Carla Columbano Oliveira.

Projeto temático FAPESP
Este é um projeto muito abrangente e envolve o estudo de diferentes complexos enzimáticos que participam do controle pós-transcricional de expressão gênica. Dada a conservação evolutiva destes processos em eucariotos, os resultados poderão ser depois extrapolados para humanos, nos quais doenças já foram identificadas como sendo causadas por mutações nos genes das ortólogas estudadas por nós. Serão utilizadas várias abordagens no estudo, utilizando métodos de bioquímica, biologia molecular, biologia celular, biologia estrutural e microscopia confocal de alta resolução.

Projeto Temático - FAPESP
A regulação dos processos pós-transcricionais tem seu papel no controle de expressão gênica cada vez mais evidente. A identificação dos fatores envolvidos nessas vias e o estudo de interações RNA-proteínas tornam-se, assim, essenciais para a elucidação dos processos de síntese, maturação e degradação de RNA. A vantagem de se utilizar levedura nesse estudo advém principalmente da possibilidade de manipulação genética de Saccharomyces cerevisiae, associada à possibilidade de se trabalhar com um organismo eucarioto que tem seu genoma completamente seqüenciado, o que torna a clonagem e a identificação de genes isolados muito mais eficientes. S. cerevisiae também apresenta vantagens para a análise bioquímica dos mecanismos de regulação, através de ensaios in vitro. As semelhanças já identificadas desses processos pós-transcricionais em levedura e mamíferos podem levar a um melhor entendimento dos mecanismos de controle de expressão gênica em eucariotos em geral.

Edital Universal CNPq (479779/2010-4)

Projeto Temático dentro da chamada SMOLBNet2.0.
Exossomo está presente em todos organismos desde archaea a eucariotos e participa do processamento e degradação de todos os tipos de RNA em eucariotos, desempenhando um importante papel no controle de expressão gênica. A estrutura do complexo de archaea já foi determinada, assim como de subcomplexos de humanos. Entretanto, a regulação da atividade do exossomo ainda não é bem conhecida. Em nosso laboratório, identificamos proteínas ativadoras (Nop53p) e inibidoras (aNip7), que ligam RNA, interagem com o exossomo e controlam sua atividade. A determinação das mudanças conformacionais causadas por proteínas que interagem com o exossomo será de extrema importância para o entendimento da regulação do complexo. Como o exossomo participa da maturação de rRNA no núcleo, degradando parcialmente pre-rRNAs e liberando rRNAs maduros, e atua na degradação completa de mRNAs citoplasmáticos, a caracterização de fatores que controlam sua atividade terá um importante papel no estudo de controle pós-transcricional de expressão gênica.

Auxílio à Pesquisa
Através de estudos anteriores em nosso laboratório, identificamos e caracterizamos as funções de várias novas proteínas de Saccharomyces cerevisiae envolvidas em diferentes etapas de processamento de RNA, dentre elas, Nop17 e Cwc24, que conectam splicing e processamento de pré-rRNAs . Nop17 participa da montagem de um grupo específico de complexos de ribonucleoproteínas, os snoRNPs de box C/D (responsáveis por metilações de ribose nos rRNAs) . Através de sua interação com Nop17, Cwc24 deve ser recrutada co-transcricionalmente para os pré-snoRNAs de box C/D que contêm introns, e participa do splicing desses RNAs. Neste projeto, pretendemos continuar os estudos de caracterização funcional de Nop17 e de Cwc24 e determinar seus papéis em splicing de snoRNAs e de montagem de complexos de snoRNPs. Essas duas proteínas são conservadas entre levedura e humanos, e pretendemos também estender esses estudos para as ortólogas humanas, hNop17 e ZNF183.

Em eucariotos, todos os tipos de RNA são processados durante sua maturação e a eficiência dessas etapas tem um efeito direto no controle de expressão gênica. Os mRNAs sofrem a adição do cap na extremidade 5?, splicing e poliadenilação antes de seu transporte para o citoplasma, onde poderão ser traduzidos e finalmente degradados. Os snRNAs (que atuam em splicing), os tRNAs (tradução) e snoRNAs (processamento de rRNA) também passam por várias etapas de processamento. Estudos recentes têm demonstrado a importância de RNAs não codificantes no controle de meia-vida de mRNAs, como nas vias de RNAi (RNA de interferência), com efeito direto na regulação da expressão gênica. Os rRNAs (RNA ribossomais) também passam por várias etapas de maturação em eucariotos. Três dos rRNAs são transcritos como um precursor único, de 35S/45S (leveduras/mamíferos), que depois de processamento origina os rRNAs de 18S, 5,8S e 25S/28S, que, junto com o rRNA 5S, formarão as subunidades ribossomais maduras de 40S e 60S. 
Todas essas etapas envolvem interações específicas proteína-proteína e RNA-proteínas que vão determinar a eficiência e o tempo de tradução dos mRNAs, e portanto, são essenciais para o controle de expressão gênica. Da biogênese de ribossomos participam os rRNAs, proteínas ribossomais, snoRNPs e vários outros fatores (em um número estimado em 180 fatores em levedura). Em nosso laboratório, realizamos vários estudos de interação entre proteínas com o objetivo de identificar novos fatores envolvidos em processamento de rRNA. Esses estudos nos levaram à identificação de novas proteínas de Saccharomyces cerevisiae e à caracterização de suas funções: Nop17p interage com a subunidade do exossomo Rrp43p (Oliveira et al., 2002) e participa das etapas iniciais de processamento de rRNA de metilação de riboses em sítios específicos nos rRNAs (Gonzales et al., 2005). Nop53p interage com Nop17p e está envolvida nas etapas mais tardias de processamento de rRNA, possivelm

