Alexander Henning Ulrich.

Glioblastoma multiforme (GBM) é a neoplasia maigna primárial mais comum e agressiva do SNC. Os pacientes, mesmo com um padrão agressivo de tratamento, têm uma sobrevida média de 15 meses e uma sobrevida em 5 anos inferior a 5. Atualmente existem mais de 150 quimioterápicos contra o câncer aprovados no mundo, no entanto, apenas três são aprovados para o tratamento de pacientes com GBM. Portanto, é fundamental que novas abordagens terapêuticas sejam desenvolvidas para melhorar o resultado clínico e sobrevida de pacientes com GBM. Diversas evidências têm sustentado que a progressão do GBM é impulsionada por uma população intratumoral de células-tronco tumorais. A este respeito, as células-tronco tumorais de glioblastoma (GSC) representam um alvo promissor para intervenção terapêutica. Aptâmeros são oligonucleotídeos selecionados a partir de uma biblioteca combinatória capazes de se ligar seletivamente a epítopos proteicos, de maneira semelhante aos já conhecidos anticorpos monoclonais. Os aptâmeros possuem um potencial promissor em aplicações diagnósticas e terapêuticas, devido a sua alta especificidade, baixo peso molecular, baixa imunogenicidade e facilidade de produção/manipulação, competindo com anticorpos monoclonais. O grupo do Prof. Dr. Henning Ulrich, Dept. de Bioquímica da USP, caracterizou dois aptâmeros de DNA, denominados Apt9 e Apt17, que se ligam com alta especificidade a GSCs e são internalizados por elas, indicando a potencial aplicação como moléculas transportadoras tendo como alvo as células-tronco tumorais que são altamente capazes de sobreviver às condições adversas. Por outro lado, o grupo Laboratório de Neuroquímica e Biologia Celular (LabNq) da UFBA, liderado por Silvia L. Costa tem larga experiência em estudos relacionados à fisiologia de GBM e do nicho tumoral e, em caracterizar novos agentes terapêuticos e sua relação com quimiorresistência e imunomodulação. O paradigma atual da biologia do câncer indica a estreita relação entre evasão imunológica e inflamação para a composição e o desenvolvimento do microambiente tumoral. Ainda não está claro como o câncer molda as células imunes para que tenham atividade pró-tumoral, mas sabe-se que elas possuem um perfil molecular exclusivo que muda de acordo com o grau do GBM. Espera-se neste trabalho caracterizar os efeitos e os mecanismos de ação dos aptâmeros de DNA nanoestruturados ligados à TMZ ou o flavonoide rutina com afinidade por GSCs vista do desenvolvimento de novas terapias adjuvantes para o GBM humano quimiorresistente. Serão objetivos específicos: i. Caracterizar os efeitos imunomodulador e anti-tumoral de aptâmeros de DNA nanoestruturados combinado a TMZ contra GSC sobre a viabilidade, proliferação e tumorigenicidade de células de GBM humanas altamente proliferativas (linhagens já estabelecidas) e em modelos pré-clínicos de tumores cerebrais, avaliando a progressão tumoral e o processo inflamatório; ii. Caracterizar vias de sinalização e controle de expressão de genes relacionados a quimiorresistência a exemplo de receptores de hidrocarbonetos arílicos de aptâmeros mais eficientes nos efeitos antitumorais; Propomos que iii. Validar dos efeitos de aptâmeros ligados a TMZ e rutina estabelecidos com seleção contra linhagens tumorais em células de explantes de tecido tumoral de pacientes estabelecidas em Biobanco do LabNq. O projeto será desenvolvido principalmente por pesquisadores, pós-doutorandos e alunos de pós-graduação e graduação que integram o grupo LabNq (ICS/UFBA) e os grupos de Henning Ulrich e da Claudiana Lameu (IQ/USP). A equipe é multidisciplinar e somará competência para alcance dos objetivos e assim trazer novos avanços no desenvolvimento de fármacos e aplicação na terapia adjuvante acessível e complementar para tumores cerebrais malignos. A partir dos resultados obtidos, almeja-se solidificar as bases científicas para o possível emprego

