Hamilton Cabral.

A formação sólida e completa de profissionais, das mais diversas áreas do conhecimento, depende das competências desenvolvidas no que tange o ensino, a pesquisa e a extensão - habilidades tão almejadas pela Universidade de São Paulo, - que é reconhecida nacional e internacionalmente pela sua excelência. Nesse sentido o objetivo de nosso curso de inverno é complementar a formação e a atualização dos alunos, de modo teórico e prático, em assuntos relacionados às diversas áreas englobadas pela Tecnologia Enzimática. Entre os assuntos abordados sobre a atual conjuntura da Tecnologia Enzimática teremos a bioprospecção de microrganismos produtores de enzimas com potencial biotecnológico, estudos da produção de enzimas utilizando ferramentas moleculares e proteômicas, utilização de enzimas microbianas para a obtenção de peptídeos bioativos e outras moléculas com atividades biológicas.

Desde a antiguidade, microrganismos têm sido amplamente utilizados na obtenção de diversos produtos de interesse humano. Com os avanços tecnológicos, os bioprocessos fermentativos tornaram-se essenciais para a produção em larga escala de metabólitos, incluindo proteínas e enzimas. Entre essas enzimas, as proteases desempenham papéis cruciais em processos fisiológicos e industriais, sendo que um grupo específico delas, as colagenases, apresenta uma série de aplicações devido à sua capacidade de degradar o colágeno, especialmente na área da saúde, onde são utilizadas no desbridamento enzimático de feridas crônicas. Atualmente, Clostridium sp. é a principal fonte de colagenase para aplicação industrial, no entanto, a natureza patogênica e anaeróbica deste microrganismo limita a aplicação da enzima. Assim, existe uma demanda crescente por fontes alternativas de microrganismos não patogênicos ou por métodos recombinantes que possibilitem a produção segura e econômica dessa enzima. Nesse contexto, o fungo Purpureocilium lilacinum, encontrado em ambiente de matéria orgânica em decomposição, apresenta um potencial inexplorado para a produção de colagenases e outras hidrolases. Estudo do nosso grupo de pesquisa com o fungo selvagem identificou o potencial duas proteases secretadas com atividade colagenolítica. Com a realização do estudo transcriptômico, também realizado pelo nosso grupo de pesquisa que identificou uma serino protease da subfamília S8, que com base em análises in silico, demonstra potencial colagenolítico. Além das aplicações conhecidas das colagenases, a hidrólise do colágeno pode ser explorada para a obtenção de peptídeos bioativos, sendo empregado em diversos setores. Dessa forma, o estudo e a aplicação de protease colagenolítica emergem como áreas promissoras na biotecnologia e na medicina regenerativa. Sendo assim, o objetivo deste projeto é obter a serino protease S8 recombinante, purificar, caracterizar e desenvolver uma pomada com propriedades cicatrizantes, formulada a partir de uma colagenase recombinante, além de avaliar as atividades biológicas dos peptídeos obtidos pela ação da enzima sobre o colágeno e gelatina devido aos possíveis seus potenciais para aplicações biotecnológicas.

As perspectivas na utilização de enzimas microbianas industriais têm aumentado consideravelmente no século 21, com tendência de aumento à medida que as novas enzimas apresentem potencial significativo para atender as necessidades de diversos setores industriais. Enzimas de origem microbiana, além de robustas tem potencial significativo na gestão de resíduos e consequentemente, no desenvolvimento do meio ambiente mais seguro. O mercado de enzimas deverá atingir o valor de US$ 14,7 bilhões em 2025, registrando uma taxa de crescimento anual composta de 6,7 em termos de valores. Peptidases microbianas constituem o principal grupo de enzimas usadas industrialmente, responsável por cerca de 2/3 do total de enzimas comercializados. O estudo de peptidase fúngica é um tema relevante a nível mundial, pois envolvem estudos fisiológicos que auxiliam no entendimento de como alguns fungos patogênicos interagem com os hospedeiros, no campo da biotecnologia, com o emprego de enzimas de fungos filamentosos em diversos setores industriais. Atualmente as enzimas fúngicas são as mais utilizadas, por exemplo, na indústria de alimentos, farmacêutica, biocombustíveis entre outras. A importância na determinação da especificidade de peptidases, ou seja, o mapeamento dos subsítios, auxilia no desenho racional de inibidores, possibilita a determinação da clivagem em proteínas e na obtenção de peptídeos com atividade biológica. Atualmente os peptídeos são considerados como nova classe de medicamentos que está despontando, no ano de 2017 o mercado global de proteínas e peptídeos bioativos foi avaliado em US$88,3 bilhões, com uma taxa de crescimento anual composta no período de 2020 a 2027 de 8,2. O presente projeto tem por objetivo realizar a clonagem dos genes que codificam a treonino e ômega peptidases de fungos filamentosos no sistema de expressão em Pichia pastoris. Devido à necessidade de maior conhecimento desta subclasse das hidrolases, além do potencial de aplicação biotecnológica, por tratar-se de um projeto envolvendo a clonagem e expressão de novas enzimas que possuem amplas aplicações em diversas áreas, este projeto apresenta grande potencial de novos pedidos de patentes, além dos artigos científicos que serão produzidos com os resultados obtidos, além da possibilidade do descobrimento de peptídeos com atividade biológica de importância médica.

