Marisa Dolhnikoff.

O projeto visa investigar a heterogeneidade espacial e comunicação intercelular em doenças pulmonares inflamatórias, agudas e crônicas, utilizando tecnologias avançadas de Patologia Espacial, incluindo análise Transcriptômica e Proteômica In Situ. O projeto utilizará tecidos pulmonares coletados na análise de rotina de autópsias biópsias, e explantes pulmonares, previamente arquivados em blocos de parafina no Departamento de Patologia da USP. Para desenvolvimento do projeto, o material retirado dos blocos será organizado em Tissue MicroArrays (TMA). O projeto se divide até o momento em quatro subprojetos; a médio prazo, novos subprojetos serão incorporados com o objetivo de expandir a investigação da heterogeneidade espacial e da comunicação celular para outras doenças pulmonares inflamatórias, fibrosantes e vasculares, visando a compreensão mais abrangente dos mecanismos patogênicos envolvidos em diferentes padrões de lesão pulmonar. Subprojeto 1: Investiga a patogênese do dano alveolar difuso (DAD) na Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (SDRA) de diferentes etiologias (sepse extrapulmonar, pneumonia bacteriana, Influenza A/H1N1 e COVID-19). O objetivo é analisar as alterações fenotípicas em células mesenquimais, endoteliais e epiteliais nos diferentes padrões de DAD além de a expressão de componentes da matriz extracelular. Serão utilizados tecidos pulmonares coletados em autópsias, divididos em 5 grupos (SDRA por sepse, pneumonia bacteriana, Influenza A H1N1, COVID-19 e controles). Subprojeto 2: Avalia a progressão e cronificação da COVID-19 grave em pacientes com tempo de doença prolongado e submetidos a transplante pulmonar. O objetivo é investigar a patogênese da fibrose pulmonar pós-COVID-19 e caracterizar a heterogeneidade das lesões pulmonares. Serão utilizados tecidos pulmonares de explantes pulmonares e amostras do subprojeto 1 (grupo SDRA por COVID-19). Subprojeto 3: Investiga a patogênese da linfangioleiomiomatose pulmonar (LAM) de diferentes etiologias (esporádica e hereditária). Os objetivos são caracterizar as células epitelióides e fusiformes da LAM, analisar as alterações fenotípicas no tecido pulmonar adjacente às lesões císticas e avaliar as interações entre as células da LAM e outras células (inflamatórias, mesenquimais e epiteliais). Serão utilizados tecidos pulmonares de biópsias de pacientes com LAM, divididos em 2 grupos (LAM esporádica e LAM relacionada ao Complexo da Esclerose Tuberosa). A análise espacial proposta neste projeto permitirá identificar assinaturas moleculares específicas de regiões com diferentes graus de inflamação e remodelamento tecidual, fornecendo insights sobre os mecanismos patogênicos de cada doença. Subprojeto 4: Investiga a patogênese dos diferentes padrões de lesões vasculares na Hipertensão Pulmonar, utilizando tecido de explantes de pacientes submetidos a transplante pulmonar. O estudo tem por objetivo caracterizar o microambiente perivascular, investigando como a interação entre fibroblastos e células musculares lisas promove a obliteração vascular; explorar a resposta das células endoteliais a esse processo, com ênfase na formação polarizada de lesões plexiformes, além de avaliar se é possível estabelecer diferentes fenótipos clínicos baseados nas interações entre o microambiente perivascular e a resposta das células endoteliais, considerando o padrão de lesão vascular predominante em cada paciente.