Em dezembro de 2019, iniciou-se na China um dos maiores desafios da humanidade na atualidade: a pandemia COVID-19. O Brasil é o segundo lugar no número total de mortes no mundo e São Paulo é o estado com o maior número de mortes pelo novo coronavírus no Brasil. Se sabe que o SARS-CoV-2, usa a glicoproteína Spike (S) do receptor da Enzima Conversora de Angiotensina 2 (ACE 2) para entrar nas células, porém células que não expressam o ACE2 também podem ser infectadas pelo vírus. De fato outro receptor o CD147, também chamado de Basigina, demonstrou recentemente a capacidade atuar como um receptor para SARS-CoV-2 em linhagens celulares de origem epitelial. O pulmão de indivíduos adultos apresenta células-tronco/progenitoras endógenas que também podem ser alvos da infecção viral pelo COVID-19 e também um possível alvo terapêutico. Pacientes com COVID-19 frequentemente apresentam perda de olfato e paladar e sintomas neurológicos, indicando acometimento do sistema nervoso central. Os estudos sobre o neurotropismo do COVID-19, em sua maioria, foi realizado na população chinesa sendo necessário trabalhos adicionais sobre se as manifestações neurológicas em outras populações de pacientes infectados COVID-19. É também importante avaliar se seu impacto no SNC é por meio de infecção direta ou por meio de efeitos secundários relacionados à sinalização inflamatória/pró-inflamatória. O sistema purinérgico são vias de sinalização onde nucleotídeos de purina, como o ATP agem como mensageiros extracelulares. O receptores purinérgicos do tipo P2X7 e P2Y6 atuam durante a ativação microglial e a infecção viral aguda, contudo a literatura ainda carece de estudo sobre a sinalização purinérgica e a infecção do COVID-19.O receptor sugeridos para entrada do vírus CD147, é amplamente expresso no SNC e em células tronco pulmonares assim como o ACE2, nossa hipótese é que o bloqueio desse receptor possar impedir a infecção por SARS-CoV-2 e modular a expressão de receptores P2X7 e P2Y6. Com base nessas evidências, os objetivos do projeto são analisar (1) a expressão de CD147, suas variantes de splicing e seu nível de glicosilação em iPSCs humanas diferenciadas em células progenitoras neurais normais e infectadas; (2) a capacidade de infecção por SARS-CoV-2 nestas células; (3) os efeitos da infecção viral sobre a morte celular, proliferação e diferenciação de células progenitoras neurais; (4) os efeitos induzidos pela inibição da CD147 per se ou em combinação com inibidores de ECA2, sobre a invasão e replicação do vírus SARS-CoV-2; (5) os efeitos induzidos pela inibição da proteína CD147 e ECA2 sobre a expressão de receptores purinérgicos P2X7 e P2Y6 e resposta neuroimune envolvida na infecção viral. Os resultados obtidos permitirão a melhor compreensão do mecanismo celulares da infecção por SARS-CoV-2, bem como o estudo de uma nova estratégia com potencial terapêutico para inibir a invasão viral e sua sinalização proveniente do bloqueio da proteína CD147.

The basal ganglia are a core that controls movement. Its circuitry is mainly formed by inputs from cortical and thalamic glutamatergic neurons, striatal and pallidal GABAergic neurons, and dopaminergic neurons from substantia nigra. Dopamine receptors on GABAergic neurons control their excitability, plasticity, andneurotransmitter release. Parkinsons and Huntingtons disease are two neurodegenerative diseases that exhibit dysfunction of basal ganglia circuitry. Parkinsonian rodents model present hypoactivity of dopamine D1 receptors and hyperactivity of dopamine D2 receptors, which promote and inhibit movement in healthy conditions, respectively. Evidence suggests that Huntintons Disease progression depends on the loss of synaptic efficacy in the lateral inhibition of the striatal neuron projections, increasing its excitability. This pathological hyperexcitation results in the excessive and unstable firing of the circuitry and activation of desynchronized and non-functional neuronal groups, contributing to the pathophysiology of early HD symptoms. The purinergic system participates in several brain functions. Neurotransmitter release, such as glutamate and dopamine, neuroinflammation, and synaptic plasticity are mediated by purinergic receptors (ionotropic (P2X) and metabotropic P2Y and adenosine receptors), which are activated by extracellular nucleotides and nucleosides. Accordingly, P2 receptors also interact and modulate glutamatergic receptors, such as AMPA, NMDA or mGluR5, impacting directly on neuronal excitability. The first project of our starting collaboration will be to unravel the role of purinergic signaling in controlling neuronal excitability of basal ganglia in basal ganglia dysfunctions. We will perform several electrophysiological recordings to assess the excitability and neurotransmitter release of cortical, striatal, and pallidal neurons in dopamine-depleted mice and an animal model of Huntingtons disease. We also aim to specifically target neurons from direct and indirect pathways by injecting viral constructs carrying fluorescent gene reporters, enabling their distinction. Later, we will activate neurons from the direct and indirect pathways by optogenetics to establish whether the P2 receptors are participating in striatal circuitry. At the end, we intend to establish whether the purinergic receptors modulate the striatal circuitry selectively by direct or indirect pathway in the dopamine-depleted mice and Huntingtons disease model.

