Luciana Oliveira de Almeida.

O carcinoma oral é responsável por muitas mortes ao redor do mundo e apresenta grande capacidade de desenvolver recidivas e metástases devido as falhas na terapia associadas com a quimiorresistência. Os tratamentos convencionais como radio e quimioterapia são capazes de destruir as células diferenciadas do tumor, porém uma pequena população chamada de células-tronco tumorais se mantém intacta e repovoa o tumor. Muitas vias são encontradas desreguladas nas células-tronco tumorais, e a via de sinalização de Wnt/-catenina está relacionada com a manutenção, sobrevivência, auto-renovação e diferenciação das células-tronco tumorais, além de estar relacionada com a iniciação de vários tumores. Em tumores de cabeça e pescoço, a atividade aumentada da via de Wnt/-catenina está associada à mudanças epigenéticas que mantém à estrutura da cromatina aberta, induzindo a ativação de genes que levam ao acúmulo de células-tronco tumorais. Por outro lado, enzimas envolvidas na regulação epigenética podem também inibir a sinalização de Wnt/-catenina através da condensação da cromatina que leva à repressão gênica. Dessa forma, tentar elucidar os mecanismos que contribuem para o controle da transcrição de genes-alvo de WNT pode ter importantes implicações no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a efetiva eliminação das células-tronco tumorais. Este projeto buscará identificar alterações epigenéticas envolvidas na via de sinalização de Wnt/-catenina e de seus alvos e investigar a participação desta via no acúmulo de células-tronco tumorais e na quimiorresistência de linhagens celulares de carcinoma oral.

O câncer de cabeça e pescoço é o sexto tipo de câncer mais comum em todo o mundo, envolvendo um grupo heterogêneo de tumores que surgem da mucosa do lábio, cavidade oral, orofaringe, hipofaringe, laringe, trato sino-nasal e nasofaringe. Esses tumores são classificados em sua maioria como carcinomas espinocelulares. Esses tumores, que compreendem 90% dos casos de câncer de cabeça e pescoço, apresentam altas taxas de recorrência e metástase, além de elevada resistência à quimioterapia. Devido a ineficiência das estratégias de tratamento, esses tumores apresentam as menores taxas de sobrevida em 5 anos quando comparados a qualquer câncer de grande porte. A quimiorresistência pode ser adquirida ou intrínseca. A resistência adquirida é um problema importante para a clínica, pois os tumores não apenas se tornam resistentes aos agentes originalmente usados para tratá-los, mas também podem se tornar resistentes a outros compostos com diferentes mecanismos de ação. Enquanto a resistência intrínseca à droga existe antes de qualquer tratamento, a resistência adquirida ocorre após a terapia inicial. A cisplatina é o agente quimioterápico mais utilizado para o tratamento dos tumores de cabeça e pescoço, e durante o desenvolvimento da resistência à cisplatina, além de mutações gênicas, numerosas modificações epigenéticas podem ocorrer, refletindo a ativação de vias de sinalização que protegem as células contra danos e morte. Sendo assim, o objetivo deste projeto é caracterizar modificações epigenéticas que possam estar associadas ao processo de resistência intrínseca e adquirida ao quimioterápico cisplatina e seus possíveis efeitos sob as características morfológicas e a transição epitélio-mesênquima em linhagens celulares de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço.

NFkB é um fator de transcrição cuja via de sinalização está intimamente envolvida na resposta imunológica e inflamatória. NFkB e seus genes-alvo estão acumulados em diversos tumores hematológicos e sólidos, incluindo carcinoma de cabeça e pescoço. A ativação de NFkB promove sobrevivência celular e aumento do potencial proliferativo, inibe apoptose e ativa processos de invasão e formação de metástases. A atividade aumentada de NFkB, compatível com seu acúmulo nuclear também está associada com o desenvolvimento de resistência à cisplatina em tumores de cabeça e pescoço. A resistência à drogas antitumorais representa um importante problema para a eficiência da quimioterapia e a desregulação de várias vias de sinalização gênicas, como NFkB, controlam a resistência das células tumorais. Recentemente, a quimiorresistência tem sido associada à uma população específica de células tumorais com características semelhantes às células-tronco. As células-tronco do câncer estão frequentemente em um estado quiescente, que as previne contra o efeito da maioria dos tratamentos contra o câncer, os quais demonstram eficiência apenas sobre células em divisão. As células-tronco do câncer também possuem capacidade de auto-renovação e diferenciação, que levam à recidivas e formação de metástases após a quimioterapia. Assim, a caracterização de vias de sinalização envolvidas no processo de acúmulo da população de células-tronco do câncer frente à resistência ao tratamento podem contribuir para o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas que previnem a quimiorresistência.