Em eucariotos, todos os tipos de RNA passam por várias etapas de processamento para sua maturação e a eficiência com a qual essas etapas são cumpridas tem um efeito direto no controle de expressão gênica. Os mRNAs sofrem a adição do cap na extremidade 5?, splicing, poliadenilação antes de seu transporte para o citoplasma, onde poderá ser traduzido e finalmente degradado. Os snRNAs (que atuam em splicing), os tRNAs (tradução) e snoRNAs (participam do processamento de rRNA) também passam por várias etapas de processamento. Estudos recentes têm demonstrado a importância de RNAs não codificantes no controle de meia-vida de mRNAs, como nas vias de iRNA (RNA de interferência), com efeito direto na regulação da expressão gênica. Os rRNAs (RNA ribossomais) também passam por várias etapas de maturação em eucariotos. Três dos rRNAs são transcritos como um precursor único, de 35S/45S (leveduras/mamíferos), que depois de processamento origina os rRNAs de 18S, 5,8S e 25S/28S, que, junto com o rRNA 5S, formarão as subunidades ribossomais maduras de 40S e 60S. 
Todas essas etapas envolvem interações específicas proteína-proteína e RNA-proteínas que vão determinar a eficiência e o tempo de tradução dos mRNAs, e portanto, são essenciais para o controle de expressão gênica. Da biogênese de ribossomos participam os rRNAs, proteínas ribossomais, snoRNAs e vários outros fatores (em um número estimado em 150 proteínas em levedura). Em nosso laboratório, realizamos várias seleções com o sistema do duplo-híbrido para identificar proteínas envolvidas em diferentes etapas do processamento de rRNA. Esses estudos nos levaram à identificação de novas proteínas de Saccharomyces cerevisiae e à caracterização de suas funções. Nop17p interage com a subunidade do exossomo Rrp43p (Oliveira et al., 2002) e participa das etapas iniciais de processamento de rRNA de metilação de riboses em sítios específicos nos rRNAs (Gonzales et al., 2005). Nop53p interage com Nop17p e está envolvida nas etapas mais

Em eucariotos, três dos rRNAs são transcritos pela RNApol I no nucléolo como um precursor único, de 35S/45S (leveduras/mamíferos), que é processado, originando os rRNAs de 18S, 5,8S e 25S/28S, que formarão as subunidades ribossomais maduras. Todas essas etapas envolvem interações RNA-RNA e RNA-proteínas específicas que vão determinar a eficiência e o tempo de tradução dos mRNAs, e portanto, são determinantes para o controle de expressão gênica. Alguns dos fatores protéicos envolvidos nesses processos já foram identificados na levedura Saccharomyces cerevisiae e em outros eucariotos. Neste projeto, iniciamos a caracterização funcional das novas proteínas que interagem com Nop17p em S. cerevisiae e de seu papel no metabolismo de RNA.
Os resultados obtiddos neste trabalho levaram a caracterização funcional da proteína codificada pelo gene YPL146C, agora denominada Nop53p. Nop53p participa da via de processamento dos rRNAs 5.8S e 25S, liga-se especificamente ao rRNA 5.8S e regula a função do exossomo. Iniciamos também experimentos para a caracterização funcional de outras proteínas que interagem com Nop17p e obtivemos dados que indicam que a proteína codificada pelo gene YLR323C também esteja envolvida em processamento de rRNA.

Auxílio à Pesquisa

Projeto Temático - FAPESP
A principal linha de pesquisa em nosso laboratório visa o estudo do controle pós-transcricional de expressão gênica, concentrando-se na caracterização da função de algumas proteínas envolvidas em processamento e degradação de RNAs. Este trabalho tem como objetivo principal o estudo da estrutura de algumas dessas proteínas. Foram escolhidas como alvos proteínas de Archea homólogas às subunidades do exossomo e outras proteínas possivelmente associadas a processamento de RNA. Neste projeto visamos a definição de um modelo do complexo do exossomo em Archea a partir de dados de SAXS. Visamos também a caracterização funcional dessas proteínas.

Auxílio à Pesquisa