A doença de Alzheimer (AD) é uma das causas principais da demência afetando mais de 5 milhões de pacientes idosos. Evidência científica sugere que o sistema imune e microbiota do intestino possuem funções críticas tanto na promoção quanto na supressão da AD. Este projeto investigará o eixo imune intestino-cérebro, responsável pela invasão cerebral por células imunes periféricas e pela indução de neuroinflamação e neurodegeneração na AD. Para isso, as células auxiliares Th17, serão treinadas com a microbiota intestinal de camundongos e humanos. A contribuição de células Th17, treinados com microbiota, na patogênese de AD será avaliada sob modulação de bactérias gram-positivas filamentosas segmentadas (SFB) por tratamento com vancomicina, camundongos controle e modelos de doença de Alzheimer (AD) serão alimentados com microbiota de camundongo e humana e a migração de células Th17 dependentes da microbiota intestinal para o cérebro será analisada. A migração de células Th17, produtoras de IL-17A, do intestino para o cérebro será rastreada nas meninges e no parênquima cerebral. Utilizaremos modelos de AD, como camundongos APP/PS1, 3xTG e SAMP-8, e os compararemos com o modelo de AD induzida por estreptozotocina química em testes comportamentais. Os animais que apresentarem sintomas correlatos a AD serão posteriormente analisados em estudos proteômicos e eletrofisiológicos. O treinamento da microbiota Th17, bem como a análise do tecido cerebral, serão feitos pela equipe da Prof. Eunha Kim, Korea University (KU) em Seoul, enquanto a alimentação dos modelos de AD, bem como a proteômica, sequenciamento de RNA, biologia computacional, eletrofisiologia, determinação expressão de marcadores sinápticos e estudos comportamentais serão feitos pela equipe brasileira coordenada pelo Prof. Henning Ulrich.

A doença de Alzheimer (DA) afeta 11.5% dos idosos no Brasil e o envelhecimento da população tem aumentado sua incidência. Não há cura ou tratamento para retardar a progressão desta doença. Assim, o estudo de novos alvos para terapia da DA é imprescindível. A ativação do P2Y2R induz efeito neuroprotetor. Este projeto investigará o envolvimento dos P2Y2R em processos relacionados a DA (fosforilação de tau, placas β amiloides, neurogênese, neuroinflamação) in vitro e in vivo (APP/PS1 vs controle).


Objetivos Gerais
Investigar o efeito da modulação dos receptores P2Y2 na neurogênese, transmissão sináptica e na inflamação em modelos da Doença de Alzheimer. 
Objetivos Específicos
A) Analisar o efeito da modulação dos receptores P2Y2 em cultura de neuroesferas provenientes da zona subventricular de animais transgênicos APP/PS1 de 2 meses de idade, comparados aos seus littermates de genotipagem negativa (controle):
- na fosforilação de proteína tau e placas β amilóide analisada por imunocitoquímica;
- na proliferação, migração e diferenciação celular.
B) Analisar o efeito da infusão crônica (21 dias) do agonista do receptor P2Y2 (MRS2768) no giro denteado do hipocampo de animais transgênicos APP/PS1 de 4 meses, comparados aos seus littermates de genotipagem negativa (controle):
?	na neurogênese adulta no giro denteado através da incorporação de BrDU e níveis de neurotrofinas BNDF e NGF;
?	na morfologia e espinhas dendríticas de neurônios proliferativos marcados com BrdU;
?	nos parâmetros eletrofisiológicos: propriedades passivas de membrana (capacitância, resistência, duração do potencial de ação, frequência de disparos, potencial de repouso de membrana) e correntes excitatórias pós-sinápticas em miniatura, em neurônios maduros e derivados da neurogênese adulta; potenciação de longa duração (LTP) entre o córtex entorrinal e o giro denteado (via perforante);
?	nos níveis de citocinas pró- e anti-inflamatórias;
?	nos níveis das neurotrofinas (BDNF e NGF).

Projeto: SPRINT-USP ((MAI-DAI/CNPq): 2.	Objetivos:
· Desenvolvimento de aptâmeros de DNA específicos aos alvos moleculares de superfície de CSC/CTC derivadas de pulmão e de próstata e sua utilização na detecção in vitro e in vivo de células tumorais em sangue periférico.
· Os aptâmeros estabelecidos com seleção contra linhagens tumorais serão validados com tecidos de pacientes.
· Modificação de aptâmeros para aumentar estabilidade e farmacocinética para aplicações in vivo (incubação com soro e injeção no sangue petrifico)
· Acoplagem de nanopartículas funcionais, utilizando funções carboxílicas e aminas para ligações de nanopartículas fluorescentes.
· Purificação e caracterização dos aptâmeros conjugados a nanopartículas
· Ensaios in vitro e in vivo por citometria de fluxo e tecido
· Ensaios de imageamento in vivo e de terapia para carregamento de drogas citotóxicas. 
· Detecção de células tumorais e CSCs no sangue periférico

