Juliana Pereira.

Projeto de pesquisa prospectivo que objetiva determinar os valores absolutos e relativos das subpopulações linfocitárias B, T e NK em sangue periférico mensuradas por técnica de imunofenotipagem por citometria de fluxo , bem como as razões neutrófilo/linfócito e linfócito/monócito de pacientes recém diagnosticados com LDGCB ou linfoma folicular e compará-los aos valores descritos em indivíduos saudáveis. A partir de tais quantificações objetiva-se ainda avaliar o potencial impacto prognóstico do perfil linfocitário B, T e NK no sangue periférico de indivíduos com LDGCB ou linfoma folicular em relação aos desfechos sobrevida livre de eventos e sobrevida global, avaliar o significado prognóstico da quantificação absoluta de neutrófilos, linfócitos e monócitos totais, bem como das razões neutrófilo:linfócito e linfócito:monócito no sangue periférico de indivíduos com LDGCB ou linfoma folicular em relação aos desfechos sobrevida livre de eventos e sobrevida global , e avaliar existência de correlações significativas entre a quantificação das subpopulações linfocitárias do sangue periférico de tais indivíduos e variáveis clínico-laboratoriais, índices prognósticos e resposta terapêutica à imunoquimioterapia R-CHOP e R-CHOP-símile.

Na última década, avanços na área da microscopia automatizada revelaram novas possibilidades de ensaios funcionais, permitindo a análise de um amplo espectro de alterações fenotípicas a nível celular. A triagem de alto conteúdo (High Content Screening HCS) é uma abordagem à biologia celular que combina imagens de fluorescência multicoloridas de forma automatizadas e análise de dados de forma quantitativa em um formato de alto rendimento adequado para aplicações em larga escala. O HCS permite a avaliação de diversos parâmetros relacionados ao fenótipo celular, tais como aspectos morfológicos e referentes a presença/localização de proteínas de interesse, a partir da aquisição de imagens em células marcadas com reagentes fluorescentes específicos (anticorpos ou corantes) a compartimentos celulares, proteínas de interesse e ácidos nucleicos. Existe uma complexidade tecnológica, técnica e científica para a utilização do HCS de forma adequada a se obterem resultados robustos e reprodutivos, que exigem um ambiente multidisciplinar e altamente capacitado. Através desta proposta, buscamos viabilizar uma plataforma de HCS de última geração, dentro de uma instituição com grupos científicos renomados internacionalmente. Este projeto visa detalhar os aspectos teóricos e práticos que justifiquem a obtenção do EMU proposto e seu impacto na ciência do Estado de São Paulo e no Brasil.

Esse projeto envolve isolamento da célula T tronco de memória de portadores assintomáticos do retrovírus HTLV-1 e pacientes com leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL), por metodologia de "single-cell" em amostras de sangue periférico. Utilizando-se três grupos (controles saudáveis, portadores assintomáticos do HTLV-1 e ATLL) será feita caracterização fenotípicas dessas células utilizando imunofenotipagem por citometria de fluxo em plataforma de 8 cores, determinação de carga pró-viral por qRT-PCR e análise GEP/mutacional por RNAseq. Objetiva-se comparar esses parâmetros nos três grupos de estudo e com isso compreender os mecanismo genético-moleculares associados a progressão do estado de portador assintomático do HTLV-1 para ATLL francamente manifesta.