A quimiorresistência é uma das principais causas de falhas na terapia contra o câncer, intensificando o risco da formação de metástases. A quimiorresistência é iniciada por um pequeno grupo de células identificadas como células-tronco tumorais. No carcinoma oral, a população de células-tronco tumorais é acumulada após a quimioterapia, e modificações epigenéticas podem estar controlando esse processo. A HDAC6 é uma histona desacetilase encontrada acumulada em células-tronco tumorais. As HDACs são um grupo de enzimas desacetilases que regulam epigeneticamente a organização da cromatina e a expressão gênica através da remoção de grupos acetila dos resíduos de lisina em histonas e proteínas não-histonas. A HDAC6 atua em vários processos fisiológicos, incluindo resposta ao estresse oxidativo, autofagia e resposta ao dano no DNA, e seu acúmulo está associado ao desenvolvimento de vários distúrbios patológicos, como o câncer. Para estabelecer estratégias terapêuticas mais eficientes no tratamento do câncer é importante compreender os fatores epigenéticos que promovem a quimiorresistência, assim como, explorar o comportamento das células-tronco tumorais e a sinalização que regula seu metabolismo. Este projeto tem como objetivo investigar o papel da HDAC6 no processo de quimiorresistência mediado pelas células-tronco tumorais no carcinoma oral; avaliar a influência da HDAC6 na resposta aos danos do DNA e estresse oxidativo e uma possível aplicação desta proteína como potencial alvo terapêutico para eliminar células-tronco tumorais e reverter quimiorresistência.

A quimiorresistência é um dos principais problemas de falha das terapias empregadas no tratamento do câncer, elevando a recorrência e o aparecimento de metástases. Propõe-se que a quimiorresistência seja controlada por uma pequena população de células identificadas como células-tronco do câncer. Em tumores de cabeça e pescoço, as células-tronco do câncer aumentam após administração do quimioterápico e alterações epigenéticas parecem controlar este evento. A via de NFkB tem sido associada com o fenótipo de quimiorresistência e sua participação na regulação epigenética pode sugerir seu envolvimento na modulação das células-tronco do câncer. Desta forma, entender os mecanismos epigenéticos que causam a resistência, explorando o comportamento das células-tronco do câncer e a sinalização que regula sua renovação e diferenciação, podem possibilitar a modulação epigenética das células-tronco do câncer como uma abordagem terapêutica. Nossa proposta tem como objetivo: (i) identificar alterações epigenéticas que contribuem para o fenótipo de quimiorresistência das células-tronco do câncer; (ii) explorar o envolvimento de NFkB na sinalização celular associada as células-tronco do câncer; (iii) selecionar e caracterizar o papel de alguns dos genes alterados epigeneticamente sobre as células-tronco em tumores quimiorresistentes; (iv) buscar por estratégias terapêuticas eficientes para a eliminação das células-tronco tumorais. Serão utilizadas como estratégias: estabelecimento de linhagens tumorais resistentes à cisplatina; isolamento das células-tronco do câncer por citometria de fluxo; identificação de genes epigeneticamente regulados por ATAC-seq, ChIP e MSP; screening de drogas e estudos in vivo usando modelos de xenoenxerto. Os resultados irão contribuir para um melhor entendimento sobre a sinalização epigenética que leva ao aumento de células-tronco quimiorresistentes e identificar drogas mais eficientes para eliminar as células-tronco do câncer.