A Doença de Alzheimer (AD) é a forma mais prevalente de demência, e apresenta no início de seu desenvolvimento um extenso processo neuroinflamatório, que resulta em danos aos neurônios e comprometimento da transmissão e plasticidade sináptica. Um desses danos é a deficiência na neurogênese adulta, que é alterada durante processos de neuroinflamação devido à presença de diversos componentes, como citocinas e quimiocinas liberadas pela microglia e astrócitos, além da invasão de células imunes periféricas. Assim, o estudo de mecanismos que possam prevenir o aumento do processo neuroinflamatório da AD são de extrema importância. Como atualmente não existe cura outratamentos eficazes para a AD, o objetivo deste projeto é avaliar se intervenções farmacológicas ou de estimulação cerebral (deep brain stimulation, DBS) podem prevenir/atenuar os danos causados pela AD no sistema nervoso central. As intervenções farmacológicas serão realizadas com agonistas/antagonistas de receptores purinérgicos e cininérgicos (P2Y2, P2Y14 e B2) envolvidos na migração, proliferação e desenvolvimento de neurônios, e quimiotaxia de células imunes periféricas. A DBS já mostrou melhorar processos cognitivos como a memória de curto prazo, e a modulação de circuitos específicos via DBS resultam no aumento da neurogênese, plasticidade sináptica e sobrevivência celular. Além disso, a DBS modula os níveis extracelulares de adenosina, que agem por receptores purinérgicos do tipo A1. O projeto avaliará o efeito da modulação do sistema purinérgico e cininérgico na neuroinflamação e neurogênese, utilizando a transfecção com retrovírus CAG/eGFP+, em modelos de AD: in vivo, com camundongos transgênicos APP/PS1 ou APP/PS1/B2R-/-, e in vitro com o modelo de neuroesferas isoladas destes animais. Visando a aplicação clínica, avaliaremos os efeitos da DBS no fórnix nos processos neuroinflamatórios e de neurogênese de animais APP/PS1 e seu papel na modulação dos níveis de adenosina e atividade do receptor A1.

O processo de neurogênese, que consiste na diferenciação de células tronco neurais (CTN) em neurônios, ocorre tanto na fase embrionária como no cérebro adulto. Por esse motivo, CTN têm sido sugeridas como importantes ferramentas para a regeneração de tecidos nervosos e reestabelecimento de condições saudáveis e para estudo para a compreensão do desenvolvimento fisiopatológico de
diversas doenças neurológicas. Em trabalhos anteriores, nosso grupo demonstrou diferentes viassinalizadoras que controlam o desenvolvimento de CTN, destacando-se o papel dos sistemas purinérgico e cininérgico, cuja modulação é essencial na determinação do fenótipo neural. Além de participar da neurotransmissão no cérebro adulto em condições saudáveis, sua modulação pode reverter quadros
patológicos em modelos animais e in vitro das doenças de Parkinson e Alzheimer. Considerando os achados de nosso grupo, nesse projeto propomos uma investigação mais aprofundada sobre os mecanismos que permeiam essa modulação, a fim de elucidar como os sistemas de sinalização via purinas e cininas estão envolvidos e podem ser alvos terapêuticos para reverter patologias neurológicas especialmente associadas à neurodegeneração/ regeneração e aos processos neuroinflamatórios. Assim, o papel neurogênico, neuroprotetor e imunoregulatório da sinalização purinérgica e cininérgica será estudado nas doenças de Parkinson, Alzheimer, Huntington e no transtorno bipolar. Além disso,
novas ferramentas baseadas em nanotecnologia, como biopolímeros conjugados à bradicinina, serão utilizadas no aprimoramento da técnica de transplante de CTN como alternativa terapêutica em modelos animais.

A formação dos diferentes tipos celulares do organismo ocorre a partir da diferenciação de células tronco (CT) não especializadas, já no início do desenvolvimento embrionário. A principal característica dessas células é a sua capacidade de auto renovação em células idênticas e a de especialização em células diversas. Por esse motivo, CT têm sido sugeridas como importantes ferramentas terapêuticas para a regeneração de tecidos e reestabelecimento de condições saudáveis bem como instrumentos de estudo para a compreensão do desenvolvimento fisiopatológico de diversas doenças. Em projetos anteriores, nosso grupo demonstrou diferentes vias sinalizatórias que controlam o desenvolvimento de CT, destacando-se o papel dos sistemas purinérgico e cininérgico. Os receptores purinérgicos P2Y2, P2X2 e P2X7, por exemplo, são essenciais na determinação do fenótipo neural e na diferenciação de CT para neurônios GABAérgicos, glutamatérgicos, colinérgicos e dopaminérgicos, além de modular a funcionalidade e resposta desses sistemas de neurotransmissão no cérebro adulto, tanto em condições saudáveis como em condições neuropatológicas. Considerando os achados de nosso grupo demonstrando o poder da modulação de receptores purinérgicos e cininiérgicos sobre a regeneração neural e a reversão de quadros patológicos em modelos animais e in vitro da doença de Parkinson, nesse projeto propomos uma investigação mais aprofundada sobre os mecanismos que permeiam essa modulação, bem como sua reprodutibilidade em outros modelos, a fim de gerar um conhecimento mais amplo sobre como os sistemas de sinalização via purinas e cininas está envolvido e pode ser alvo terapêutico para reverter patologias neurológicas e psiquiátricas, especialmente associadas à neurodegeneração/regeneração, aos processos neuroinflamatórios e déficits cognitivos-comportamentais. Para isso, serão alvo desse projeto a doença de Parkinson, a doença de Alzheimer, a doença de Huntington, a esclerose lateral amiotrófica, o transtorno bipolar, a esquizofrenia e o autismo. Dessa forma, o papel neurogênico, neuroprotetor e imunoregulatório da sinalização purinérgica e cininérgica será estudado, bem como a transplantação de células tronco como ferramentas terapêutica em modelos animais.

