbada do sistema imune durante a fase eritrocítica do ciclo do plasmódio é responsável pelas diversas síndromes associadas à doença, tais como a anemia, a malária cerebral, a acidose metabólica e o choque sistêmico. Algumas moléculas liberadas por células danificadas, tais como o ATP e o ácido úrico, são detectadas por células do sistema imune. Esses sinais de dano participam da ativação do sistema imune, mas também promovem a regulação da inflamação após o trauma ou injúrias ocasionadas pelos patógenos. Os receptores purinérgicos da família P2X (P2X1-7R) na superfície de células do sistema imune detectam o ATP extracelular (eATP). A ligação do eATP ao P2X7R induz a ativação do inflamossoma em macrófagos e consequente produção de citocinas pró-inflamatórias e a morte celular. O P2X1R e o P2X4R estão localizados nas sinapses imunes e contribuem para a ativação de linfócitos T. Por outro lado, as células T reguladoras (Treg), possuem ecto-ATPases na superfície que clivam o eATP e, assim, regulam o sistema imune. Na malária, o ATP é liberado no momento da ruptura dos eritrócitos infectados e na ativação de linfócitos T.
Enunciado do problema: Pouco se conhece a respeito do envolvimento da sinalização purinérgica na patogenia e no desenvolvimento da resposta imune durante a malária.
Estratégia experimental: Seis abordagens complementares serão utilizadas visando esclarecer esse problema no modelo experimental de malária aguda e crônica pelo P. chabaudi AS: 1) Quantificar a expressão de receptores purinérgicos no baço, no fígado, nos rins e nos pulmões. 2) Analisar in vitro a participação da sinalização purinérgica na ativação e na morte de células do sistema imune induzidas pela infecção, utilizando inibidores específicos e camundongos deficientes em P2X7R (P2X7R-/-). 3) Avaliar o papel dos receptores purinérgicos na atividade de células Treg do baço de camundongos infectados. 4) Determinar os efeitos da inibição in vivo de receptores P2X ou da ausência de P2X7R, em relação às manifestações clínicas da doença, ao desenvolvimento da resposta imune e à proteção. 5) Comparar a resposta imune e o desenvolvimento da doença em camundongos quimeras para células da medula óssea. 6) Analisar por microscopia intra-vital a movimentação das células esplênicas em camundongos tratados com inibidores de P2X7R.
Resultados esperados: Determinar quais são os receptores P2X envolvidos na patogenia e na resposta imune contra a malária
Contribuição esperada para a área: Fornecer o arcabouço teórico que permita avaliar a possibilidade do uso de medicamentos capazes de inibir especificamente os receptores purinérgicos envolvidos na malária, com a finalidade de conferir proteção contra os sintomas da doença que decorrem da resposta imune exacerbada à infecção pelo plasmódio.
Apoios existentes: Esse estudo é plenamente condizente com os trabalhos que vêm sendo desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa com o apoio da FAPESP (bolsas de mestrado e doutorado) e do CNPq (bolsa de produtividade e auxílio Edital Universal).

A tuberculose permanece sendo um problema emergente de saúde pública. Um terço da população mundial está infectado por Mycobaterium tuberculosis (Mtb) e 10% destes indivíduos desenvolvem a doença. O Brasil é o 14º país em termos de notificações de tuberculose com prevalência de 60 casos por 100.000 habitantes em 2007. A tuberculose bovina é uma zoonose de caráter infecto-contagiosa causada pelo Mycobacterium bovis (Mbv). A incidência de infecções causadas por Mbv e a patogenicidade dos isolados no gado brasileiro ainda são pouco estudadas. O fato do homem também ser suscetível ao Mbv aumenta o interesse por esta doença, em que a infecção ocorre pelo consumo de produtos contaminados de origem animal. A transmissão do bacilo de Mbv entre humanos também é observada no caso de infecção disseminada e resulta em patologia pulmonar. Assim, a avaliação da virulência de isolados de Mbv no Brasil é de grande importância. Tendo em vista estas considerações, pretendemos estabelecer um modelo animal satisfatório para o screening da virulência e da capacidade imunomoduladora de cepas patogênicas de Mbv em hospedeiros imunocompetentes e imunocomprometidos. O presente projeto pretende: 1) avaliar o grau de virulência dos isolados clínicos de Mbv (B2 e MP287/03), segundo a capacidade de crescimento in vivo e in vitro e a severidade da doença em camundongos infectados, através da análise de cortes histológicos de pulmão, baço e fígado e da taxa de sobrevivência; 2) verificar a resposta imune contra estes isolados patogênicos de Mbv, através da quantificação de moléculas pró- e anti-inflamatórias utilizado a técnica de RT PCR em tempo real; e 3) analisar os mecanismos de evasão destes isolados patogênicos em macrófagos infectados.