O linfoma difuso de grandes células B (LDGCB) é uma malignidade agressiva e com marcada heterogeneidade clínica, patológica, biológica e prognóstica. É o subtipo de linfoma não-Hodgkin mais frequente, causando elevada morbidade e mortalidade em seus portadores. Trata-se, portanto, de um importante problema de saúde pública no Brasil e em todo o mundo. A despeito das elevadas taxas de resposta proporcionadas pela terapia primária baseada no regime imunoquimioterápico R-CHOP, 40-45 dos casos serão refratários ou recairão. Atualmente, a terapia padrão para a doença recidivada/refratária (R/R) baseia-se em imunoquimioterapia de salvamento com análogos de platina seguida por transplante de células tronco hematopoiéticas autólogas (auto-TCTH). Entretanto, apenas 50 dos pacientes serão responsivos a essa estratégia e sobreviverão a longo prazo. Devido aos desfechos bastante reservados do LDGCB R/R, particularmente nos casos refratários primários e/ou com recaídas precoces (#8804; 12 meses), novas terapias têm emergido. Entre essas, ganha-se destaque a terapia com células T contendo antígenos quiméricos recombinantes (CAR-T). Os resultados obtidos com a terapia CAR-T são bastante promissores, tornando-a atualmente a terapia de segunda linha ideal para casos refratários ou com recaídas precoces. No entanto, trata-se de uma modalidade terapêutica de alto custo e de acesso não universal na maior parte do globo, particularmente em regiões carentes de recursos. Sendo assim, nesse estudo, nos propomos a estudar os casos de LDGCB R/R, particularmente aqueles potencialmente candidatos a terapia CAR-T, do ponto de vista clínico-demográfico, patológico e evolutivo, visando elaborar e validar um escore prognóstico que funcione como ferramenta para priorização de terapia CAR-T nos casos com indicação dessa estratégia. Ademais, devido às grandes lacunas no conhecimento das bases biológicas do LDGCB R/R, nos propomos a conduzir um estudo translacional pioneiro envolvendo três grupos com padrões de resposta distintas ao regime R-CHOP (responsivos vs refratários/recaídos precoce vs recaídos tardios). Aqui, faremos uma análise multiômica (transcriptoma e proteômica) utilizando uma plataforma digital espacial in situ (GeoMx DSP). Dessa forma, buscaremos estabelecer perfis de assinatura gênica e proteica no LDGCB capazes de discriminar ao diagnóstico subgrupos de pacientes que apresentarão diferentes padrões de resposta frente ao tratamento primário. Adicionalmente, poderemos compreender as bases moleculares associados à quimioresistência, bem como identificar biomarcadores moleculares preditores de falência terapêutica. Além de contribuir para o conhecimento da patogênese do LDGCB R/R, pretenderemos construir um painel gênico capaz de predizer resposta terapêutica no LDGCB. Essa tecnologia poderá ser incorporada à prática clínica, contribuindo para identificação precoce de casos com alto risco de falência ao regime R-CHOP. Uma vez identificados, tais pacientes poderão pré-emptivamente experimentar abordagens terapêuticas mais intensificadas ou baseadas em novas terapias, capazes de melhorar suas respostas e sobrevida.

O linfoma difuso de grandes células B (LDGCB) é o subtipo mais comum delinfoma não Hodgkin, com ampla diversidade clínica e biológica, bem como prognósticoheterogêneo. Afeta especialmente a população idosa, com incidência crescente com idadeavançada. O LDGCB de pacientes idosos (#8805; 60 anos) e muito idosos (#8805; 80 anos) teminúmeras particularidades, incluindo achados genético-moleculares de alto risco, maiorassociação com infecção pelo vírus Epstein-Barr (EBV), menor tolerabilidade aimunoquimioterapia e piores desfechos clínicos. Nesse sentido, estratégias terapêuticasalternativas têm emergido na última década, incluindo imuno-quimioterapia em dosereduzida e esquemas sem doxorrubicina. Embora prevalente em pacientes idosos, o realimpacto da infecção crônica por EBV permanece controverso no LDGCB de novo,particularmente na era rituximab. Índices ou escores de prognóstico são ferramentasbastante úteis para estimar a sobrevida de pacientes com linfomas agressivos. No entanto,os escores clássicos IPI, R-IPI e NCCN-IPI apresentam limitações de acurácia quandoaplicados em pacientes idosos com LDGCB, SOE. Até o momento, o único índiceprognóstico desenvolvido especificamente para população idosa com LNH B agressivo é oE-IPI, porém esse índice não leva em consideração variáveis biológicas, imunológicas, nemo status das do EBV nas células tumorais.Objetivo primário: construir um escore de risco para pacientes idosos (> 60 anos) comLDGCB, SOE envolvendo variáveis clínicas e laboratoriais identificadas em estudo préviodo nosso grupo, incorporando a presença do EBV. Objetivo secundário: análise de sobrevida global (SG), sobrevida livre de progressão (SLP),desfechos clínicos, perfil de toxicidade ao tratamento, frequência de EBV positivo, cargaviral do EBV por qRT-PCR e padrão de latência viral.Desenho e casuística: estudo observacional, retrospectivo e unicêntrico. Envolverápacientes com idade maior ou igual a 60 anos portadores de LDGCB, SOE, diagnosticadose tratados no ambulatório de linfoma não-hodgkin do Serviço de Hematologia, Hemoterapia Terapia Celular do HC-FMUSP/ICESP, no período entre janeiro de 2009 e dezembro de2022.Metodologia: As curvas de sobrevivência serão construídas pelo método de Kaplan-Meier, eo teste de Log-Rank e qui-quadrado serão usado para estabelecer associações entrevariáveis e resultados. Análise univarida para determinação de fatores prognósticos serárealizada por regressão de Cox. Variáveis que forem significantes em análise univariadaserão testadas em análise multivariada usando modelo de razões proporcionais demúltiplas etapas de Cox para estabelecer variáveis independentes. Isso com intervalo deconfiança de 95 (95 CI), e um valor de p #8804; 0,05 foi considerado estatisticamentesignificativo. A seleção das variáveis preditoras no escore será realizada por três técnicasdiferentes, sendo: regressão logística, árvores de classificação e redes neurais artificiais.Todas as análises terão sua acurácia avaliada através de curvas ROC em que seráconsiderado um bom modelo se a área sob a curva for igual ou superior a 0,750.Esse estudo, poderá permitir maior conhecimento e a identificação debiomarcadores clínicos, laboratoriais e imunológicos do LDGCB, SOE de indivíduos idososcom foco na regulação tumoral mediada pelo EBV, em um cenário de vida- real. Contribuirá para desenvolver um modelo preditor de sobrevida capaz de refinar a estratificação do prognóstico e talvez, de direcionar a terapia adaptada ao risco para esse grupo de pacientes habitualmente negligenciados e não-incorporados na maior parte dos estudos clínicos.