Maqui (Aristotelia chilensis) é uma planta comercialmente valiosa devido às propriedades antioxidantes de suas frutas, as quais mostraram amplas ações biológicas através de antioxidantes, anti-inflamatórios e analgésicos, levando à obtenção de produtos como agentes terapêuticos complementares no tratamento de vários distúrbios crônicos e degenerativos. O World Alzheimer Report (WAR) 2016 destacou que pessoas que vivem com demência possuem pouco acesso a cuidados médicos apropriados e o número de pessoas com demência tem aumentando, WAR 2016 estima que 46,8 milhões de pessoas em todo o mundo sofrem de demência em 2015 e esse número chegará a 131,5 milhões em 2050 (Prince et al. 2016). A planta Maqui possui moléculas bioativas como os alcalóides indólicos, os quais já demonstramos serem inibidores da AChE, uma enzima associada a doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Os alcalóides indólicos já foram propostos como terapia contra a doença de Alzheimer, neste trabalho vamos ampliar para o estudo de novas moléculas extraídas do Maqui, uma planta endêmica do Chile, como um suplemento nutricional que retarda e protege dos efeitos neurodegenerativos da doença de Alzheimer. Dr. Paz e colaboradores publicaram em 2017 o primeiro relato de inibidores de colinesterases (AChE) de alcalóides indólicos de A. chilensis. Esta publicação é considerada como o ponto de partida deste projeto, a fim de avaliar o papel dos alcalóides indólicos in vivo, e propor seu uso como alimento funcional ou nutracêuticos para pessoas idosas.

Experimental evidence suggests that the human (bone marrow derived) MSC, as a part of natural tumour microenvironment and/or introduced to the tumours as the drug delivery vehicle - may interact with the tumour cells using the MSC immuno-modulation potential of bradykinin and its degradation products via kinin-B1 and B2 receptor activation. Moreover, Dr. Ulrich´s laboratory has 
collected evidence for neural differentiation inducing properties of bradykinin, which will be studied in MSC-glioblastoma co-cultures. In this study we will validate at the molecular level the hypothesis that this mechanism involves 
kallikrein- kinin system, possibly coupled with purinergic signaling. Studies, comparing the signaling via the relevant altered genes with the observed phenotypic changes - in particular cell invasion and growth (i.e. balance between proliferation and senescence) - of GBM cells upon formation of the hetero-cellular GBM:MSC complex, will be preformed. In addition, possible differentiation of MSC cells, emerging from the complex, shall lead us to better understanding of the role and the potential of MSC in glioma cell therapy.

Células-tronco (CT) são células não especializadas com capacidade de auto-renovação que podem originar diferentes tipos celulares do organismo. Devido às suas características, nos últimos anos, as CT têm surgido como uma importante promessa terapêutica para diversas doenças. Além disso, CT de origem tumoral têm sido apontadas como responsáveis pela iniciação e crescimento de tumores, resistência às terapias clássicas e consequentemente pela recidiva da doença, sendo neste caso o possível alvo da terapia. A estrutura básica de uma CT depende de sua constituição genética, porém a determinação de um fenótipo específico também depende do estímulo de fatores intrínsecos e extrínsecos aos quais essas células são expostas em seu microambiente. A diferenciação de CT tem sido relacionada à atividade de inúmeros receptores intracelulares ou de membrana plasmática. O nosso laboratório tem estudado durante os últimos anos os papéis da bradicinina (BK) e de purinas na indução, progressão e determinação fenotípica na diferenciação neural de diferentes tipos de CT. Nossos resultados indicam a importância dos receptores purinérgicos P2X e P2Y, ativados por ATP, na proliferação e manutenção da pluripotência, como também na diferenciação para neurônios e células gliais. Como uma das descobertas principais do nosso grupo, a BK acelerou a neurogênese em vários modelos de CT e ainda mostrou efeito neuroprotetor, revertendo a indução da apoptose. Baseado nesses dados, propomos neste projeto estudar a relação dos sistemas cininérgicos e purinérgicos em CT utilizadas como ferramentas terapêuticas ou em pesquisa básica. Para isto, desenvolveremos aptâmeros de DNA com o objetivo de obter um marcador específico de diferentes tipos de CT, tais como mesenquimais e tumorais. Estes aptâmeros possuem possíveis aplicações terapêuticas, na purificação de CT mesenquimais para terapia celular e, no caso das CT tumorais, valor diagnóstico na dosagem dessas em fluidos biológicos. Com a intenção de definir novos alvos terapêuticos e, visto o efeito anti-proliferativo da BK sobre células-tronco neurais (CTN) e células de carcinoma embrionário, estudaremos a expressão do sistema de cininas e a participação de seus receptores na progressão tumoral em células derivadas de tumores de pulmão e glioblastoma, caracterizados por alta malignidade. Avaliaremos ainda o efeito da BK e seus análogos estáveis sobre a neurogênese endógena e o transplante de CTN em modelo pré-clínicos para a doença de Parkinson. Além disso, estudaremos as vias envolvidas na sinalização por BK. Avaliaremos também o papel de receptores purinérgicos em modelo animal de epilepsia. Realizaremos a caracterização in vitro da expressão e das funções das enzimas responsáveis pela degradação de nucleotídeos extracelulares e dos receptores de adenosina na manutenção da potencialidade de CT e no processo de neurogênese. Finalmente, relatos recentes mostram a existência de predisposição genética para doença de Parkinson e, assim, a ocorrência de alterações durante o desenvolvimento neural. Assim, células somáticas de pacientes com doença de Parkinson serão reprogramadas para células pluripotentes (iPS) com a intenção de estudar possíveis alterações na expressão dos sistemas cininérgico e purinérgico e os seus efeitos na modulação da diferenciação neural.