A resistência adquirida sobre agentes quimioterápicos é um importante problema no tratamento do câncer. Estima-se que 7,5 milhões de pacientes com câncer morrem a cada ano devido a falhas na terapia provocada pela resistência adquirida ao tratamento. A cisplatina é o agente utilizado com maior frequência no tratamento do câncer, incluindo o carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CEC), contudo, alguns tipos de tumor desenvolvem resistência à droga. Essas neoplasias respondem no inicio do tratamento (até 70% das células morrem), porém, a taxa de morte celular diminui para 15-20% com o passar do tempo. Em relação ao CEC, pouca evolução nas condições do paciente têm sido observadas nas últimas 3 décadas. Menos de 50% dos pacientes sobrevivem além dos 5 anos após diagnóstico. A alta taxa de mortalidade é devida à recorrência e ao aparecimento de metástases e esses fatores estão associados a uma resposta desfavorável aos tratamentos empregados. A base molecular da resistência adquirida nesses tumores permanece amplamente desconhecida, mas propõe-se que a quimiorresistência seja controlada por uma pequena população de células identificadas como células-tronco do câncer. Vários estudos têm demonstrado que as células-tronco do câncer podem ser enriquecidas após quimio e radioterapia, então, fazer uso dessa estratégia pode auxiliar na identificação da sinalização celular das células-tronco do câncer que estão resistindo ao tratamento. Sendo assim, este projeto tem como objetivo estabelecer e caracterizar alterações fenotípicas e biológicas em linhagens de CEC quimiorresistentes após tratamento prolongado com cisplatina, na tentativa de entender os mecanismos envolvidos na resistência à terapia para possibilitar o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento visando melhorar a sobrevida dos pacientes.

Carcinomas de cabeça e pescoço são tumores sólidos com conteúdo heterogêneo. Dentro do tumor nem todas as células possuem a capacidade de auto-renovação e crescimento ilimitado. Na arquitetura tumoral, é amplamente aceito que as células-tronco do câncer são fundamentais para o crescimento tumoral, enquanto que as células diferenciadas apenas contribuem para a massa tumoral. Existem duas hipóteses que tentam explicar a formação das células-tronco do câncer: (1) através da transformação maligna de células-tronco normais ou células-progenitoras em células-tronco tumorais. Esse processo ocorre através de múltiplas mutações gênicas que levam a instabilidade genômica, contribuindo para a malignização celular; (2) as células tumorais diferenciadas adquirem progressivamente propriedades de células-tronco através da reversão ontogênica ou desdiferenciação, que induzem à plasticidade celular determinada principalmente por modificações epigenéticas e ativação de oncogenes. Contudo, o mecanismo exato pelo qual as células-tronco do câncer são originadas ou acumuladas após quimioterapia ainda não está completamente elucidado. O objetivo desse projeto será identificar e caracterizar o mecanismo pelo qual as células-tronco tumorais são acumuladas após a administração do agente quimioterápico Cisplatina e identificar vias de sinalização que possam estar envolvidas no processo. Caracterizar o mecanismo pelo qual as células- tronco tumorais são acumuladas após a quimioterapia adicionará novos conhecimentos em torno das células-tronco tumorais que poderão contribuir para a criação de novas estratégias terapêuticas que sejam mais eficientes para erradicar o carcinoma de cabeça e pescoço.

Apesar do grande avanço no tratamento de alguns tipos de câncer, a busca por novos alvos terapêuticos e estratégias de terapia antitumoral para contornar a metástase, recidiva e resistencia a terapia, é necessária. A presente proposta temática tem por objetivo definir o papel da proteína SET na via de sinalização dos esfingolipídios, assim como o papel destes, em carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (CECP). Inúmeras abordagens experimentais serão utilizadas tanto in vitro quanto in vivo. Nós realizaremos estudos em linhagens celulares humanas (derivadas de tumor e não tumor), amostras de tumores, e soro de pacientes com câncer. Diferentes métodos serão utilizados para atingir o objetivo proposto, tais como (i) análise de esfingolipídios por espectrometria de massas, (ii) modificações pós-traducionais de proteínas por Western blot, (iii) distribuição celular de proteínas por imunohistoquimica, imunofluorescência ou Western blotting (fracionamento subcelular), (iv) quantificação de RNA e miRNAs por PCR em tempo real, (v) sequenciamento de DNA, (vi) RNA de interferência usando tanto siRNA quanto shRNA, (vii) expressão ectópica em linhagens celulares usando vetores com os cDNAs de interesse, (viii) análises por citometria de fluxo para ciclo celular e identificação de tipos celulares usando anticorpos, (ix) ensaios de angiogênese com células HUVEC, e (x) ensaios de viabilidade celular, invasão e clonogênico. Estes estudos, além da formação de tumores em camundongos nude usando modelo de xenoenxerto de linhagens tumorais humanas e linhagens de carcinoma murino para modelo singênico, poderão tanto ampliar o conhecimento sobre a sinalização por esfingolipídios em câncer de cabeça e pescoço, quanto levar a novos mecanismos/abordagens terapêuticas para o câncer.