Trata-se de estudo translacional envolvendo amostras teciduais de portadores de linfoma NK/T-extranodal, tipo nasal e controles saudáveis, representados por amostras teciduais de mucosa naso-sinusal normal. Objetiva-se comparar a expressão tecidual do gene TNF-alpha, acessada por técnica de qRT-PCR, bem como a expressão protéica de TNF-alpha, acessada por imunohistoquímica entre os casos e controles. O ENKTCL é uma neoplasia linfoproliferativa altamente agressiva, angiotrópica e associada a necrose tecidual exuberante. O TNF-alpha é um dos principais fatores de transcripção envolvidos em resposta inflamatória e parece atuar promovendo a necrose tumoral, de forma a propriciar um microambiente tecidual permissivo e favorável a progressão e propragação da neoplasia. Hipotetizamos dessa forma, que casos de ENKTCL estejam associados a níveis elevados de expressão gênica tecidual e protéica desse fator transcripcional quando comparados aos controles saudáveis. Da mesma forma pretende-se no estudo realizar o sequenciamento gênico de exons do gene TNF alpha para pesquisa de mutações e polimorfismos. Pesquisaremos se hiperexpressão gênica, protéica e polimorfismos do TNF-alpha exibem associações significativas com características clínico laboratoriais, índices prognósticos e desfechos (ORR, OS e PFS) no ENKTCL. Dessa forma a descoberta de novos potenciais biomarcadores genômico-moleculares envolvidos no referido estudo poderão contribuir para o refinamento da estratificação prognóstica desse grupo de neoplasias com desfechos ainda bastante desfavoráveis nos dias atuais.

Este projeto envolverá sequenciamento genômico de última geração (next generation sequencing) de pacientes portadores de doença esclerosante relacionada a IgG4, objetivando encontrar mutações recorrentes associadas a patogênese dessa rara doença imuno-inflamatória.

Esse projeto fundamenta-se na utilização de tecnologia de RNAseq para pesquisa alterações gênicas associadas a microambiente tumoral imune, bem como caracterização imunohistoquímica dos integrantes celulares do MAT em linfomas B de alto grau relacionados a AIDS, comparando-se particularmente casos associados e não-associados ao vírus de Epstein-Barr (EBV). Com isso pretende-se estabelecer papel do EBV na linfomagênese dos LRA e entender sua modulação para determinaçaõ fenotípica dessas neoplasias. Esse projeto envolve parceiria internacional com Departamento de Hematopatologia da Chemitz Klinik, Berlim, Alemanha.