DNA aptamers interact with their target proteins with high selectivity, specificity and affinity. Iterative cycles of in vitro screening of a combinatorial oligonucleotide library for target binding (SELEX) followed by PCR amplification of selected sequences can be developed to target almost any protein. Due to the wide spectrum of applications, these novel molecules are used in numerous pharmacological, clinical and industrial processes. While the technique is yet emerging in Brazil, it is widely used for academic and industrial applications in most industrialized countries. The aim of the proposed Brazilian-German joint project is the application to exploit the SELEX technology in targeting organisms causing parasitic diseases including Plasmodium falciparum, Onchocerca volvolus and Trypanosoma cruzi. The evolved high-affinity DNA aptamers will be used for ligand-mediated target purification of parasite proteins. Inhibition assays will elucidate the effects of aptamer target protein binding. The importance of P. falciparum proteins, identified by aptamers in the erythrocyte cell membrane, will be further studied in protein trafficking and proliferation assays. Knock-out constructs of these proteins are foreseen to evaluate identified proteins on its viability for the parasite. In addition to creating scientific knowledge this project will active continuous exchange of scientists and students with the intention of creating a long-lasting research network. Moreover, since therapeutic applications are foreseen for most of the developed aptamers, these are intended to be commercialised within the translational framework of a ?Public Private Partnership?.

O objetivo deste projeto é desenvolver novas técnicas analíticas baseadas em aptâmeros para a utilização em oncologia. O câncer é uma das principais causas de morte no mundo sendo que 90% das mortes por esta patologia são causadas pelo aumento da metástase. Entre as várias hipóteses para a formação de metástase, a hipótese de células‐tronco cancerígenas (cancer stem cell ‐CSC) está ganhando reconhecimento e importância mundial. Supõe‐se que células tumorais circulantes (circulating tumour cells‐ CTCs‐ população de células pre‐/para‐metastáticas observadas no sangue ou outros líquidos intersticiais) são enriquecidas com CSC e portanto, por causa da sua resistência à terapias clássicas, podem ser as responsáveis pelas falhas terapêuticas e recidiva do tumor. O nível de CSC/CTC no soro é um potencial fator prognóstico da malignidade cancerígena. Desenvolvimento de novas sondas moleculares com alta seletividade e afinidade para detecção e monitoramento das CTC e/ou CSC nos permitirá usá‐las como indicador de prognóstico da recidiva da doença
e sobrevida dos pacientes. Além disso, o possível isolamento, caracterização e até mesmo a eliminação das CSC/CTC seria uma abordagem promissora para terapias anticâncer no futuro. As maiores limitações da tecnologia atual são: um sistema complexo com diversos equipamentos e uma metodologia que se baseia em diversas e diferentes abordagens para o pré‐processamento o que implica em altos custos em tempo de preparação e diluição de amostras ou concentrações e por fim uma confiança limitada em anticorpos para a detecção CTC final, o que pode subestimar o número de CSC/CTCs. Aqui nós propomos um detecção mais eficiente e unificada assim como a captura de CTCs usando a tecnologia de aptâmeros que explora a especificidade dos aptâmeros para distinguir CTCs de células normais em diversas amostras biológicas.