As autópsias representam instrumento essencial para o aprendizado médico, para o estudo do mecanismo de doenças,para a qualidade da informação de causas de óbito de uma determinada população, e são fundamentais para a avaliação da qualidade do atendimento médico. A modernização do processo de autópsia levou a novas modalidades do método, associando o exame direto do cadáver a exames de imagens (Autópsia Virtuais com tomografiacomputadorizada, ressonância magnética e ultrassonografia post-mortem) e, mais recentemente, ao desenvolvimento da Autópsia Minimamente Invasiva (AMI) - coleta de tecido por punções post-mortem, e da Autópsia Verbal (AV) - informações clínicas relacionadas ao óbito, obtidas através de questionários padronizados e validados. Nos últimos anos, o Departamento de Patologia da FMUSP tem conduzido projetos que combinam esses diferentesmétodos, com possibilidades diversas de aplicação: investigação de doenças epidêmicas (como nas epidemias de Influenza A H1N1 e Febre Amarela, e da pandemia de Covid-19), avaliação da prevalência e distribuição regional de complicações de doenças crônicas, detecção de doenças neoplásicas não diagnosticadas em vida, treinamento deequipes em AMIs para melhoria dos registros de óbitos em regiões sem infraestrutura de autópsia, desenvolvimento e validação de questionários de AV, e ensino médico baseado em autópsias. As desigualdades marcantes da população das grandes cidades estão claramente associadas ao adoecimento. A associação entre desigualdade, espaço urbano e saúde tem sido estabelecida em termos de variações de morbidade e mortalidade ao longo do território. O presente projeto visa expandir o escopo dos estudos espaciais de saúde, incorporando uma base de dados única no mundo, tornada factível pelo grande número de autópsias médicasrealizadas pelo Serviço de Verificação de Óbitos da Capital (SVOC), maior serviço de autópsias médicas do mundo. As autópsias e os questionários de AV podem fornecer indicadores de saúde não existentes nas bases de dados atuais, configurando uma oportunidade extremamente vantajosa para compor bancos de dados únicos. O objetivo geral dapresente proposta é, a partir das doenças encontradas em autópsias de pessoas que viveram em São Paulo, entender a variabilidade espacial e a patogenia da vulnerabilidade dos habitantes da cidade. Outro objetivo é entender as consequências sistêmicas da Covid Longa através da avaliação de tecidos de indivíduos com história prévia de Covid-19 de diferentes gravidades. Nossa proposta irá focar em três aspectos centrais: as consequências da Covid Longa vistas pelo estudo post-mortem, o impacto do ambiente físico e socio-econômico sobre a evolução de doenças crônicas de alta prevalência, e a validação do novo questionário de AV proposto pela Organização Mundial da Saúde(OMS) em 2022. Três dos projetos apresentados pretendem caracterizar os efeitos a longo prazo da Covid-19 de forma sistêmica, com foco na doença pulmonar e renal, investigando os mecanismos envolvidos nas alterações morfológicas a longo prazo. Outros dois projetos visam a avaliação de desigualdades urbanas usando a autópsia como instrumento principal, e o estudo do papel de fatores ambientais no desenvolvimento de doenças neurodegenerativas.Pretendemos realizar um estudo cartográfico para avaliar a qualidade do diagnóstico das neoplasias, dos cuidados com o idoso acamado, da prevalência de doença renal crônica, do manejo adequado do diabetes mellitus, avaliar o papel do tráfego como determinante da variabilidade espacial à exposição à poluição atmosférica, e ainda investigaro papel da poluição no desenvolvimento de doenças neurodegenerativas e na neuroinflamação. Por fim, iremos realizar a validação do novo instrumento de Autópsia Verbal da OMS utilizando a autópsia convencional como padrão ouro.

Objetivo geral: 1. Estudo da fisiopatogenia da COVID Longa a partir da autópsia completa de indivíduos com COVID-19 sintomática prévia de diferentes gravidades e da coleta de dados clínicos que permitam a identificação de critérios diagnósticos de Covid Longa determinados pela OMS. 2. Geração e compartilhamento de um biorepositório de tecido post-mortem de pacientes com critérios diagnósticos de Covid Longa e pacientes controles não-Covid.