Projeto multicêntrico, envolvendo as instituições ICESP/HC-FMUSP, UNICAMP, HGA-FCM e UNIFESP que visa caracterização clínico-laboratorial, análise de desfechos e identificação de fatores prognósticos com impacto em SG e SLP em portadores de linfoma não-Hodgkin de células do manto.

Projeto unicêntrico e prospectivo que visa caracterizar, quantificar (níveis relativos e absolutos) e acessar impacto prognóstico de subpopulações linfocitárias B, T e NK em sangue periférico de pacientes portadores de linfomas não Hodgkin B indolentes e agressivos. Serão incluídos na análise portadores de LNH DGCB, folicular (graus 1, 2, 3A e 3B) e linfoma de células do manto tratados no ICESP/HC-FMUSP a partir de 2021.

Projeto que visa determinar caracterização, estruturação, disposição celular e eventual impacto prognóstico de diferentes elementos constituintes do microambiente tumoral não neoplásico do LNH DGCB utilizando metodologias de patologia digital e deep learning.

Estudo clínico (ACERTA LY 312), visando avaliar desfechos (ORR, OS e PFS) em pacientes com LNH tipo DGCB, fenótipo ABC (activated B-cell), com idade inferior a 65 anos, previamente não-tratados. estudo envolve compração entre dois braços terapêuticos: RCHOP + placebo vs. RCHOP + acalabrutinib.

Estudo multicêntrico, com colaboração de parceiro internacional (Dr. Carlos Murga Zamalloa, University of Chicago, Illinois e Dr. Ryan Wilcox, University of Michigan), visando sequenciamento completo de exoma, utilizando tecnologia NGS (next generation sequencyng) em pacientes com linfoma de células T periféricas, sem outras especificações (PTCL, NOS) visando determinar panorama genômico global desses tumores e potenciais biomarcadores moleculares associados a refinamento diagnóstico e com impacto prognóstico.

Analisaremos padrão de expressão de genes relacionados a microambiente tumoral, epigenética e proliferação/ regulação de ciclo celular em mais de 250 amostras teciduais de portadores de LNH folicular tratados em nosso centro de Jan/2010 a Dez/2020, utilizando plataforma de microvarredura gênica (micro array). Objetiva-se comparar o padrão de expressão desses genes em pacientes com doença grau histológico 1/2 vs 3A e precoce (EC I e II) vs avançada (EC III e IV). O padrão de expressão dos genes de interesse também serão correlacionados com desfechos ORR, POD-24, OS e PFS, visando determinação de potenciais biomarcadores preditivos de prognóstico. Após fase experimental, será feita fase de validação em coorte externa, proveniente do Departamento de Hematopatologia do MD Anderson Cancer Center, Houston, USA.

Estudo multicêntrico, envolvendo ICESP-HC/FMUSP em parceria com diversas instituições catalogadas no Projeto T-Cell Brazil (coordenado pelo Prof Carlos Chiattoni). Objetiva determinar caracterização clínico-laboratorial, análise de desfechos e elucidação de fatores prognósticos em grande coorte de pacientes brasileiros com linfoma não-Hodgkin T/NK extranodal, tipo nasal.

Projeto unicêntrico e retrospectivo, envolvendo cerca de 300 pacientes com diagnóstico de LDGCB, com idade superior a 70 anos, tratados no ambulatório de LNH do HC/ICESP-FMUSP no período de Jan/2010 a Dez/2021. Esse projeto visa estabelecer caracterização clínico-laboratorial e epidemiológica dessa coorte, bem como determinar desfechos clínicos em população muito idosa tratada com intenção curativa com poliquimioimunoterapia R-CHOP símile. Ainda têm-se como objetivos determinar fatores com impacto prognóstico com sobrevida global (SG) e sobrevida livre de progressão (SLP) e posterior construção de Índice Prognóstico para população supracitada.

Projeto retrospectivo, unicêntrico e exploratório, visando analisar padrão de expressão de diversos microRNAs em biópsias de 50 pacientes com LDGCB primários de SNC tratados no HC FMUSP de Jan 2010 a Dez 2020. Contará com estudo piloto envolvendo 7 pacientes e três controles (cérebros normais) onde serão selecionados entre mais de 300 microRNAs, cerca de 20 microRNAs diferencialmente expressos ( < ou > 2 vezes o controle). Após, passaremos a uma fase de validação envolvendo toda a coorte, onde serão realizadas reações de qRT-PCR para os microRNAs selecionados nas amostras fixadas em formalina e embebidas em parafina. Finalmente tentaremos estabelecer possível relevância prognóstica dos microRNAs diferencialmente expressos correlacionando-se com desfechos ORR, OS e PFS

Pesquisa de DNA Tumoral Circulante em Linfoma Agressivo pela técnica Z Sccan e de sequenciamento gênico paralelo por CAPP-SEQ.