Células-tronco (CT) são células não especializadas com capacidade de auto-renovação que podem originar diferentes tipos celulares do organismo. Devido às suas características, nos últimos anos, as CT têm surgido como uma importante promessa terapêutica para diversas doenças. Além disso, CT de origem tumoral têm sido apontadas como responsáveis pela iniciação e crescimento de tumores, resistência às terapias clássicas e, consequentemente, pela recidiva da doença, sendo neste caso o principal alvo terapêutico. A estrutura básica de uma CT depende de sua constituição genética, porém a determinação de um fenótipo específico também depende do estímulo de fatores intrínsecos e extrínsecos aos quais essas células são expostas em seu microambiente. A diferenciação das CT está relacionada à atividade de inúmeros receptores intracelulares ou de membrana plasmática. O nosso laboratório tem estudado, durante os últimos anos, os papéis da bradicinina (BK) e de purinas na indução, progressão e determinação fenotípica na diferenciação neural de diferentes tipos de CT. Nossos resultados indicam a importância dos receptores purinérgicos P2X e P2Y, ativados por ATP, na proliferação e manutenção da pluripotência, bem como na diferenciação para neurônios e células gliais. Uma das descobertas principais do nosso grupo sobre o papel da BK foi a indução da neurogênese e bloqueio da proliferação em vários modelos de CT e também de seu efeito neuroprotetor, revertendo a morte celular. Baseado nesses dados, propomos neste projeto estudar a relação dos sistemas cininérgicos e purinérgicos em CT utilizadas como ferramentas terapêuticas e na pesquisa básica. Para isto, desenvolveremos aptâmeros de DNA, com o objetivo de obter um marcador específico de diferentes tipos de CT, tais como mesenquimais, tumorais e progenitores retinianos derivados do corpo ciliar de ratos. Estes aptâmeros possuem possíveis aplicações terapêuticas, na purificação de CT mesenquimais para utilização em terapia celular e, no caso das CT tumorais, valor diagnóstico quantitativo da sua presença em fluidos biológicos. Com a intenção de definir novos alvos terapêuticos e, visto o efeito anti-proliferativo da BK sobre células-tronco neurais (CTN) e células de carcinoma embrionário, estudaremos a expressão do sistema de cininas e a participação de seus receptores na progressão tumoral em células derivadas de tumores de pulmão e glioblastoma, caracterizados por alta malignidade. Avaliaremos ainda o efeito da BK e de seus análogos estáveis, assim como seus mecanismos sobre a neurogênese endógena em modelo pré-clínicos para a doença de Parkinson e a Epilepsia. O papel do sistema calicreína-cininas também será avaliado em progenitores retinianos derivados do corpo ciliar. Avaliaremos também os efeitos da inibição do receptor purinérgico P2X7, sabidamente envolvido em processos de neurodegeneração, em modelos animais de doença de Parkinson e de Epilepsia para possíveis aplicações terapêuticas. OBJETIVOS GERAIS: 1)	Aptâmeros para identificação de células-tronco mesenquimais e tumorais: A identificação e isolamento de células-tronco a partir de seus tecidos de origem de maneira eficaz, e a identificação de possíveis alvos moleculares suscetíveis a modulações que permitam a manutenção das características das CT e/ou o direcionamento da diferenciação para um determinado fenótipo celular desejado aumentará significativamente as possibilidades de aplicações terapêuticas destas células. Desta maneira, propomos neste projeto o desenvolvimento de aptâmeros de DNA que reconheçam o padrão de expressão de epítopos específicos (assinatura molecular) para um determinado tipo de CT. Assim, espera-se a identificação de novos biomarcadores que, por exemplo, permitam diferenciar entre CTM da medula óssea e do lipoaspirado, e detectar a presença de CSC circulantes ou na massa tumoral.

O sistema nervoso é formado por uma rede composta de trilhões de neurônios com diferentes fenótipos e outros tipos celulares de sustentação. A imensa variedade fenotípica de células no sistema nervoso é devida ao desenvolvimento diferencial de células-tronco e progenitoras que originam neurônios, astrócitos e oligodendrócitos. Esse processo de neurogênese é direcionado pela ativação de inúmeros receptores das células em diferenciação. A participação de receptores de de neuropeptídeos e neurotransmissores, tais como o receptor B2 de cininas, purinérgicos e colinérgicos, foi estudada e caracterizada por este laboratório durante a diferenciação neuronal no modelo de células P19 de carcinoma embrionário. Com base nos dados obtidos, propomos o estudo da participação destes receptores na diferenciação neural de células-tronco embrionários, de células mesenquimais do tecido adiposo humano e de rato assim como o processo de maturação de neurônios funcionais a partir de células progenitoras neurais de rato (neuroesferas). Para tal, serão desenvolvidos aptâmeros de DNA usando a técnica SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) a partir de uma biblioteca combinatória de DNA com capacidade de ligação específica às células-tronco. Posteriormente, essas moléculas serão utilizadas para a purificação destas células a partir do tecido adiposo. A segunda etapa do projeto envolve a aplicação de células-tronco mesenquimais e progenitoras neurais purificadas in vivo em lesões de nervo periférico ciático de ratos a fim de elucidar o potencial terapêutico destes modelos. Além disso, será avaliada a capacidade das células-tronco e progenitoras originarem processos regenerativos no sistema nervoso periférico