A atual pandemia de COVID-19 é um exemplo onde a obtenção de tecido post-mortem é fundamental para o entendimento da fisiopatogenia da infecção, permitindo identificação de alvos terapêuticos de curto e médio prazo para o enfrentamento da doença. No entanto, dada a alta contagiosidade do SARS-CoV-2, as determinações de segurança do procedimento de autópsia recomendam estruturas não existentes em nosso país e, mesmo, restrita a poucos centros do mundo (1). Em face do dilema representado, de um lado, pela necessidade de obtenção de material humano para o conhecimento da fisiopatologia da doença e, de outra parte, pela biosegurança necessária para o manejo de tecidos contaminados, nosso grupo de pesquisa desenvolveu um protocolo de autópsias minimamente invasivas guiadas por ultrassom (AMI/US). Tal protocolo permite a coleta de tecido de diferentes órgãos com a segurança necessária para a equipe executante, além de ser de baixo custo, alta sensibilidade diagnóstica e alta portabilidade. De fato, a AMI/US já havia sido empregada com sucesso no recente surto de febre amarela em São Paulo em 2018 (2), e já mostrou-se igualmente efetiva no atual surto de SARS-CoV-2 (3). O próprio Ministério da Saúde do Brasil recomenda explicitamente a realização de AMI para os casos de COVID-19 (4), recomendação essa que apresenta, como ponto impeditivo para a sua ampla utilização, a falta de profissionais treinados para tal procedimento. Esse aspecto será abordado mais além na presente proposta. Os procedimentos se iniciaram em março/2020, com AMI realizadas em pacientes com idades variando entre 6 meses a 83 anos de vida, com amostragem ampla (microscopia óptica, material congelado para estudos moleculares, e fixação especial para microscopia eletrônica), contemplando os seguintes órgãos e estruturas: Cérebro, bulbo olfatório, nervo olfatório, mucosa nasal incluindo o epitélio olfatório, parótida, glândula submandibular, tireóide, coração, pulmões, fígado, rins, baço, pâncreas, intestinos, gordura abdominal, pele, músculos esquelético (quadríceps femural e intercostais), testículos. Estamos, portanto, construindo um dos maiores e mais diversificados biorepositórios de tecidos humanos de pacientes infectados pelo SARS-CoV-2 (o projeto de pesquisa para coleta já está aprovado pelo sistema CEP/CONEP - CAAE - 30364720.0.0000.0068 Parecer CONEP 3.951.904). Esse material é a base que alicerça as pesquisas propostas pelo nosso grupo e, também, será compartilhado de forma aberta com outros centros de pesquisa de nosso país, uma vez respeitadas as normas éticas previstas em lei. Vale ressaltar que, ao longo desta pandemia, já iniciamos o compartilhamento de amostras teciduais, que têm dado subsídio para um crescente número de outros projetos desenvolvidos por grupos de pesquisa tanto da USP como externos à nossa Instituição (Centro de Pesquisas em Genoma Humano - IB/USP; Incor/FMUSP; Departamento de Farmacologia da FMRP/USP, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da UFRJ). Ao longo do estudo, certamente novos grupos desenvolverão projetos com apoio deste acervo biológico, tendo em vista que somos o único centro possuidor das condições para coleta de tecido de pacientes com COVID-19.