O Brasil possivelmente possui o maior número absoluto de portadores do vírus HTLV-1, com cerca de 800 mil a 2,5 milhões de indivíduos infectados. Cerca de 2-5 dos infectados pelo HTLV-1 desenvolverão doença sintomática, desde formas graves como a paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao vírus (HAM/TSP) e a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL). Ambas associadas a elevadas taxas de morbidade e mortalidade. Porém a fisiopatologia associada à progressão do estado de portador assintomático para ATLL permanece obscura. O HTLV-1 é capaz de infectar e modificar o funcionamento das células do sistema imune, em especial os linfócitos T CD4+. Sabe-se que a ativação e a proliferação das células infectadas pelo HTLV-1 promovem desequilíbrio do ciclo celular em especial pontos de checagem, processo altamente regulado e ordenado de genes e proteínas. As proteínas virais tax e rex, assim como as proteínas acessórias (p12, p13, p30 e HBZ) podem interferir no ciclo celular do hospedeiro promovendo o aparecimento da fisiopatologia da ATLL. Anormalidades em genes participantes dos mecanismos de senescência celular e vias de resistência a apoptose também podem ser alteradas pelo HTLV-1, corroborando para a perpetuação da infecção viral, além de criar microambiente favorável para o processo de oncogênese da ATLL. Com base em tais fundamentos, propomos um estudo com o objetivo de mapear genes reguladores do ciclo celular e de senescência prematura de indivíduos infectados pelo HTLV-1, incluindo portadores assintomáticos e pacientes com ATLL. A expressão de genes reguladores do ciclo celular e de senescência serão avaliados em portadores assintomáticos do HTLV-1, pacientes com ATLL e amostras de sangue periférico de indivíduos saudáveis que serão analisados em paralelo como controle. O estudo será realizado no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC/FMUSP) e no Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (ICESP). Os resultados permitirão ampliar o espectro de alvos moleculares, assim como criar mais opões terapêuticas e trazer novos conhecimentos relacionados aos mecanismos biológicos e moleculares envolvidos na conversão de estado de portador assintomático para ATLL, doença altamente agressiva, com escassas opções terapêuticas efetivas e que afeta porção considerável da população brasileira e mundial.

Projeto de pesquisa que visa avaliar a frequência de ocorrência das mutações relacionadas a controle epigenômico IDH1/IDH2, DNMT3A e TET2 e seu significado prognóstico, buscando-se estabelecer correlação com os desfechos sobrevida global e sobrevida livre de progressão de doença em pacientes portadores de linfomas de células T periféricas predominantemente nodais. Esse projeto está sendo desenvolvido em parceiria com Departamento de Hematopatologia do MD Anderson Cancer Center, Houston, USA.

Esse projeto visa determinar os principais mecanismos de resistência in vitro à ação de ibrutinib e bortezomib no linfoma de células do manto, variantes biológicas SOX11 positivo e SOX11 negativo. Objetiva ainda determinação dos principais mecanismos de regulação biológica e genética, através de estudo de expressão de genes e microRNAs relacionados ás vias BCR e NF-kB no linfoma de células do manto SOX11 positivo e negativo, visando determinação de possíveis alvos moleculares passíveis de futuras intervenções terapêuticas.

Estudo dos componentes da microbiota intestinal utilizando técnicas de sequenciamento next generation em portadores de linfoma não Hodgkin difuso de grandes células B ao diagnóstico e ao término de tratamento imunoquimioterápico com protocolo R-CHOP.

Pesquisa de microRNA em Micose Fungoide do Tipo Cutix Laxa.

Análise da expressão do gene GATA3 por técnica de PCR quantitativo em tempo real em amostras parafinadas de linfonodo e tecido extralinfonodal de portadores de LNH T periféricos, com foco em estabelecer discriminação diagnóstica e impacto prognostico associado a hiperexpressão desse gene.