Introdução: A tuberculose permanece sendo um problema importante de saúde pública. Um terço da população mundial está infectado com micobactérias pertencentes ao complexo Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis Mtb e Mycobacterium bovis - Mbv) e 10 destes indivíduos deverão desenvolver a doença ao longo de suas vidas. Mutações gênicas são responsáveis pelo aumento da virulência dessas micobactérias e/ou pela resistência aos quimioterápicos utilizados no tratamento da tuberculose. Tem sido descrito que a Mtb induze a resposta inflamatória via ativação dos inflamassomas, culminando na secreção de IL-1#946;. Camundongos deficientes em IL-1#946;, IL-1#946;R ou caspase-1 infectados com Mtb apresentam alta mortalidade comparados aos animais selvagens, sugerindo que a IL-1#946;, produzida em grande parte através da ativação dos inflamassomas, é importante para a sobrevivência do hospedeiro. No entanto, a maioria destes estudos foram realizados com a linhagem virulenta H37Rv Mtb, que é considerada referência para o estudo da tuberculose mas não reflete a diversidade destes microrganismos na natureza. Enunciado do problema: Em estudo prévio, observamos que os camundongos C57BL/6 infectados com isolados micobacterianos hipervirulentos se comportam de maneira polar em relação à capacidade de modular a resposta imune. Em alguns casos (i.e. MP287/03 Mbv), há uma ativação deficiente da resposta imune com baixas produções de mediadores pró-inflamatórios IL-1#946;, IL-6, IL-17, TNF-#945;, IFN-#947; e óxido nítrico e alta produção da citocina reguladora IL-10 por células infiltradas nos pulmões. Em outros casos (i.e. Beijing 1471 Mtb), ocorre uma produção exacerbada de mediadores pró-inflamatórios, que parece contribuir para retardar a morte dos camundongos. Verificamos ainda que o perfil da resposta imune in vivo correlaciona diretamente com o nível de produção de IL-1#946; por macrófagos in vitro, sugerindo que essas bactérias ativam os inflamassomas de forma diferente.Estratégia experimental: Tendo em vista estas considerações, pretendemos investigar o papel dos inflamassomas na patogenia da tuberculose causada por isolados clínicos hipervirulentos (MP287/03 Mbv e Beijing 1471 Mtb), em comparação com a linhagem referência de virulência H37Rv Mtb. Utilizando camundongos C57BL/6 e deficientes em PYCARD/ASC, caspase-1, NLRP3, NLRC4 e P2X7, avaliaremos: 1) O envolvimento dos inflamassomas na ativação e morte de macrófagos infectados; 2) O impacto da sinalização dos inflamassomas na proteção e na patogenia da doença; 3) O papel da ativação dos inflamassomas no desenvolvimento da resposta imune adquirida; 4) A participação do receptor purinérgico P2X7 na ativação dos inflamassomas e em suas consequências.Resultados esperados: Determinar como as micobactérias hipervirulentas modulam diferentemente a ativação dos inflamassomas e, consequentemente, a produção de mediadores pró-inflamatórios. Contribuição esperada para a área: Fornecer o arcabouço teórico para compreender os mecanismos envolvidos na patogenicidade dos isolados hipervirulentos de micobactérias, abrindo a possibilidade para que no futuro possamos alterar o curso das formas graves de tuberculose.Apoios existentes: Esse estudo é plenamente condizente com os trabalhos que vêm sendo desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa com o apoio da FAPESP (bolsas de mestrado, doutorado e pós-doutorado), do CNPq (bolsas de produtividade e pós-doutorado), CAPES (bolsa de pós-doutorado) e da USP (núcleo de apoio à pesquisa).