Conjunto de projetos que visam a investigação post-mortem da fisiopatogênese da COVID-19, utilizando a Autópsia Minimamente Invasiva guiada por ultrassom (AMI-US), realizada em pacientes do complexo HC-FMUSP com COVID-19 fatal. No cenário de uma epidemia por um agente novo e relativamente desconhecido, a autópsia representa ferramenta fundamental para a investigação de fenômenos relacionados à fisiopatogenia da doença e impacto em órgãos-alvo e sistêmico. No caso da COVID-19, raras autópsias foram realizadas até o momento, pelo risco de contágio dos profissionais envolvidos no processo. A autópsia minimamente invasiva (AMI) tem sido proposta como alternativa à autópsia convencional (AC) e se apresenta como ferramenta útil e eficaz neste cenário. O método tem se mostrado eficaz, particularmente para o diagnóstico de doenças infecciosas. Além disso, o procedimento se mostrou adequado para a coleta de amostras para estudos moleculares e para a identificação de microorganismos (Duarte-Neto et al, 2019). Subprojeto 1: Avaliação post-mortem do comprometimento sistêmico na COVID-19 No presente projeto, propomos a realização da AMI-US de pacientes com morte por COVID-19 com coleta de tecido através de punção dos seguintes órgãos e tecido: pulmões, coração, fígado, rins, baço, SNC, músculo esquelético e pele. As autópsias têm o objetivo geral de avaliar o comprometimento pulmonar e sistêmico da COVID-19 em pacientes graves, a identificação de infecções secundárias associadas ao mau prognóstico, além de criar um biorrepositório para estudos futuros. Os principais objetivos são: a) Descrição dos achados histopatológicos pulmonares e sistêmicos em casos fatais de COVID-19. b) Identificação de infecções secundárias bacterianas e/ou fúngicas por métodos histoquímicos e moleculares. c) Descrição de achados de microscopia eletrônica em amostras do parênquima pulmonar, focando no encontro de vírions do 2019-nCOV, nas alterações da célula endotelial de capilares septais, nas alterações de pneumócitos e no interstício pulmonar. d) Caracterização da imunomarcação de antígenos do 2019-nCOV em diferentes tecidos por meio de imunohistoquímica e) Detecção e quantificação do RNA do vírus 2019-nCOV em amostras de tecido coletadas post mortem, por meio da técnica de PCR. f) Análise por transcriptoma de amostras de tecido pulmonar, coletadas no período post mortem de pacientes com COVID-19 fatal, correlacionando-a com parâmetros bioquímicos, com o aspecto morfológico das lesões à microscopia óptica e com o resultado da imunomarcação de antígenos in situ, por meio de imunohistoquímica, com o intuito de esclarecer processos patogênicos associados à evolução desfavorável da COVID-19. Subprojeto 2. Imunopatologia da COVID-19 fatal em pacientes idosos A maior gravidade e mortalidade da doença em idosos pelo COVID 19 está associada à desregulação imune desta faixa etária, que promove uma reação inflamatória sustentada de maior monta que em jovens. Nós hipotetizamos que nos tecidos pulmonares de pacientes idosos que não morreram de causas pulmonares haverá maior expressão dos marcadores inflamatórios, ligados ao envelhecimento, que se acentuará nos pacientes com SARS- Cov2. Hipotetizamos ainda que a expressão de ACE2 pulmonar será menor nos pacientes idosos que morreram de SARS-2. Os principais objetivos são: Fenotipar a lesão tecidual pulmonar em tecido obtido por MIA, comparando-se com pulmão de faixas etárias semelhantes, Comparar a quantidade de marcadores celulares linfocitários T e B, neutrófilos, células dendríticas, macrófagos e mastócitos em adultos versus adultos idosos (>65 anos) com pulmões normais á autopsia e aquele infectados por COVID2; Comparar a expressão tecidual dos receptores ACE2, e do TMPRSS em adultos versus adultos idosos (>65 anos) com pulmões normais á autopsia e aquele infectados por COVID2, Comparar a expressão de TLR-3, IL-6, TNF-a

Caracterização histológica e correlação anátomo-clínica dos efeitos sistêmicos da Febre Amarela, com ênfase nas alterações pulmonares responsáveis pela Lesão Pulmonar Aguda em casos fatais da recente epidemia de 2018 no Estado de São Paulo

PROCESSO CNPQ # 573813/2008-6. VALOR TOTAL R$ 7.190.000,00. COORDENADOR: PROF. PAULO HILÁRIO NASCIMENTO SALDIVA. 
VIGÊNCIA: DEZ/2011.