Ed 17/2008 Terapia Celular FII 573476/2008-0 
BASES MOLECULARES DA DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO E PROGENITORAS NEURAIS NA TERAPIA CELULAR 
O sistema nervoso é formado por uma rede composta de trilhões de neurônios com diferentes fenótipos e outros tipos celulares de sustentação. A imensa variedade fenotípica de células no sistema nervoso é devida ao desenvolvimento diferencial de células-tronco e progenitoras que originam neurônios, astrócitos e oligodendrócitos. Esse processo de neurogênese é direcionado pela ativação de inúmeros receptores das células em diferenciação. A participação de receptores de de neuropeptídeos e neurotransmissores, tais como o receptor B2 de cininas, purinérgicos e colinérgicos, foi estudada e caracterizada por este laboratório durante a diferenciação neuronal no modelo de células P19 de carcinoma embrionário. Com base nos dados obtidos, propomos o estudo da participação destes receptores na diferenciação neural de células-tronco embrionários, de células mesenquimais do tecido adiposo humano e de rato assim como o processo de maturação de neurônios funcionais a partir de células progenitoras neurais de rato (neuroesferas). Para tal, serão desenvolvidos aptâmeros de DNA usando a técnica SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) a partir de uma biblioteca combinatória de DNA com capacidade de ligação específica às células-tronco. Posteriormente, essas moléculas serão utilizadas para a purificação destas células a partir do tecido adiposo. A segunda etapa do projeto envolve a aplicação de células-tronco mesenquimais e progenitoras neurais purificadas in vivo em lesões de nervo periférico ciático de ratos a fim de elucidar o potencial terapêutico destes modelos. Além disso, será avaliada a capacidade das células-tronco e progenitoras originarem processos regenerativos no sistema nervoso periférico.

Durante muito tempo o homem vem buscando o tratamento de doenças que o aflige junto às substâncias naturais. Estudos realizados com o veneno das serpentes evidenciam que muitas das suas proteínas constituintes são precursoras de peptídeos sinalizadores, natriuréticos e fatores de crescimento cujos receptores foram altamente conservados durante a evolução e controlam atividades metabólicas, nervosas, circulatórias e de defesa imune. Nesse contexto, vários trabalhos sugerem um efeito anti-hipertensivo para os peptídeos ricos em prolina (BPP) presentes nas glândulas de veneno e no sistema nervoso central da Bothrops jararaca devido à inibição de dois peptídeos envolvidos com a regulação humoral da homeostase cardio-respiratória: angiotensina I e bradicinina. Entretanto, estudos em nosso laboratório apontam para o fato de que esses oligopeptídeos (Bj-PROs) estariam atuando sobre outros processos responsáveis pela regulação da vaso-dilatação, que não aqueles fundamentados na inibição da enzima conversora da angiotensina ou potenciação da bradicinina. 
O cDNA que codifica o precursor de Bj-PROs, tanto da glândula de veneno como do cérebro, apresenta sete seqüências de Bj-PROs e uma seqüência do peptídeo natriurético tipo C (CNP). O CNP é um neuropeptídeo envolvido na regulação arterial e na concentração de eletrólitos do sangue e, ao ser codificado no mesmo precursor dos Bj-PROs, sugere que estes últimos poderiam também estar atuando como neuropeptídeos. 
	As toxinas têm sido investigadas como possíveis agentes terapêuticos após o estudo de seus mecanismos de ação nas células e organismos. Nesse contexto, pouco se sabe sobre a ação dos BPPs em canais iônicos. Existem evidências de trabalhos prévios em nosso grupo sugerindo que pelo menos um desses oligopeptídeos, o BPP-7a, tem ação natriurética por mecanismo ainda não esclarecido em ratos hipertensos. Desta forma, o presente trabalho objetiva avaliar não somente a ação biológica como fisiológica do BPP-7a sobre a cinéti

Financiado pela FAPESP (Centro Emergente 01/08827-4) e CNPq

Concluímos quais dos receptores purinérgicos estão envolvidos nas fases precoces e tardias da diferenciação neuronal. A partir de estudos farmacológicos utilizando um conjunto de agonistas e antagonistas de receptores purinérgicos os quais possuem atividade variável de acordo com o subtipo de receptores P2Y (P2YR) ou P2X (P2XR). Foi possível averiguar que os P2Y1R, P2Y2R e P2X4R (com menor participação) estão envolvidos na indução da proliferação de células P19 indiferenciadas. Aptâmeros com atividade inibitória específica de receptores P2X4 afetaram a formação de corpos embriônicos, que são necessários para a diferenciação tardia. Em uma concentração de 200 nM de aptâmeros não houve formação de corpos embriônicos. Estes ensaios mostram a importância do P2X4R para o início da diferenciação de células P19. A participação de P2X4R em estágios iniciais da diferenciação de células P19 foi também observada utilizando siRNAs para subregular a expressão gênica destes receptores. Além disso, mostramos que os siRNAs agem de forma específica sobre a expressão de receptores em células PC12 e inibiram o crescimento de neuritos estimulado por NGF. P2Y2R e P2X2R participam do desenvolvimento de sinapses com receptores funcionais de acetilcolina. Identificamos um splicing alternativo do P2X6R que está presente durante a diferenciação neuronal de células P19 e também durante o desenvolvimento pós-natal de camundongos (da Silva et al., 2007). Referente ao estudo do sistema calicreína-cinina durante a diferenciação neuronal foi observada a expressão regulada das enzimas do metabolismo de bradicinina como a enzima conversora de angiotensina e carboxipeptidase M, além de NO sintases. Sugerimos que a arginina serve de substrato para síntese de NO, que é obtido pela clivagem da bradicinina pelas carboxipeptidases M ou N.