Os microrganismos são favorecidos como fontes de enzimas industriais devido à fácil disponibilidade, e à taxa de crescimento rápido. Alterações genéticas utilizando a tecnologia de DNA recombinante podem ser facilmente realizadas em células microbianas para elevar a produção da enzima, e o desenvolvimento científico. A produção industrial de enzimas é uma área da Biotecnologia em expansão, que movimenta bilhões de dólares anualmente e com crescente número de patentes e artigos científicos publicados. Alguns fungos filamentosos têm sido usados na indústria de processamento de alimentos por muitas décadas. O potencial industrial destes microrganismos e sua biodiversidade estimulam pesquisas para o desenvolvimento de processos de fermentação em larga escala, purificação de enzimas e métodos de melhoramento de linhagens, contribuindo para um aumento da utilização de fungos na indústria. Peptidases possuem uma difícil classificação, isso ocorre devido á sua grande diversidade estrutural e de ação. A seleção dos fungos e enzimas deste projeto justifica-se pela possibilidade de realizar estudos comparativos estruturais e funcionais entre as diferentes subclasses de peptidases, e pelas relevantes propriedades bioquímicas exibidas por estas enzimas, já realizadas com as linhagens selvagens, devido à importância destas enzimas em processo fisiológico. Sabe-se pouco sobre a estrutura de peptidases de microrganismos, em especial fungo filamentosos, sendo que alguns estão envolvidos em potencial patogênico a seres humanos e plantas de interesse comercial, e as peptidases são enzimas envolvidas nos processos patológicos. O presente projeto tem como objetivo realizar a clonagem de genes que codificam peptidases de fungos filamentosos no sistema de expressão em Pichia pastoris, devido à necessidade de maior conhecimento desta subclasse das hidrolases, pois pouco se sabe a estrutura tridimensional destas enzimas de origem fúngicas, além do potencial de aplicação biotecnológica. Por tratar-se de um projeto envolvendo a clonagem e expressão de novas enzimas que possuem amplas aplicações em diversas áreas, este projeto apresenta grande potencial de novos pedidos de patentes, além dos artigos científicos que serão produzidos com os resultados obtidos.

O proteoma é o conjunto de proteínas codificadas pelo genoma, permitindo entender como as células se adaptam às diferentes condições ambientais, além de oferecer informações importantes sobre as possíveis modificações pós-traducionais. Os estudos proteômicos têm se tornado uma excelente ferramenta para explorar, descobrir e identificar as proteínas expressas em resposta ao estresse ambiental, tais como, fonte de carbono, temperatura e pH, pois estes parâmetros afetam a produção de enzimas microbianas. A compreensão dos mecanismos de produção e secreção de proteínas pode ser auxiliada pela proteômica e a elucidação dessas etapas pode melhorar os resultados obtidos em bioprocessos. O presente projeto pretende dar continuidade a vários subprojetos que envolvem a linha de pesquisa em prospecção de enzimas hidrolíticas de origem microbiana. As enzimas que serão alvos desta investigação são as proteases, carboidrases e lipases. O objetivo deste projeto é a avaliação do potencial de fungos filamentosos meso e termofílicos em produzir enzimas quando expostos aos fatores físicos e químicos. O estudo do potencial bioquímico de expressão proteica de cada fungo será avaliado por diferentes fatores, tais como, fonte de carbono e nitrogênio, efeito da temperatura e pH entre outros. As análises serão realizadas por géis 1 e 2D, e os spots diferentes do meio padrão serão removidos e realizada a digestão por tripsina, em seguida submetido os fragmentos no espectrômetro de massas para obtenção das sequências, as quais serão analisadas in silico. Assim, com estes estudos sobre a expressão de proteínas em fungos filamentosos em diferentes condições de crescimentos, abre-se a perspectiva de explorar enzimas que ainda não foram identificadas e até detectadas por técnicas convencionais de purificação e detecção via ensaios enzimáticos. Assim as análises proteômicas possibilitam a detecção e identificação de diferentes proteínas expressas em diferentes condições de crescimentos microbianos nos bioprocessos submerso e sólido, contribuindo para identificação de conjuntos proteicos.

Investigação dos parâmetros cinéticos para determinação da especificidade de peptidases oriundas de bioprocessos fermentativos e purificadas

Isolamento de fungos produtores de proteases. Bolsa de Produtividade CNPq Proc. 303631/2009-0

Recursos Complementares para Apoio a Grupos de Pesquisa - Novos Docentes Processo nº 10.1.20768.1.1 R$5.000,00

O presente projeto tem como objetivo realizar a estudos dos processos fermentativos de fungos produtores de proteases e a caracterização bioquímica das proteases purificadas.Projeto Universal CNPq Processo nº474804/2010-0 R$19.800,00

O objetivo geral deste projeto é o isolamento de linhagens de fungos termotolerante e termofílicos produtores de proteases. Os parâmetros fermentativos dos fungos isolados serão estudos para otimizar a produção de proteases. As proteases serão purificadas e suas características bioquímicas serão determinadas.

Isolamente da proteases produzida pelo fungo Aspergillus terreus e realizar a caracterização bioquímica.

PROJETO 1 DA PRÓ-REITORIA DE PESQUISA USP (PROCESSO Nº 2006.1.22590.1.3FCFRP R$3.000,00

Realizar a identificação de fungos de solo produtores de proteases