Estima-se que a malária seja responsável por um milhão de mortes anuais, atingindo principalmente crianças. A complexidade do ciclo de vida do plasmódio, o agente causador da malária, vem criando inúmeros desafios aos pesquisadores que estudam os aspectos imunológicos associados, tanto ao desenvolvimento da doença, como à geração de imunidade. Assim, este projeto tem como objetivo avaliar os mecanismos envolvidos na resposta imune esplênica aguda (ativação policlonal dos linfócitos T e B) e tardia (resposta imune específica), durante a infecção pelo Plasmodium chabaudi. A escolha desse modelo murino de malária justifica-se face à sua semelhança com a doença humana causada pelo Plasmodium falciparum, a espécie responsável pela maioria das mortes. O projeto divide-se em cinco sub-projetos associados a duas teses de mestrado, três teses de doutorado e um trabalho de pós-doutorado, que se encontram em andamento junto ao Programa de Pós-Graduação em Imunologia da Universidade de São Paulo (nota 7 na avaliação da CAPES). Estes sub-projetos visam: 1) Estudar a participação das citocinas IL-2 e IL-7 na ativação policlonal dos linfócitos T e B esplênicos e na geração da resposta específica. 2) Avaliar a participação dos linfócitos T CD4+ convencionais e não convencionais na resposta aguda à infecção. 3) Avaliar a participação do ATP e dos receptores P2X7 na resposta imune ao P. chabaudi. 4) Avaliar o papel dos linfócitos T na ativação policlonal dos linfócitos B esplênicos. 5) Caracterizar e otimizar a resposta imune e a proteção contra a re-infecção utilizando anticorpos recombinantes que direcionam o antígeno para células dendríticas. Os objetivos propostos nos sub-projetos são plenamente condizentes com os trabalhos anteriores desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa.

A maioria dos trabalhos de vacinação com antígenos de fase eritrocítica em malária tem utilizado moléculas localizadas na superfície do próprio parasita (MSP1 e AMA1) e, em conseqüência, estão em contato com o sistema imune do hospedeiro apenas durante um breve período de tempo, isto é, do instante em que o parasita é liberado na corrente sanguínea até o momento em que ele consegue infectar uma nova célula. Em vista disso, torna-se necessária uma grande quantidade de anticorpos específicos para que a neutralização e a fagocitose do parasita ocorram antes da invasão de uma nova célula. Por outro lado, os antígenos presentes na superfície dos eritrócitos infectados podem ser expressos horas antes da saída do parasita da célula, o que permitiria a sua exposição ao sistema imune por um período maior de tempo. No ano de 2004, Florens e colaboradores realizaram uma abordagem proteômica a fim de caracterizar as proteínas do P. falciparum que possivelmente estariam expressas na superfície do eritrócito infectado. Neste trabalho foram descritas 32 proteínas que, em princípio, poderiam ser exportadas para a superfície do eritrócito, permanecendo em contato direto com o sistema imune. Porém, até o momento, não foram realizados trabalhos destinados a caracterizar a possível capacidade protetora destes antígenos quando utilizados como alvos para vacinas. Assim, as moléculas descritas por Florens e colaboradores, que são codificados por genes de cópia única no genoma, representam uma possibilidade interessante como candidatas à vacina contra a malária, quando comparadas aos antígenos variáveis também presentes na superfície dos eritrócitos infectados (PfEPM1, RIFFIN). Como estes antígenos poderiam ser expressos algumas horas antes da ruptura da célula infectada, em teoria uma quantidade menor de anticorpos poderia ser necessária para o reconhecimento destas moléculas, o que facilitaria a retirada dos eritrócitos infectados da circulação. O fato de que, até o momento, estas moléculas não tenham sido identificadas como os principais alvos de ação do sistema imune, não descarta a possibilidade de que a otimização da resposta contra elas venha a contribuir para o controle dos parasitas ou para a melhora dos sintomas associados à doença O objetivo geral do projeto está relacionado com a busca de novos alvos para as vacinas, utilizando antígenos expressos na membrana de eritrócitos infectados pelo plasmódio que foram identificados por abordagens posgenômicas. Assim, pretende-se abordar os seguintes objetivos específicos: (1) Utilização de ferramentas de bioinformática para a procura de genes hortólogos em P. chabaudi correspondentes aos antígenos expressos na superfície dos eritrócitos infectados por P. falciparum. (2) Utilização de abordagens proteômicas para a caracterização de novas proteínas expressas na superfície dos eritrócitos infectados. (3) Construção de vacinas de DNA utilizando diferentes plasmídeos para a imunização de camundongos que serão desafiados com uma cepa letal de P. chabaudi. (4) Teste de diferentes protocolos de imunização utilizando tanto vacinas de DNA quanto proteínas recombinantes das diferentes proteínas estudadas. (5) Avaliação dos mecanismos efetores do sistema imune gerados durante o processo de imunização. (6) Estudos epidemiológicos de reconhecimento dos antígenos.

Estima-se que a malária seja responsável por 1 milhão de mortes anuais, atingindo principalmente crianças. A complexidade do ciclo de vida do plasmódio, o agente causador da malária, vem criando inúmeros desafios aos pesquisadores que estudam os aspectos imunológicos associados, tanto ao desenvolvimento da doença, como à geração de imunidade. Assim, este projeto tem como objetivo avaliar os mecanismos envolvidos na resposta imune esplênica aguda (ativação policlonal dos linfócitos T e B) e tardia (resposta imune específica), durante a infecção pelo Plasmodium chabaudi. A escolha desse modelo murino de malária justifica-se face à sua semelhança com a doença humana causada pelo P. falciparum, a espécie responsável pela maioria das mortes. O projeto divide-se em três sub-projetos associados a três teses de doutorado, uma tese de mestrado e um trabalho de pós-doutorado, que se encontram em andamento junto ao Programa de Pós-Graduação em Imunologia da Universidade de São Paulo (nota 7 na avaliação da CAPES). Estes sub-projetos visam: 1) Estudar a participação dos linfócitos T CD4+CD25+ na ativação policlonal dos linfócitos T e B esplênicos. 2) Avaliar o papel do IFN-γ e dos receptores do tipo Toll na ativação policlonal dos linfócitos B esplênicos. 3) Caracterizar e otimizar a resposta imune de memória e a proteção contra a re-infecção. Os objetivos propostos nos sub-projetos são plenamente condizentes com os trabalhos anteriores desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa.

O presente estudo tem como objetivo central estudar a regulação autócrina dos macrófagos e células dendríticas por citocinas, assim como a influência desta regulação no controle de infecções. No decorrer deste trabalho pretende-se avaliar:
(1)	OS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA POLARIZAÇÃO M1/M2 MEDIADA PELA IL-12 EM MACRÓFAGOS E/OU CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADOS DA MEDULA ÓSSEA. 
(2)	O PAPEL DO TGF-β1 NA MANUTENÇÃO DO PERFIL M2 DOS MACRÓFAGOS IL-12P40KO PERITONEAIS. 
(3)	A MODULAÇÃO DO PADRÃO DE ATIVAÇÃO DOS MACRÓFAGOS IN VIVO PELO TRATAMENTO COM rIL-12. 
(4)	A MODULAÇÃO DO PADRÃO DE ATIVAÇÃO DOS MACRÓFAGOS IN VIVO PELO TRATAMENTO COM ANTI-TGF-β E INDOMETACINA. 
(5)	A IMPORTÂNCIA DO IL-10, IFN-γ E IL-4 NA REGULAÇÃO AUTÓCRINA DE MACRÓFAGOS E/OU CÉLULAS DEDRÍTICAS

O presente estudo tem como objetivo central estudar, no modelo de infecção pelo P. c. chabaudi, a participação dos macrófagos esplênicos na eliminação de eritrócitos infectados. Será avaliada: (a) a participação do TNF-α no recrutamento de monócitos/macrófagos para o baço; (b) o papel do IFN-γ e da IL-10 na ativação dos macrófagos esplênicos; (c) a cinética da produção de quimiocinas pelas células esplênicas; (d) a participação dos macrófagos esplênicos na eliminação de eritrócitos infectados mediada por anticorpos citofílicos (IgG2a) e não citofílicos (IgG1).